hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng (tht) lợn và e.coli được chiết tách từ lòng đỏ trứng gà bằng công nghệ mới

Liên hiệp các hội KH&KT bộ khoa học Việt Nam & công nghệ Hội thú y Việt Nam Báo cáo nghiệm thu nhiệm vụ: Hợp tác nghiên cứu khoa Học và phát triển công nghệ Việt Nam – Hungary theo

Liên hiệp các hội KH&KT bộ khoa học

Việt Nam & công nghệ

Hội thú y Việt Nam

Báo cáo nghiệm thu nhiệm vụ:

Hợp tác nghiên cứu khoa Học và phát triển công nghệ

Việt Nam – Hungary theo nghị định th−

Tên nhiệm vụ

Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng

tụ huyết trùng lợN ( THT ) & E.Coli đ−ợc chiết tách từ lòng đỏ

trứng gà bằng công nghệ mới

Họ tên chủ nhiệm nhiệm vụ: GS.TSKH Phan Thanh Ph−ợng

Cơ quan chủ trì : Hội thú y Việt nam

7345

12/5/2009

Báo cáo nghiệm thu

Tên đề tài:

“ HỢP TÁC NGHIấN CỨU CHẾ TẠO VÀ THỬ NGHIỆM

KHÁNG THỂ KHÁNG TỤ HUYẾT TRÙNG ( THT ) LỢN & E.Coli ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ LềNG ĐỎ TRỨNG GÀ BẰNG

CễNG NGHỆ MỚI”

Nằm trong khuôn khổ hợp tác khoa học và công nghệ theo Nghị định thư giữa Việt nam và Hungary, Hội thú y Việt nam thuộc Liên hiệp các Hội khoa học và kỹ thuật Việt nam được Bộ khoa học và công nghệ giao nhiệm vụ thực hiện đề tài :

“ Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng tụ huyết trùng (THT) lợn

được chiết tách từ lòng đỏ trứng gà bằng công nghệ mới” .

Trước khi vào nội dung chính , xin được báo cáo về việc bổ sung nội dung

đề tài : Trong quá trình điều tra tình hình dịch tễ bệnh tụ huyết trùng (THT ) lợn thấy rằng tình hình dịch bệnh do E.Coli xảy ra rất trầm trọng , cần được quan tâm

để có biện pháp khống chế Được Ban chủ nhiệm thực hiện nhiệm vụ đồng ý , đề tài đã tiến hành nghiên cứu cả 2 hai bệnh và chế kháng thể phòng chống hai bệnh nói trên Dù nội dung được bổ sung , nhưng đề tài chỉ xin điều chỉnh các khoản chi tiêu đã được duyệt , đồng thời đã khai thác được nguồn kinh phí khác ( Cty BTV.JSC hỗ trợ một phần ) để thực hiện phần nội dung bổ sung Được cơ quan quản lý đồng ý và cho phép đã tiến hành đề tài theo nội dung được điều chỉnh, do

đó đề tài có tên là :

“Hợp tác nghiên cứu chế tạo và thử nghiệm kháng thể kháng

tụ huyết trùng (THT) lợn & E.Coli được chiết tách từ lòng đỏ trứng

gà bằng công nghệ mới” , đến nay đã kết thúc, xin báo cáo kết quả đã thực hiện

Báo cáo nghiệm thu nhiệm vụ hợp tác quốc tế

Chức danh: Trưởng ban đối ngoại của Hội Thú y Việt nam

Điện thoại: (CQ) 84-4-8691082- ĐT nhà riêng: 84-48523923

Điện thoại di động: 0904214215

E-mail: thanhphuongd2c@yahoo.com

Địa chỉ cơ quan: 86 đường Trường Chinh - Đống Đa – Hà Nội.(tầng III )

Địa chỉ nhà riêng: Nhà D2C Phòng 301 – Phương Mai - Đống Đa – Hà Nội

8 Cơ quan chủ trì phía Việt Nam:

Tên tổ chức KH&CN: Hội thú y Việt Nam

Điện thoại: 84-4-8691082 Fax: (84).4.8694082

E-mail: vvahty@fmail.vnn.vn

Địa chỉ: 86 đường Trường Chinh - Đống Đa – Hà Nội.(tầng 3)

9 Họ và tên chủ nhiệm đối tác nước ngoài:

Mr.Laszlo Pados,Tesco General Director

10 Cơ quan đối tác nước ngoài :

- International Cooperation and Consulting Company,Tesco Hungary

11 Xuất xứ thoả thuận đã có với đối tác nước ngoài:

- Thời gian ký kết thoả thuận: 3/2005

- Cấp ký kết thoả thuận: Chủ tịch Phân ban hợp tác KHKT Việt nam –Hungary

- Các nội dung thoả thuận chính:

+ Hợp tác nghiên cứu chiết tách IgY ( Immunoglobulin Y ) từ lòng đỏ trứng gà được tối miễn dịch chống THT & E.Coli bằng công nghệ cao + ứng dụng các dạng kháng thể phòng trị bệnh cho lợn tại Việt nam

II Nội dung KH&CN của nhiệm vụ

12 Mục tiêu của nhiệm vụ

- Nhiệm vụ chủ yếu của Chương trình này là: Phía Việt nam tiếp thu

được Công nghệ mới, chế tạo được kháng thể từ lòng đỏ trứng gà trong phòng thí nghiệm, với giá thành hạ, nhằm sử dụng đại trà trong sản xuất phòng chống bệnh tụ huyết trùng (THT) & E.Coli đang gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn tại Việt Nam

- Phía Hungary sẽ hỗ trợ chuyển giao công nghệ cao tách chiết kháng thể (IgY) nhằm nâng cao hiệu quả của chế phẩm với giá thành hạ, tạo điều kiện thuận lợi ứng dụng rộng tại Việt Nam

Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

13 Tình hình nước trong nước

Bênh tụ huyết trùng (THT) lợn là một trong một số bệnh gây tổn thất lớn cho nghề chăn nuôi lợn Bệnh THT lợn được phát hiện tại Việt Nam vào những năm của thế kỷ 19 Tuy nhiên, cho đến nay việc phòng chống bệnh vẫn còn nhiều bất cập, làm cho dịch bệnh THT vẫn còn nghiêm trọng

Theo thông báo của Cục thú y tình hình dịch bệnh THT lợn vẫn còn gia tăng ở các địa phương

Hiện nay, Việt Nam có khoảng gần 20 triệu lợn, số lợn bị bệnh THT vào khoảng 0,5%; Số chết do bệnh THT lợn gây ra vào khoảng 0,2%.Do đó,bệnh

THT lợn là một bệnh được Cục thú y liệt vào 4 bệnh đỏ của lợn

Bệnh THT là bệnh thường gây chết đột ngột, nên việc tiêm phòng bằng vacxin là biện pháp hữu hiệu nhất Hiện nay, vacxin THT keo phèn giảm liều (1ml/lợn) được ứng dụng rộng rãi; ngoài ra, còn có vacxin nhũ hoá có hiệu lực cao và miễn dịch kéo dài đang từng bước đưa vào sản xuất (Phan Thanh Phượng và CS 1977,1985 ,1986 , 1999, 2000, 2002…) Tuy nhiên, tỷ lệ tiêm phòng ở các địa phương đạt được chưa đồng đều và còn thấp, nên việc sử dụng hoá dược và kháng sinh vẫn được dùng để khống chế bệnh

Song, dùng kháng sinh và hoá dược dễ gây nhờn thuốc, nên hiệu quả

đó chúng tôi khẳng định phương hướng này cần được phát triển với mục đích: nâng cao hiệu lực và hạ giá thành sản phẩm bằng công nghệ mới

Để giảm hiện tượng kháng kháng sinh, hoá dược của một số vi sinh vật gây bệnh, giảm tồn dư kháng sinh trong thực phẩm, bảo đảm sức khoẻ cộng đồng tạo thực phẩm sạch, an toàn cần chế tạo và sử dụng các chế phẩm sinh học: Như kháng thể, các chế phẩm chế từ các chủng vi sinh trợ sinh học (probiotic)

Chương trình Quốc gia tại Việt Nam giám sát tính kháng thuốc của vi khuẩn (ASTS) từ năm 1989 - 1993 thông báo tính kháng thuốc của một số vi khuẩn rất mạnh Điển hình là vi khuẩn E.coli tỷ lệ kháng thuốc đạt tới 70% - 80% số chủng phân lập Cụ thể kháng Ampicillin đạt 52 – 76% ; kháng

cephlothin - 12,5% ; kháng gentamycin – 8%

T×nh h×nh dÞch tÔ bÖnh tô huyÕt trïng

Bảng 1 : Diễn biến dịch bệnh tụ huyết trùng lợn

qua các tháng trong năm 2005

lý

Ghi chú

1 Hà Tây - - 2276 277

2 Vĩnh Phúc 9 25 375 32 Tháng 1

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây 14 182 1878 267

2 Vĩnh Phúc 7 47 595 71 Tháng 2

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây 14 193 1981 279

2 Vĩnh Phúc 6 27 591 61 Tháng 3

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc - - - - Tháng 4

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc - - - - Tháng 5

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc - - - - Tháng 6

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc 6 44 524 44 Tháng 7

3 Hà Nội 5 13 122 6

1 Hà Tây 14 207 2075 330

2 Vĩnh Phúc 8 72 844 66 Tháng 8

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc 9 62 915 58 Tháng 9

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây 14 203 2160 343 Tháng 10

1 Hà Tây - - - -

2 Vĩnh Phúc 6 50 414 39 Tháng 11

3 Hà Nội - - - -

1 Hà Tây 14 197 1931 309

2 Vĩnh Phúc 7 67 863 63 Tháng 12

Phân tích chi tiết bảng 5 cho thấy: dù thời gian nào trong năm thì Hà Tây

vẫn là địa phương bị bệnh tụ huyết trùng lợn cao nhất trong 3 tỉnh khảo sát

Bảng 3 : Diễn biến dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn trong cả 2 năm

2005 và 2006

Số huyện

CD

% Số xã CD %

Số con

ốm

%

Số con chết

(2005) và 90,72% (2006) Vì vậy, chúng tôi dựa vào Hà Tây để ứng dụng kháng thể nhằm hỗ trợ địa phương giảm thiệt hại lợn do bệnh này gây ra

Địa phương có tỷ lệ lợn mắc bệnh tụ huyết trùng cao thứ 2 là Vĩnh Phúc Còn Hà Nội tỷ lệ này rất thấp

Tû lÖ tiªm phßng :

- Tû lệ tiêm phòng dịch bệnh tụ huyết trùng ( THT ) lợn ở Hà Tây còn qúa thấp, nơi cao nhất chỉ đạt 50% , nên tỷ lệ mắc bệnh cao hơn các tỉnh đang khảo sát

- Tỷ lệ tiêm phòng bệnh THT ở Hà nội khá tốt, đạt 70 – 80% , nên tỷ lệ mắc bệnh rất thấp Có thể công nhận Hà nội là vùng an toàn bệnh THT trong những năm gần đây

- Tỷ lệ tiêm phòng ở Vĩnh Phúc đạt không đều ở các vùng trong tỉnh Có huyện đạt 70 – 80% ,một số huyện khác đạt 30 – 40 % , nên dịch bệnh THT vẫn còn xảy ra

Số liệu trên cho thấy tỷ lệ tiêm phòng tỷ lệ nghịch với tỷ lệ mắc bệnh Đây cũng nằm trong quy luật chung ,càng thấy rõ : Để phòng bệnh tốt cần phải tổ chức tiêm phòng tốt

