3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
3.2.7. Phương pháp xét nghiệm kháng thể kháng nhân – ANA (antinuclear antibody)
Kháng thể kháng nhân (ANA−antinuclear antibodies) là tự KT chống lại nhiều cấu trúc của tổ chức nucleoprotein. Tần suất của KT kháng nhân thay đổi tùy bệnh lý và tùy vào xét nghiệm dùng phát hiện ANA.
Phương pháp
Sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để tiến hành làm xét nghiệm ANA. Đây là kỹ thuật thường được dùng để phát hiện nhiều loại tự KT trong huyết thanh. Người ta dùng mô động vật (ở đây dùng gan chuột) để làm KN đích.
Vật phẩm mô dùng cho xét nghiệm này được để đông lạnh ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể con vật và khi dùng thì đưa máy cắt lạnh và cắt ở −20oC, cho lớp mô mỏng cố định lên bản kính.
(Trích từ: Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa, Sinh lý bệnh và Miễn dịch (phần miễn dịch học), NXB Y học, Hà Nội, 2007.)
Hình 3.3: Nguyên lý miễn dịch huỳnh quang
Huyết thanh bệnh nhân, pha loãng ở những nồng độ dưới và cao hơn 1/40 (khoảng từ 1/10 - 1/50), được ủ với mô (KN đích) trong 30 phút. Sau đó, những KT không gắn vào mô sẽ được rửa sạch trước khi cho KT thứ cấp có gắn huỳnh quang (mục 3.2.6 ở trên) bắt vào kháng thể bệnh nhân. KT đánh dấu sẽ liên kết với immunoglobulin của bệnh nhân đã gắn vào mô (KN đích). Nếu bệnh phẩm có KT kháng nhân thì sự phát quang của flourescein (màu xanh) ở vị trí nhân của tế bào
gan chuột vẫn tồn tại khi bệnh phẩm pha loãng ³ 1/40, đây chính là bệnh phẩm dương tính.
Sau khi huyết thanh được xác định là dương tính thì nó sẽ được định hiệu giá để xem KT mạnh đến mức nào. Kết quả định lượng được tính bằng tỉ lệ hiệu giá (1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320). Cũng như các phòng xét nghiệm khác đều dùng KT thứ cấp đặc hiệu IgG người (ở đây sử dụng KT thứ cấp đặc hiệu với Fcγ người), do đó chỉ phát hiện các KT tự miễn lớp IgG (KT có ý nghĩa lâm sàng).
Tiến hành
Chuột thí nghiệm mua từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Mổ chuột lấy gan bỏ vào khuôn, nhỏ paraffin bỏ vào tủ đông -20oC trong 4 giờ. Sau đó, cắt vật mẫu đông lạnh tại máy cắt lát siêu mỏng đông lạnh SAKURA, ở -20oC, gắn lát mỏng lên những tấm lam có sẵn lỗ đặt mẫu.
Hình 3.4: Tấm kính sử dụng cho hóa mô miễn dịch
* Quy trình xét nghiệm ANA (theo quy trình xét nghiệm ANA của Bệnh viện Đại Học Y Dược)
- Mẫu pha loãng huyết thanh của bệnh nhân bằng đệm 1/10 PBS (pH 7,2) với tỉ lệ 1/10, 1/50.
- Ủ mẫu: mang tấm kính chứa mô gan chuột ra nhiệt độ phòng. Đặt chúng trong một bồn ẩm phự hợp, 50àl huyết thanh õm tớnh (chứng õm) và chứng dương lần lượt vào vị trớ số 1 và số 2. Lần lượt nhỏ 50àl huyết thanh của một bệnh
1 7 8
2 3 9 10
4 11
5 6 12
nhân đã được pha loãng tại 1/10 và 1/50 vào các vị trí còn lại trên lam. Ủ lam trong 30 phút tại bồn ủ ẩm, nhiệt độ 37oC.
- Rửa: rửa huyết thanh trên bằng dung dich đệm đã pha, sử dụng ống nhỏ giọt nhựa hoặc pipette để rửa. Để tấm lam tự khô, tránh để các mẫu có thể tràn lên nhau. Không nhỏ giọt đệm thẳng vào mẫu mô, tránh gây tổn hại cho cơ chất.
- Đặt các tấm lam trong một bình coplin và rửa hai lần hoặc ba lần với bộ đệm (5 phút mỗi lần), khuấy nhẹ nhàng trong khi rửa.
- Pha loãng KT kháng Fcγ có gắn FITC (DAKO), mẫu KT kháng Fcγ (sản xuất được tại mục 3.2.6) theo tỉ lệ là 1/20; 1/40, 1/80. Nhỏ Evans blue vào dung dịch KT đã pha loãng để đạt nồng độ cuối 0,01g/l. Ủ dung dịch tại 37oC, trong 45phút. Lưu ý, khi thực hiện cần tránh ánh sáng.
- Rửa (tương tự như ở phần 4).
- Ngừng rửa, để ráo nước, sau đó nhỏ vài giọt dọc theo tấm lam dung dịch đệm glycerin với đệm phoshate pH 8,0.
- Đậy tấm kính bảo vệ lên giữ và mang đi quan sát dưới kính hiển vi điện tử huỳnh quang. Chụp hình dưới kính hiển vi huỳnh quang so sánh các sản phẩm.
* Lưu ý: dung dịch kháng Fcγngười đánh dấu với FITC (DAKO) có nồng độ protein = 3 mg/mL; F/P = 0,65. Dung dịch kháng Fcγngười đánh dấu với FITC (sản xuất tại mục 3.2.6) có nồng độ protein = 7,6mg/mL, F/P = 1,85.