3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
3.2.3. Tạo kháng huyết thanh trên thỏ
a. Gây đáp ứng miễn nhiễm trên thỏ
Ba con thỏ sau 6 tháng tuổi được đưa về phòng chăn nuôi gia súc thí nghiệm viện Pasteur, để được nuôi trong điều kiện tăng trưởng và vệ sinh cần thiết. Đến
gần một năm tuổi, 3 con thỏ đều đạt trên 2kg trở lên và được đưa vào sử dụng cho nghiên cứu.
Lấy 2mL máu thỏ trước khi gây mẫn cảm. Tách huyết thanh và bảo quản tại 4oC, với 0,05% NaN3.
Gây mẫn cảm
- 100 μg Fcγ pha trong 0,5 mL nước muối sinh lý vô khuẩn NaCl 0,9%.
Nhũ tương hóa hỗn hợp với 0,5 mL Freund Complete Adjuvant (FCA).
- Trộn thành huyền dịch nước trong dầu, kiểm tra sự hình thành huyền dịch bằng cách cho một giọt rơi trên mặt nước cất sẽ không thấy lan rộng.
- Tiêm huyền dịch vào nội bì thành 4 hàng, hai hàng bên phải và hai hàng bên trái dọc theo cột sống trên lưng con vật, mỗi hàng khoảng 10 mũi (20àl/mũi) và một mũi trong cơ đựi, phớa trong gần hỏng của chõn sau. Chân bên kia tiêm thêm một mũi B.pertussis (~108 tế bào trong 0,5mL nước muối sinh lý)
Tiêm tăng cường
- Tiêm tăng cường lần 1: 100μg Fcγ trong 0,5mL nước muối sinh lý NaCl 0,9% (vô khuẩn). 0,5mL tá chất Freund không toàn phần (Freund Incomplete Adjuvant, FIA, không có M.tuberculosis). Trộn thành huyền dịch nước trong dầu, tiêm đều trên lưng như trước. 12 ngày sau lần tiêm tăng cường lần 1, lấy 2mL máu tai của con vật và tách huyết thanh như trước. Thực hiện kiểm tra sự hiện diện của KT đặc hiệu bằng phương pháp khuếch tán kép (Ouchterlony).
- Tiờm tăng cường lần 2: 50àg trong 0,5mL dd NaCl 0,9% (vụ khuẩn).
0,5mL tá chất Freund không toàn phần (FIA). Thực hiện tương tự như lần tăng cường 1.
- Tiờm tăng cường lần 3: 25àg trong 0,5mL dd NaCl 0,9% (vụ khuẩn).
0,5mL tá chất Freund không toàn phần (FIA). Thực hiện tương tự như lần tăng cường 1.
- Tiờm tăng cường lần 4 và lần 5: 20àg trong 0,5mL dd NaCl 0,9% (vụ khuẩn). 0,5mL tá chất Freund không toàn phần (FIA). Thực hiện tương tự như lần tăng cường 1.
Ta có thể tóm tắt quy trình gây miễn nhiễm cho thỏ tại Bảng 3.3 Bảng 3.3: Quy trình gây miễn nhiễm trên một con thỏ
Mũi tiêm Liều
(àg)
Tá chất Thể tích máu (mL) (một con thỏ)
Mẫn cảm 100 FCA 2*
Tăng cường lần 1 100 FIC 2**
Tăng cường lần 2 50 FIC 2**
Tăng cường lần 3 25 FIC 50**
Tăng cường lần 4 20 FIC 50**
Tăng cường lần 5 20 FIC 90** (lấy máu tai và tim)
* Trước khi tiêm.
** Sau khi tiêm 12-14 ngày
b. Kiểm tra hiệu giá của kháng huyết thanh
Kiểm tra sự xuất hiện của kháng thể đặc hiệu với Fcγ là cần thiết, vì nếu không có đáp ứng ở con vật không nên tiếp tục nuôi. Để đánh giá hiệu quả về nồng độ KT đặc hiệu với Fcγ người không nên dùng những kỹ thuật quá nhạy, như EIA hay ELISA có thể phát hiện trong vùng nồng độ cực thấp; mặt khác các kỹ thuật đó có thể làm nhận định sai kết quả, vì không phân biệt được phản ứng chéo.
Sử dụng kỹ thuật khuếch tán kép (Ouchterlony) trong thạch có độ nhạy thường là mg/mL xuống vài chục àg/mL, cho phộp phõn biệt đỏp ứng mạnh hay yếu giữa
các con vật, và cũng phát hiện được phản ứng của KT đa dòng với những KN khác nhau trong thạch.
Tiến hành
- Gel agarose (có độ E.E.0 thấp) 1,5% trong dung dịch PBS chứa 0,02
% NaN3 được chưng cách thủy, cho vào khuôn và làm lạnh. Sau đó dùng thiết bị khoan lỗ bằng inox khoan thành những giếng nhỏ theo đỉnh hình lục giác đều (6 giếng xung quanh và một giếng ở giữa), theo mô hình sau.
- Thử khỏng huyết thanh: đưa cỏc 10àl dung dịch huyết thanh trước mẫn cảm vào giếng số 1, 3, 5; huyết thanh sau khi tiêm nhắc lần 1 vào giếng 2, 4, 6; Đưa 20 μl Fcγ người ở giữa trung tâm với nồng độ 0,35 mg/mL.
- Thử hiệu giỏ: tiến hành tiếp pha loóng cỏc huyết thanh thỏ tỉ lệ ẵ, ẳ,
1/8, 1/16, 1/32, 1/64. Đưa 10àl huyết thanh pha loóng lần lượt bỏ vào cỏc giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6. Ở giữa đưa 10μl Fcγ người với nồng độ 0,35 mg/mL.
- Đặt miếng gel vào hộp ẩm và để trong tủ mát, để trong 12 – 48h. Quan sát hiện tượng kết tủa trong thạch.
- Sau khi tấm thạch đã khô cố định trên tấm kính hay bản nhựa, nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm. Rửa sạch màu bằng dung dịch tẩy.
c. Thu IgG thỏ bằng tủa (NH4)2SO4 45%S
1 2
3
5 4 6
1 2
3
4 5
6
Sau mỗi lần lấy máu 50mL, tách huyết thanh và tủa IgGthỏ bằng muối (NH4)2SO4 45%S. Thực hiện như trên mục 3.2.1(a). Giữ IgGthỏ trong muối (NH4)2SO4 45%S để sử dụng khi cần.