Ngoài việc tiêm phòng bệnh và sử dụng kháng sinh dùng để điều trị, cần phải có một chế phẩm sinh học để cấp cứu những trường hợp bệnh xảy ra đột ngột

và cứu chữa các cơ sở nằm gần ổ dịch Vì dùng kháng sinh để điều trị cho kết qủa không ổn định, do mầm bệnh đã quá nhờn thuốc, rất khó điều trị có hiệu quả như trước đây

Vì bệnh tụ huyết trùng lợn là bệnh lây lan nhanh, gây chết đột ngột, cần sử dụng kháng thể để giảm thiệt hại cho lợn Do đó, hướng nghiên cứu chế tạo kháng thể để khống chế bệnh tụ huyết trùng là cấp thiết và đúng hướng

Trong khi điều tra dịch tễ bệnh tụ huyết trùng lợn, nhận thấy bệnh E coli

gây ra cho đàn lợn nuôi rất trầm trọng, nhất là lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa Do đó, đã kết hợp với Công ty Công nghệ Cổ phần Công nghệ Sinh học Thú

y (BTV JSC.) nghiên cứu chế tạo kháng thể nhị liên tức là một kháng thể vừa

phòng chống được bệnh tụ huyết trùng lợn, vừa phòng chống được bệnh do E coli

gây ra ở lợn Nhờ sự phối hợp trên, tuy bổ sung thêm nội dung nghiên cứu, nhưng

đề tài không đề nghị bổ sung kinh phí

TÌNH HÌNH BỆNH DO E COLI

Bệnh do E coli đã được nhiều tác giả quan tâm và tiến hành nghiên cứu từ

những năm 80, 90 của thế kỷ trước, nhưng đến nay vẫn còn là vấn đề thời sự Đặc biệt đối với lợn sơ sinh, lợn con theo mẹ và lợn cai sữa

Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy như virut viêm dạ dày, ruột (transmissible gastroenteritidis - TGE), rotavirut, coccidia,…song thường gặp nhất

vẫn là vi khuẩn E coli (Biehl và cs., 1986) E coli là vi khuẩn cư trú thường xuyên trong đường tiêu hóa của lợn, song có hai hệ: E coli gây bệnh và E coli hữu ích Khi điều kiện chăm sóc sai sót, thời tiết không thuận lợi,…thì E coli gây bệnh thắng thế, áp đảo E coli hữu ích và gây bệnh cho lợn

Các chủng E coli gây bệnh đều sản sinh ra độc tố đường ruột, nên được gọi

là Enterotoxigenic E coli ( ETEC ) ETEC bám vào màng nhày ruột non của lợn

con bằng một hoặc nhiều yếu tố dính bám như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) hoặc F41 Chúng phát triển ở tế bào biểu bì ruột non và sản xuất ra các độc tố đường ruột như: ST hoặc LT

Các nghiên cứu về E coli ở nước ta rất phong phú (Nguyễn Thị Nội, 1986;

Lê Văn Tạo và cs., 1990, 1995, 1997; Nguyễn Khả Ngự, 1999; Trần Thị Hạnh, 2000; Lý Liên Khai, 2001; Đặng Xuân Bình, 2003; Trịnh Quang Tuyên,

2006),…đều xác nhận rằng tỷ lệ bị bệnh tiêu chảy và bệnh phù đầu do E coli là

rất cao ở lợn sơ sinh, lợn con theo mẹ và lợn cai sữa Bởi vậy việc áp dụng các biện pháp phòng, chống bệnh cho lợn con ở các lứa tuổi này rất quan trọng vì đây

là thời kỳ khởi đầu cho lợn phát triển trong các giai đoạn sau

1-Vi khuẩn E coli gây bệnh có hai khả năng:

trình adenylat làm thay đổi quy trình trao đổi muối - nước ở ruột gây ra tiêu chảy Độc tố tế bào phá huỷ tế bào, tăng tính thẩm thấu thành mạch, tạo bệnh tích ở các

tổ chức cơ quan và gây thẩm dịch mô bào Độc tố thần kinh phá hủy tế bào thần

kinh gây những triệu chứng thần kinh

- Khả năng gây dung huyết: Vi khuẩn sản sinh men haemolyzin để phá hủy

hồng cầu vật chủ, giải phóng Fe3+ dùng cho qúa trình phát triển của mình

- Ngày nay, bằng phương pháp chụp vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử và các phản ứng sinh hóa, PCR đã xác định được cấu trúc vi thể thực hiện chức năng bám dính của E coli Đó là các pili (fimbriae) Fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ, gọi là sợi bám dính Sợi bám dính có tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên bám dính (KN - F) (Elsinghorst E A., and Weit J.A.; 1994)

- Kháng nguyên bám dính : Đã xác định được nhiều loại kháng nguyên bám

dính của vi khuẩn E coli Mỗi loại kháng nguyên dính bám có các quyết định kháng nguyên tương xứng, phù hợp với cấu trúc điểm tiếp nhận trên bề

mặt của tế bào biểu mô nhung mao ruột non của từng loài động vật hoặc từng lứa tuổi động vật như: F4 có ở E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con, F18 có ở

E coli gây bệnh phù đầu cho lợn trước và sau cai sữa, F5 có ở E coli gây bệnh tiêu chảy cho bê nghé, F41 có ở E coli gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em,…Nagy (1999) và Lê Văn Tạo (1993) đã xác định được 36% chủng E coli phân lập từ lợn con bị bệnh phân trắng mang F4 Trịnh Quang Tuyên (2003) đã xác định được 61,4% chủng E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn 1 – 21 ngày tuổi mang F4 và 40,2%

