3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
3.2.2. Tạo kháng nguyên Fcγ người
a. Thủy phân IgG bằng papain Tiến hành theo quy trình [11]
- 25mL dd IgGngười, nồng độ protein 15mg/mL (trong dd đệm Natri phosphate 0,1M, pH 7, NaN3 0,05% ).
- Cân 0,303 g Cysteine để đạt nồng độ 0,01M
- Thờm 250àl Na2EDTA 0,2M để đạt nồng độ cuối là 2mM
- Tiến trộn đều dung dịch, làm ấm dung dịch IgGngười ở 37°C. Sau đó thêm 197,5àl dd papain với tỉ lệ [Papain : Protein] là [1:100].
- Ủ dung dịch tại 37°C, trong 4h
- Tiếp theo, cộng thêm Iodoacetamide đạt đến nồng độ 0,1mg/mL
- Dung dịch cuối cùng được thẩm tích trong dung dịch đệm Natri phosphate 0,1M 0,05% NaN3, pH 7. Giữ dung dịch sau thủy phân tại 4oC đến khi tiến hành tiếp phương pháp tinh sạch bằng SKAL−protein A và điện di.
b. Tinh sạch Fcγ bằng phương pháp SKAL gel Agarose−protein A
Protein A là một thành phần màng tế bào của một số chủng Staphylococus aureus (tụ cầu vàng). Protein A có khả năng liên kết vùng giữa các khu vực CH2, CH3 thuộc phần Fcγ.
Sau đây là Bảng 3.2 cho thấy sự liên kết phân tử protein A với các Ig khác trong cơ thể người và thỏ.
Bảng 3.2: Tương tác giữa các phân tử Ig đối với protein A Kháng thể Protein A
IgG1 của người +++
IgG2 của người +++
IgG3 của người - IgG4 của người +++
IgM của người +/- IgA1 của người - IgA2 của người +/- IgD của người - IgE của người
IgG thỏ +++
+++ : Liên kết mạnh + : Liên kết yếu
− : Không liên kết
(Trích từ: bảng so sánh sự liên kết protein A và protein G với các kháng thể IgG của các loài – Sách thực hành hóa sinh miễn dịch, Đỗ Ngọc Liên)
Như bảng trên chúng ta thấy Protein A gắn mạnh ở phân lớp IgG nói chung (trừ IgG3) hay đó chính là Fcγ.
Tiến hành
- Cột Agarose − Protein A (Biorad), có dung tích 5mL, tốc độ dòng 1mL/phút.
- Cân bằng cột bằng 25mL dung dịch đệm gắn (Phosphate natri 0,02M; NaN3
0,05%, pH 7,4).
- Cho 5,8mL IgGngười thủy phân tại Mục 3.2.2(a), có nồng độ 15mg/mL (đã thẩm tích trong dung dịch đệm gắn). Sau đó rửa cột 50mL với đệm gắn để loại bỏ protein không mong muốn, đồng thời đo A280 nước rửa đến khi bằng đường nền.
- Ly giải Fcγngười bằng 25mL dung dịch đệm rửa giải (Acid acetic 1M, pH 3,0), tốc độ 1mL/phút. Trung hòa ngay dung dịch sau khi rửa giải bằng dung dịch đệm 1M Tris–HCl, với pH 9.
Lượng Fcγ thu nhận được đo A280 để xác định nồng độ và tiến hành điện di SDS-PAGE 12% kiểm tra độ tinh sạch của Fcγ.
c. Phân tích bằng điện di SDS–PAGE 12%
SDS−PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0,1àg protein đó cho vạch rất rừ khi nhuộm với Coomassie blue. Đây là ưu điểm nên hiện nay SDS–PAGE 12% thường được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của protein.
Các mẫu trước khi chạy điện di trên gel SDS–PAGE cần phải đun sôi 5 phút trong đệm xử lý mẫu. SDS phá hủy cấu trúc bậc 4 và bậc 3 và phần nào bậc 2 của phân tử protein khi đun nóng mẫu ở 90oC trong 5 phút. β–MeSH (hoặc DTT) phá hủy các liên kết đồng trị −S−S− (disulfide) trong phân tử protein.
Sau khi xử lý các protein có cấu trúc sẽ tổ chức lại tạo phức hợp protein−SDS mang điện tích âm liên kết dọc theo chuỗi polypeptide.
Đối với điện di kháng thể, phân tử IgG có trọng lượng 150 kDa gồm có hai chuỗi nặng và nhẹ, liên kết với nhau qua cầu nối −S−S−. Khi chỉ xử lý với SDS thì chúng ta được một vạch tại nơi có trọng lượng 150 kDa, nhưng khi xử lý bằng β−MeSH + SDS ta thu được hai vạch trên gel, một vạch ứng với trọng lượng 50 kDa (đó là chuỗi nặng), một vạch ứng trọng lượng phân tử 23~25 kDa (đó là chuỗi
nhẹ). Đối với Fcγ khi xử lý với SDS ta được một phân tử có trọng lượng ~50 kDa (tương ứng một vạch), nhưng khi xử lý Fcγ + β-MeSH + SDS ta được phân tử có trọng lượng 23~25 kDa. Trong đó, gồm một phần của chuỗi H và chuỗi L còn nguyên.
Tiến hành
- Mẫu gồm: Œ Mẫu IgG tủa bằng 45% S A.S
• Mẫu IgG thủy phân papain
w Mẫu phân đoạn 2 (bám trên cột Agarose-protein A)
- Đổ gel phân tách có nồng độ Acrylamide 12% - SDS, chờ 20phút để gel đông.
- Đặt lược vào, để tạo hình giếng, đổ dung dịch gel gom 4%, chờ 10phút lấy lược ra và lắp gel vào bình điện di. Cho dung dịch đệm vào bình điện di.
- Cho mẫu đã xử lý vào 6 giếng, trong đó 3 giếng đầu chỉ xử lý với SDS, 3 giếng sau xử lý SDS + β-MeSH. Nạp 10àl/giếng, tiến hành điện di với hiệu điện thế 90V và cường độ dòng điện 2mA/giếng trong thời gian 2 giờ 30 phút.
- Kết thúc điện di, chuyển gel vào dung dịch nhuộm và ngâm 30 phút.
- Sau đó, cho gel vào dung dịch tẩy, ngâm đến khi cho gel có nền trong suốt, không màu.