Bài viết tập trung nghiên cứu chế tạo kháng thể (IgG, IgY) và tinh sạch kháng thể sẵn có đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N. atra, có thể sử dụng để phát triển bộ xét nghiệm miễn dịch phát hiện nọc rắn hổ mang N. atra.
ứng chéo HTKNR với nọc rắn khác: Phản ứng chéo huyết (thỏ, gà, ngựa) kháng nọc rắn N atra với nọc rắn khác loài (rắn Hổ đất, Hổ chúa, Chàm quạp Lục xanh) khảo sát kỹ thuật ELISA gián tiếp Kết ELISA dương tính thể có mặt kháng thể phản ứng chéo * Tinh kháng thể: - Huyết chứa kháng thể đặc hiệu tinh phương pháp sắc ký lực (sử dụng cột protein A cho huyết thỏ, cột protein G cho huyết ngựa), sau thẩm tích qua đêm 40C 80 Hình 1: Biến động hiệu giá kháng thể đặc hiệu thỏ gà gây miễn dịch Kháng thể đặc hiệu bắt đầu xuất sau mũi tăng dần trình gây miễn dịch, đạt cao sau - lần tiêm kháng nguyên TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 Kết xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu HTKNR Hình 2: Hiệu giá kháng thể đặc hiệu HTKNR Hiệu giá kháng thể có huyết thỏ (T2, T3) gà (G3) sau lần gây miễn dịch đạt từ 128.000 - 256.000, hiệu giá kháng thể có huyết ngựa 256.000 Phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn N atra với kháng nguyên nọc rắn khác loài (1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất) Hình 3: Phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn N atra với nọc rắn khác lồi 81 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 Có phản ứng chéo kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn N atra với nọc loài rắn khác Mức độ phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn N atra với nọc loài rắn họ cao so với nọc loài rắn khác họ Kết tách chiết tinh kháng thể IgG IgY IgG thỏ IgG ngựa IgY gà Hình 4: Sắc ký đồ tinh kháng thể IgG IgY Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy với kỹ thuật sắc ký lực, sắc ký trao đổi ion, tách kháng thể IgG từ huyết thỏ ngựa, IgY từ trứng gà Kết điện di kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh Hình 5: Các kháng thể sau tách chiết tinh (M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG ngựa, 2: kháng thể IgY gà, 3: kháng thể IgG thỏ) Hình ảnh điện di cho thấy, kháng thể sau tách chiết tinh có độ tinh cao Kích thước băng tương ứng với kích thước chuỗi nặng chuỗi nhẹ IgG IgY 82 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 Hoạt tính kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh Hình 6: Hoạt tính kháng thể sau tinh Có thể thấy, kháng thể IgY từ trứng gà, IgG từ thỏ ngựa sau tinh có hoạt tính kháng ngun nọc rắn N atra (ở độ pha loãng 128.000 256.000 lần) BÀN LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy cá thể động vật gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn N atra liều khác tạo kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn Trước gây miễn dịch, khơng có động vật có kháng thể tự nhiên kháng nọc rắn Hiệu giá kháng thể đặc hiệu huyết sau lần gây miễn dịch dao động từ 128.000 256.000 Như vậy, quy trình gây miễn dịch chế tạo HTKNR mà áp dụng đạt hiệu tốt nọc rắn hổ mang N atra Kết phù hợp với nghiên cứu Đỗ Khắc Đại CS (với loài rắn độc thường gặp Việt Nam) [2] Nọc rắn hỗn hợp nhiều thành phần, có thành phần giống nọc loài rắn khác nhau, đặc biệt loài rắn họ Vì vậy, HTKNR lồi phản ứng chéo với kháng nguyên nọc loài rắn khác [7] Phản ứng chéo tạo khả trung hồ chéo HTKNR điều trị, số trường hợp, sử dụng HTKNR đặc hiệu loài rắn điều trị cho nạn nhân rắn cắn lồi rắn khác họ có mức độ phản ứng chéo mạnh [7] Tuy nhiên, phương diện chẩn đốn xác định lồi rắn phản ứng chéo lại nguyên nhân dẫn đến tượng dương tính giả chẩn đốn nhầm [6] Kết nghiên cứu hình cho thấy có tượng phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn N atra với nọc số loài rắn khác Mức độ phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên nọc loài rắn họ mạnh so với loài rắn thuộc họ khác Cụ thể, phản ứng chéo kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn N atra với nọc rắn Hổ đất Hổ chúa mạnh so với nọc rắn Chàm quạp Lục xanh Kết phù hợp với nghiên cứu Đỗ Khắc Đại CS [2] Điều cho thấy, để chế tạo xét nghiệm miễn dịch phát nọc rắn Hổ mang N atra với độ đặc hiệu cao, cần tiếp tục tinh chế kháng thể để loại bỏ kháng thể phản ứng chéo Ngoài ra, với phương pháp tách chiết tinh kháng thể (IgG, IgY) mà chúng tơi áp dụng, kháng thể thu có độ tinh tương đối cao thể hoạt tính kháng thể đặc hiệu 83 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016 với kháng nguyên nọc rắn N atra độ pha loãng 128.000 - 256.000 lần, đáp ứng yêu cầu chế tạo xét nghiệm miễn dịch phát nọc rắn KẾT LUẬN - Đã tạo kháng thể đặc hiệu nọc rắn Hổ mang N atra từ huyết thỏ từ l ng đỏ trứng gà quy trình gây miễn dịch tiêm da (thỏ), tiêm ngực (gà), nhắc lại nhiều lần cho hiệu giá kháng thể cao sau lần gây miễn dịch - Có phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn Hổ mang N atra với nọc rắn Hổ đất, Hổ chúa, Lục xanh Chàm quạp mức độ khác - Kết hợp phương pháp thường quy tách chiết tinh kháng thể, thu kháng thể (IgG, IgY) đặc hiệu nọc rắn N atra có độ tinh hoạt tính cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Bệnh viện Bạch Mai Số liệu thống kê phần mềm quản lý Trung tâm Chống độc năm 2009 Hà Nội 2009 Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Đặng Dũng, Lê Văn Đông Nghiên cứu chế tạo HTKNR bốn loài rắn độc thường gặp Việt Nam làm nguyên liệu chế tạo xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn Tạp chí Y - Dược học Quân 2008, 2, tr.108-113 84 Võ Văn Chi, Nguyễn Đức Minh Các lồi rắn thơng thường Việt Nam, rắn làm thuốc thuốc trị rắn cắn Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tái lần thứ hai 2000, tr.43-100 Trịnh Xuân Kiếm Rắn cắn Việt Nam: Kết nghiên cứu 10 năm Bệnh viện Chợ Rẫy Kỷ yếu báo cáo khoa học Hội nghị Quốc tế rắn độc chăm sóc BN rắn độc cắn TP Hồ Chí Minh 11 - 1998 Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại CS Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan cá Tra công nghệ tạo kháng thể IgY gà Tạp chí Thơng tin Y Dược 2010, 3, tr.71-76 Selvanayagam ZE, Gopalakrishnakone P Tests for detection of snake venoms, toxins and venom antibodies: review on recent trends (1987 - 1997) Toxicon 1999, 37 (4), pp.565-586 Selvanayagam ZE, Gnanavendhan SG, Ganesh KA et al ELISA for the detection of venoms from four medically important snakes of India Toxicon 1999, 37 (5), pp.757-770 Warrell DA WHO/SEARO Guidelines for The Clinical Management of the Snakebite in Southeast Asian Region Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health 1999, 30, pp.1-85 World Health Organization WHO Guidelines for the production, control and regulation of snake antivenom immunoglobulins Expert Committee on Biological Standardization Gevena, Switzerland 2010 ... chéo kháng thể kháng nọc rắn N atra với kháng nguyên nọc rắn khác loài (1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất) Hình 3: Phản ứng chéo kháng thể kháng nọc. .. chéo kháng thể với kháng nguyên nọc loài rắn họ mạnh so với loài rắn thuộc họ khác Cụ thể, phản ứng chéo kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn N atra với nọc rắn Hổ đất Hổ chúa mạnh so với nọc rắn. .. nghiên cứu cho thấy cá thể động vật gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn N atra liều khác tạo kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn Trước gây miễn dịch, khơng có động vật có kháng thể tự nhiên kháng