E coli phân lập từ lợn con 22 – 60 ngày tuổi bị bệnh phù đầu mang F18

- Yếu tố độc tố :Cùng với nghiên cứu về yếu tố bám dính của E coli, yếu tố

độc lực cũng được nghiên cứu làm rõ hơn về cấu trúc, chức năng của từng loại độc

tố và vai trò của từng loại trong từng thể bệnh (Fairbrother J M., et al, 1992; Carter, G R et al, 1995) Sử dụng phương pháp PCR (Mainil, 1995) đã xác định trên 80% chủng ETEC mang gen sản sinh các độc tố như: STb, LT1, StaP Cũng bằng PCR, Vũ Khắc Hùng (2004) đã xác định được các tổ hợp độc tố như: STa + STb, LT + STb, VT2 + LT, LT + STb + VT2, LT + Sta + VT2, STa + STb + VT2, STa + STb + VT2, STa + STb + VT2 + LT từ 220 chủng E coli phân lập từ lợn con bị tiêu chảy

- Lờ Văn Tạo (1993) đó xỏc định được 16% chủng E coli phõn lập từ lợn bị phõn trắng sản sinh độc tố đường ruột

- Nguyễn Khả Ngự (2000) xỏc định độc tố ở 30 chủng E coli gõy bệnh phự đầu cho lợn nuụi tại đồng bằng sụng Cửu Long ; cú 56,67% số chủng mang LT, 83,33% số chủng mang ST và 50% số chủng mang cả ST + LT

- Trịnh Quang Tuyờn (2003) cho biết E coli gõy bệnh tiờu chảy cho lợn 1 -21 ngày tuổi sản sinh LT chiếm 16,9%, STa 37,3%, STb 45,8% E coli gõy bệnh phự đầu ở lợn 22 – 60 ngày tuổi sản sinh LT với tỷ lệ 42,4%, ST 57,6% và ST + LT

44, 6%

- Nhiều tỏc giả gọi cỏc bệnh do vi khuẩn E coli gõy ra là bệnh truyền nhiễm cú điều kiện Căn cứ vào sự tỏc động của cỏc yếu tố gõy bệnh của E coli khi gõy bệnh, tuổi lợn mắc bệnh và triệu trứng biểu hiện, người ta chia bệnh do E coli ở lợn thành 2 loại: bệnh đường ruột do E coli (bệnh tiờu chảy) và bệnh nhiễm trựng mỏu (bệnh phự đầu)

2 Cơ chế gõy bệnh của vi khuẩn E coli:

Theo Sarmientor (1988) và Faubert (1992), vi khuẩn E coli bằng cỏch trực tiếp hay giỏn tiếp xõm nhập vào đường ruột của lợn Trong ruột, khi cú đủ cỏc điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhõn lờn với số lượng lớn, sản sinh yếu tố khỏng khuẩn Colicin V (ColV)

-Yêú tố Colicin: Yếu tố này tiờu diệt hoặc hạn chế sự phỏt triển của vi khuẩn

đường ruột khỏc, đặc biệt là cỏc vi khuẩn cú lợi như Bacillus subtilis, cỏc vi khuẩn lactic Vi khuẩn độc hại cú số lượng lớn trong ruột ỏp đảo vi khuẩn cú lợi , chỳng chiếm ưu thế và tràn lờn ruột non Ở ruột non, nhờ cú khỏng nguyờn bỏm dớnh, vi khuẩn bỏm dớnh được vào lớp biểu mụ nhung mao ruột Sau khi bỏm dớnh xong , nhờ yếu tố xõm nhập, vi khuẩn xõm nhập vào trong lớp tế bào biểu mụ Trong lớp

tế bào biểu mụ, vi khuẩn phỏt triển nhõn lờn lần thứ nhất làm phỏ hủy lớp tế bào này gõy ra viờm ruột

- Yếu tố độc tố đường ruột :Cũng tại đõy, vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột

nước và chất điện giải không được hấp thụ từ ruột vào cơ thể, ngược lại thẩm xuất

từ cơ thể vào ruột Nước tập trung vào ruột làm cho ruột căng lên, cộng với khí do

vi khuẩn E coli trong ruột lên men tạo ra cũng làm cho ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột mạnh đẩy nước và phân ra ngoài, gây nên tiêu chảy (Sokol et al, 1978)

-NhiÔm trïng huyÕt : Từ tế bào niêm mạc ruột, vi khuẩn E coli vào hệ thống

hạch ruột qua hệ bạch huyết vào hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng huyết Trong máu,

E coli tiếp tục phát triển nhân lên lần thứ 2 sản sinh yếu tố dung huyết, phá vỡ hồng cầu gây thiếu máu, tăng tính thấm thành mạch, nước từ trong mao quản thẩm xuất ra tích tụ trong các mô bào gây phù

- Theo máu, vi khuẩn đến các cơ quan nội tạng, trong các cơ quan nội tạng vi khuẩn sản sinh độc tố tế bào phá hủy tế bào tổ chức, tăng tính thấm thành mạch, sản sinh độc tố thần kinh phá hủy tế bào thần kinh Tùy theo mức độ sản sinh các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn gây các thể bệnh, trạng thái bệnh và mức độ bệnh khác nhau

3 Những bệnh do vi khuẩn E coli gây ra ở lợn:

3.1 Bệnh phân trắng lợn con :

- Do tiểu khí hậu và chăm sóc trong chuồng nuôi :Bệnh thường xảy ra ở lợn

con, đặc biệt là lợn mới sinh từ 1 -21 ngày tuổi, tập trung chủ yếu trong 10 ngày đầu, có con mắc sớm sau khi sinh 2 -3 h và mắc muộn hơn sau khi đã tròn 4 tuần tuổi Bệnh xảy ra khi thời tiết thay đổi, khí hậu rét, mưa nhiều, độ ẩm cao Bệnh hay xảy ra ở các đàn lợn mẹ đẻ lần đầu, lợn mẹ chửa không được chăm sóc đầy

đủ, chuồng trại mất vệ sinh, vi khuẩn E coli luôn luôn tồn tại trong môi sinh

Vi khuẩn E coli có sẵn trong ruột hoặc cảm nhiễm từ ngoài: Gặp điều kiện

thích hợp tiếp nhận các yếu tố gây bệnh , nên gây thành bệnh Với các yếu tố gây bệnh có được, trước hết vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non bằng kháng nguyên bám dính F4 (K88) Sau đó vi khuẩn xâm nhập và cư trú ở thành ruột non, phát triển nhân lên, sản sinh ra độc tố đường ruột, độc tố này sẽ phá hủy

tổ chức thành ruột và làm thay đổi cân bằng trao đổi muối - nước, chất điện giải Nước không được hấp thu từ ruột non vào mà rút nước từ cơ thể tập trung vào

ruột Vi khuẩn phát triển làm thay đổi pH trong ruột và dạ dày, sữa không tiêu, bị vón lại sinh ra tiêu chảy, phân có màu trắng

Hàm lượng kháng thể thụ động cho con non: Khả năng xảy ra bệnh trong

một đàn phụ thuộc nhiều yếu tố như: khả năng tiếp xúc của lợn sau khi đẻ ra với

E coli, sự ô nhiễm E coli trong ổ đẻ của lợn, điều kiện chăm sóc lợn mẹ, nhiệt độ chuồng nuôi,, làm cho hàm lượng kháng thể được truyền qua sữa đầu của lợn mẹ

bị hạn chế Yếu tố này cũng góp phần cho bệnh xảy ra trầm trọng hơn

Bệnh phân trắng lợn con là bệnh truyền nhiễm có điều kiện : bệnh lây lan

không mạnh Các serotyp E coli thường phân lập được từ bệnh phẩm lợn con bị bệnh phân trắng là O9, O111, O149 Khi đàn lợn bị bệnh nếu không can thiệp kịp thời tỷ lệ chết cao tới 60 – 90%, đặc biệt lợn con mắc bệnh vào tuần đầu , ngay cả

sơ sinh Những lợn con khỏi bệnh thường bị còi cọc, phát triển chậm trong giai đoạn sau, nuôi kém hiệu quả

3.2 Bệnh tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn E coli:

Bệnh xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhưng tỷ lệ mắc bệnh, mức độ trầm trọng và tỷ lệ chết cao tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa 1 tháng Bệnh do các serotyp E coli O8, O141, O147, O149 và O157, trong đó O149 F4 thường chiếm tỷ lệ cao (Hampson D J., 1994; Trịnh Quang Tuyên, Lê Văn Tạo

và cs., 2003) Các chủng E coli này do lợn con bị nhiễm từ môi trường, từ vú mẹ khi bú hoặc có sẵn trong ruột, gặp điều kiện thuận lợi phát triển nhân lên với số lượng lớn, chiếm tỷ lệ lớn , áp đảo các vi khuẩn đường ruột khác, đồng thời tiếp nhận các yếu tố gây bệnh khác trong quá trình phát triển, gặp khi cơ thể lợn chịu các tác động bất lợi như: chăm sóc nuôi dưỡng kém, thay đổi thức ăn đột ngột, nhiệt độ, độ ẩm, thời tiết chuồng nuôi thay đổi, vi khuẩn tác động gây bệnh (Vũ Khắc Hùng, 2004)

Các serotyp E coli gây bệnh tiêu chảy thường mang các yếu tố dính bám F4, F6 và F5; độc tố đường ruột, chủ yếu LT1, LT1 và ST1, đôi khi có Stx2e (Nagy B

et al, 1999) hoặc LT, STa và STb (Hampson D J., 1994; Trịnh Quang Tuyên, Lê Văn Tạo và cs., 2003) Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ở lợn giống như ở bệnh phân trắng lợn con, nhưng do hệ thống thần kinh của lợn đã hoàn chỉnh, điều tiết được

các chức năng sinh lý, lợn đã ăn các thức ăn tinh và thô thay cho bú sữa, nên phân

có màu vàng

3.3 Bệnh phù đầu lợn con (Edema disease) :

Ở nước ngoài :Bệnh này do một số serotyp kháng nguyên O của E coli sau

đây gây ra: O138, O139K12H1, O141K85q, O141K85ac (Beschinger H.U et al, 1978)

Để gây được bệnh, ngoài các yếu tố gây bệnh có ở E coli gây tiêu chảy cần phải có yếu tố bám dính F18 thay cho F4, độc tố tế bào ngày nay gọi là Shigatoxin (Stx 2e), độc tố thần kinh và các yếu tố gây dung huyết mà chủ yếu là α-haemolytic Nhờ các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nhiễm trùng huyết, trong máu yếu tố dung huyết phá vỡ hồng cầu làm cho máu loãng, độc tố tế bào vừa phá hủy tế bào tổ chức gây bệnh gây bệnh tích, vừa tăng tính thấm thành mạch, nước từ hệ tuần hoàn đi vào mô bào gây hiện tượng phù Độc tố thần kinh tác dụng vào trung ương thần kinh gây hiện tượng run rẩy, co giật (Rodney A et al, 2000)

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện và bắt đầu nghiên cứu từ những năm đầu thập

kỷ 90 của thế kỷ XX ở đồng bằng sông Cửu Long, sau đó bệnh xuất hiện ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng vào những năm cuối của thập kỷ 90 của thế kỷ XX, dần dần bệnh có mặt ở các tỉnh duyên hải miền Trung, cho đến nay bệnh đã có mặt ở tất cả các tỉnh với mức độ trầm trọng khác nhau, đồng bằng nặng hơn trung du, miền núi Bệnh thường xuất hiện ở lợn trước và sau cai sữa (từ 45 – 90 ngày tuổi), khi lợn tách đàn Lúc này lợn thay đổi thức ăn, phương thức tiêu hóa, pH trong ruột thay đổi, vi khuẩn phát triển nhân lên, sản sinh nhiều độc tố đường ruột, độc

tố tế bào Các độc tố này một phần tác động ngay tại ruột gây tiêu chảy, phần lớn hấp thu vào máu gây bệnh Bệnh thường xảy ra ở những lợn lớn nhất trong đàn

Tỷ lệ nhiễm bệnh trong đàn có khi đạt tới 80 -100%, nhưng thường là 30 – 40%,

bệnh thường kéo dài 4 – 14 ngày, tỷ lệ chết phụ thuộc vào tuổi mắc bệnh và điều kiện chăm sóc vệ sinh, có khi rất nhẹ, qua nhanh, có khi chết tới 50 -90% đàn

Mầm bệnh từ phân lợn ốm được reo rắc ra, nhiễm vào không khi, thức ăn, xe cộ, lợn, người và dụng cụ chăn nuôi rồi xâm nhập vào cơ thể qua đường miệng hoặc

vi khuẩn có trong ruột tự nhiễm khi có điều kiện bất lợi cho cơ thể, thuận lợi cho

sự phỏt triển của vi khuẩn, bệnh sẽ xảy ra ( Lờ Văn Tạo và cs., 1993; Nguyễn Khả Ngự, 2000;Trịnh Quang Tuyờn, Lờ Văn Tạo và cs.,2003)

thành cụng khỏng thể phũng và chữa bệnh do E coli, mà đó bỏn sản phẩm này tới

hàng chục nước khỏc trờn thế giới,trong đú cú nước ta, nhưng giỏ thành cũn cao, nờn việc ứng dụng cũn hạn chế

Một vài số liệu về bệnh E.Coli

Bảng 4;

Mức độ ô nhiễm E.Coli trong phân lợn bị tiêu chảy

TT Địa điểm Số mẫu Số mẫu dương Tỷ lệ Ghi chú

1 Hoàng tây 20 18 90,0

2 Vĩnh sơn 20 17 85,0

3 Tam đảo 15 13 86,67

4 An khánh 15 12 80,0

Bảng 5:

Tình hình dịch tễ bệnh ,bệnh phân trắng , tiêu chảy do E.Coli

năm 2005 – 2006 ở lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi

B¶ng 7 :Tû lÖ lîn bÞ bÖnh phï ®Çu theo løa tuæi

§Þa ®iÓm SS –

21

ngµy tuæi

ngµy tuæi

21 -

45

45 ngµy

Tû lÖ Sè

con

®.tra

Sè con bÖnh

Tû lÖ Sè

con

®.tra

Sè con bÖnh

TÍNH ƯU VIỆT CỦA KHÁNG THỂ IgY SO VỚI KHÁNG THỂ IgG

Kháng thể thường được dùng để nghiên cứu, chẩn đoán và điều trÞ Mặc dù trên thực tế là gà được miễn dịch truyền các globulin miễn dịch (immunoglobulin) từ huyết thanh của gà mẹ vào lòng đỏ trứng (yolk) đã được công nhận từ hàng trăm năm nay Tuy nhiên, chỉ trong một thập niên gần đây nhất mới lôi cuốn sự chú ý của các nhà nghiên cứu

Thay vì trước đây phải lấy máu hoặc giết con vật được miễn dịch để thu kháng thể thì thì bây giờ chỉ cần nhặt trứng để tách kháng thể từ lòng đỏ trứng

Làm như vậy sẽ thu được lượng kháng thể lớn hơn và tinh khiết hơn Vì vậy, gà được công nhận là nhà máy sản xuất kháng thể thế hệ mới

A-Cấu trúc và đặc điểm IgY của loài chim (bird)

và IgG của loài có vú (mammal)

Từ năm 1969, Leslie và Clem đã nghiên cứu sự khác nhau giữa IgY từ lòng

đỏ trứng và IgG của loài có vú , nên đề xuất thuật ngữ IgY cho loài chim

Cấu trúc đại cương của phân tử IgY cũng giống như IgG có hai chuỗi nặng (heavy chain) với trọng lượng phân tử là 60 - 70 kDa mỗi chuỗi và 2 chuỗi nhẹ (light chain) với trọng lượng phân tử là 25 kDa mỗi chuỗi (hình 1) Sự khác nhau chủ yếu là số vùng bất biến trong chuỗi nặng : IgG có 3 vùng còn IgY có 4 vùng ,

do đó trọng lượng phân tử của IgY lớn hơn so với IgG tương ứng 180 kDa so với

150 kDa (Warr G W et al, 1995; Davalos et all., 2000)

B- Ứng dụng của kháng thể IgY

Do sự khác nhau trong cấu trúc của kháng thể IgY so với IgG, nên IgY có nhiều ưu việt để ứng dụng trong chẩn đoán, nghiên cứu, công nghệ sinh học không những cho y tế mà cả trong thú y

Hình 1 Cấu trúc kháng thể IgG & IgY Chú thích:

Limited flexibility: vùng biến đổi có giới hạn

A hinge: khớp nối

Chế tạo kháng thể đa dòng IgY bằng các nguồn kháng nguyên khác nhau

1 Human IL-6 yếu tố nghiên cứu

2 Human manose

6-phosphate/insulin-like growth factor-II receptor Nt

4 Canine distemper virus Nt

5 α - subunit of hypoxia-inducible factor

13 Bovine growth hormone and prolactin Nt

21 Rat liver cytosolic casein kinase II nt

22 Newcastle disease virus yếu tố chẩn đoán

23 Campylobacter fetus nt

Kháng thể được chiét tách từ lòng đỏ trứng gà có thể kháng lại hàng loạt kháng nguyên (antigen) với nhiều mục đích khác nhau: miễn dịch huỳnh quang,

kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), điện di miễn dịch và miễn dịch thấm, miễn dịch hóa tế bào và nhiều kỹ thuật khác nữa,

Trong một số trường hợp, nếu dùng IgG sẽ cho kết qủa dương tính giả, trong khi đó nếu dùng IgY sẽ cho kết qủa ưu việt hơn nhiều: không cho dương tính giả

Trong những năm gần đây có nhiều công trình cho biết IgY được sử dụng như kháng thể thụ động bảo vệ người và gia súc chống lại các bệnh dạ dày, ruột thành công, trong lúc đó nếu chữa bằng kháng sinh thì không khỏi IgY còn là công cụ để nghiên cứu ung thư, chẩn đoán và điều trị

Những khiếm khuyết khi chế kháng thể đơn dòng không giải quyết được thì nay nếu dùng tế bào thận của gà đã khắc phục được những nhược điểm này Những công trình đã thành công khi dùng nguồn tế bào thận ở gà miễn dịch để chế kháng thể đơn dòng có thể kể đến như: Nishinaka et al (1991), Haruo Matsuda (1998 - 1999),

C- Một số ưu việt khi sản xuất kháng thể đa dòng từ trứng gà

1 Chỉ cần thu nhặt trứng không cần lấy máu hoặc giết con vật được gây tối miễn dịch

2 Trong huyết thanh loài có vú có nhiều hormone và vật thể prion gây bệnh

lý tổ chức cho vật nuôi

3 Gà đóng vai trò động vật thí nghiệm hoặc nói cách khác, nó là nhà máy sản xuất kháng thể, rẻ hơn so với động vật có vú

4 Việc gây tối miễn dịch cho gà dễ thao tác hơn nhiều

5 Một lúc có thể gây tối miễn dịch bằng nhiều loại kháng nguyên khác nhau đều mang lại hiệu qủa thu kháng thể đặc hiệu bằng ngần ấy loại kháng nguyên

6 Khai thác kháng thể trong thời gian dài hơn

7 Đặc biệt chữa các bệnh đường ruột không những cho thú y mà cho người

đem lại hiệu quả cao, hơn hẳn các kháng sinh truyền thống Vì kháng sinh dễ bị

nhờn thuốc, còn kháng thể thì không, do có tính đặc hiệu cao

8 So sánh với việc sản xuất kháng thể đa dòng ở động vật có vú thì sản xuất

kháng thể từ lòng đỏ trứng thu hoạch được một lượng kháng thể cao hơn nhiều với

giá thành hạ (bảng 2) (Moca Narat, Cộng hòa Sec, 2003)

thu được

200 mg 1120 mg (trung bình 80

mg/ trứng) Lượng kháng thể đặc hiệu 5% (10 mg) 2 - 10% (22,4 - 112 mg)

Có mặt các kháng thể khác IgM, IgA, IgE Không có

Kháng thể qua đường ruột bị mất đi một lượng không nhỏ Để khắc phục

nhược điểm đó và để kháng lại môi trường acid cao trong ruột , nhiều tác giả đề

xuất bọc kháng thể bằng liposome (Shimizue et al, 1993)

Từ thực tế trên, Hội thú y đã phối hợp với Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh

học Thú y (BTV.JSC.) chế tạo thành công hai dạng kháng thể từ lòng đỏ

trứng: dạng đông khô và dạng bột Đây là các kháng thể nhị giá không những

phòng trị được bệnh do E coli gây ra cho lợn, mà còn phòng trị được bệnh tụ

huyết trùng lợn Các chế phẩm nµy đã được kiểm nghiệm thành công tại

Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y quốc gia Kết quả thử nghiệm trong sản

xuất tại Hà Nội, Vĩnh phúc và Hà Tây đạt hiệu qủa khả quan

Tính cấp thiết phải chế kháng thể :

Như phần trên đã trình bày :việc sử dụng kháng sinh không đúng quy định, không những gây hậu quả tăng tính kháng thuốc của vi khuẩn , mà còn gây tồn dư kháng sinh trong thực phẩm làm tổn hại sức khoẻ cộng đồng Trong 162 mẫu thận lợn được kiểm tra dư lượng kháng sinh và hoá dược có tới 69 dương tính Số mẫu chứa Streptomycin và penicillin là 54% và 0,8%

Một số tác giả của Trung tâm vệ sinh thú y Quốc gia đã xét nghiệm một

số mẫu gan, thận lợn bán ở thị trường về dư lượng kháng sinh & hoá dược cho kết quả đáng lo ngại, đó là hầu hết các mẫu đều chứa Penicillin, Streptomycin, Sulfonamides

Hiện nay , trên thế giới đã ra thông cáo cấm sử dụng một số kháng sinh, hoá dược cho động vật nuôi làm thực phẩm như: Nitrofuran, Ronidazon, Chloramfenicol, Furazolidon

Do sự đòi hỏi cấp bách của thực tế Công nghệ sinh học đã ra đời và đã

mở ra hướng nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm sinh học trong nhân y và thú y

Từ những thông tin trên cho thấy rằng việc sử dụng chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong biện pháp phòng trị bệnh cho vật nuôi là cầp bách và thiết thực

Từ lâu, ở nước ta cũng đã sản xuất kháng huyết thanh trên ngựa phòng

và trị bệnh tụ huyết trùng Do giá thành đắt nên chỉ dùng để phòng và trị cho một số giống lợn quý (lợn đực, lợn nái giống ngoại siêu nạc) Hơn nữa số lượng kháng huyết thanh sản xuất trên ngựa bị hạn chế, không cung cấp đủ cho nhu cầu của sản xuất Vì vậy, không ứng dụng được rộng trong sản xuất Hiện nay, các nhà khoa học của nước ta đã chế tạo thành công các kháng thể dạng thô từ trong lòng đỏ trứng gà được tối miễn dịch phòng chống các bệnh: Newcaste, Gumboro, dịch tả vịt, viêm gan vịt, E.Coli hữu hiệu và đã thành thương phẩm,song cũng còn một số hạn chế Do đó đề tài này cần chế tạo

được một loại kháng thể tinh khiết hơn, ở dạng tiêm ,cũng như ở dạng bột để phòng và trị bệnh nói trên ở lợn , góp phần hạn chế những tổn thất của ngành chăn nuôi lợn và tạo thực phẩm an toàn, sạch không tồn dư kháng sinh phục

vụ tốt sức khoẻ cộng đồng

14 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh tụ huyết trùng ( THT ) lợn được phân bố rộng khắp thế giới ở Châu

Âu: Nga, Đức, Phần Lan, Anh, Hungary, Tiệp Khắc… ở châu á: ấn Độ, Pakixtan, Malaysia,Srilanka, Philepine, Trung Quốc, Việt Nam, Lào… ở châu Mỹ: Argentina, Peru, Mexico, Mỹ,… Ngoài ra bệnh còn phát hiện ở nhiều nước khác thuộc châu Phi Như vậy, bệnh đã xuất hiện ở khắp nơi trên thế giới (De Alwis, 1982, 1993 ).Việc phòng chống bệnh này vẫn còn là vấn đề thời

sự ở nhiều nước

Việc chế kháng thể từ lòng đỏ trứng gà đã có khá nhiều công trình như:ở Nhật, kết quả nghiên cứu Yokoyama, H và CS cho thấy các tác giả đã sử dụng kháng thể chiết tách từ lòng đỏ trứng của gà đã được tối miễn dịch bằng các chủng E.coli gây bệnh ở lợn con để phòng và trị bệnh tiêu chảy, lợn con được

điều trị tỷ lệ khỏi bệnh cao Kháng thể thụ động đã khống chế được chủng E.coli độc không còn điều kiện để gây bệnh, không gây loạn khuẩn (Yokoyama.H và CS 1992)

Theo Antino Verdoliva và CS ở Italy đã tinh khiết các immunoglobulin

từ lòng đỏ trứng của gà mái đã được tối miễn dịch để phòng trị bệnh cho gia súc non Bằng các thí nghiệm đối chứng, các tác giả cho rằng kháng thể tạo ra

từ lòng đỏ trứng cao hơn nhiều kháng thể được tạo ra từ động vật có vú

Theo Burnet F.M.Fenner.F (1949) ở Mellourne người ta đã sản xuất kháng thể để phòng và trị bệnh do virút gây ra

Theo Yolken M.H và cộng sự (1993) ở Đức đã phát hiện khả năng mới nghiên cứu rộng rãi việc sử dụng kháng thể đặc biệt trong lòng đỏ trứng để chữa hội chứng tiêu chảy của bê nghé đạt hiệu quả cao

Tác giả Yolken R.H, Leister.F cộng sự (1988) đã nghiên cứu kháng thể kháng rotavivus có trong lòng đỏ để dùng điều trị cho người bị tiêu chảy do rotavivus gây ra

Liệt kê danh mục một số công trình nghiên cứu chủ yếu có liên quan

1

Akita E.M,Nakai S.( 1992 ) Comparision of four puification methods for the production of immunoglobins from eggs laid by hens immunized with an Enterotoxigenic E.Coli strains.J.Immun.Method 160:2,207-214,21 ref.,Nhật

2

Antinio Verdoliva, Giancarlo Basile, Giorgio Fassina Science Park,

81015 Piana di Monte verna (CE), Italy

Affinity purification of immunoglobulin from chicken egg yolk using

a new Synthetic ligand

3 Burnet F.M, Fenner F (1949) The Production of Antibodies

Maemillan, Mellbourne

Hiện nay Immunology Research Institute, GHEN Corporation, Japan đã chế tạo thành công các dạng kháng thể có tên gọi là GLOBIGEN phòng chống các bệnh cho bê như: Bovine Rotavirus, Bovine Coronavirus, Salmonella typhimurium, Sal.dublin, Escherichia coli K99 và cho lợn con như: Porcine Rotavirus, TGE virus, PED virus, E.Coli K88, E.Coli K99, E.coli 987P, E.Coli F18 Tất cả những chế phẩm này đã trở thành thương phẩm bán rộng rãi trên thị trường

Cũng như vậy ở nhiều nước (Ji – Hyun Shin Mierha Yang và CS Hàn Quốc; Mary vasantha Bai và CS ấn Độ; Gieri Camenisch Mauro Tini và cCS Mỹ; Riidigh Sohade; Bela Nagy và CS Hungary; Christian Staak và CS.,Italy) đã sử dụng IgY có trong lòng đỏ trứng gà được tối miễn dịch phòng các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virut, vi trùng gây ra đạt hiệu quả cao, đã ngăn chặn những hiểm hoạ do dịch bệnh gây ra, làm giảm tính kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh, tạo được thực phẩm an toàn, sạch không tồn dư kháng sinh Đây

là xu thế mới trong phòng trị bệnh hiện nay Và động vật được coi như nhà máy tạo kháng thể với giá thành hạ: đó là gà Hướng nghiên cứu ứng dụng này rất thiết thực đã và sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao

Từ những thụng tin trờn càng thấy rừ tớnh ưu việt của khỏng thể IgY , như vậy việc chế khỏng thể từ lũng đỏ trứng gà là đỳng hướng và cấp thiết

General applicability of chicken egg yolk antibodies: the performace

of Ig Y immunroglobins against the hypoxia – inducible factor

6

Kuhlman R, Wiedermann V, Schmidt P, Wanke R, Linckh E, Losch U (1988): chicken egg antbodies for profylaxis and therapy of infectious intestinal diseaes I Immanization and antibody determination.J.vet.Med.B35, p 610 – 616

7

Ji – Hyun Shin, Mierha Yang et al …1993 , Korea University Colledge

of life & Environmental Sciences, Seuol, Korea

Use of Egg Yolk – Derived Immunoglobulin as an alternative to Antibiotic Treatment

Oral Passive Immunization Using Chicken Egg Yolk

Immunoglobulins (IgY) Against Infectious Diseases

11 Yamaguchi K,Kumagai S.( 1996 ) Immune funtions of IGY isolated from

egg yolk of hens

12

Yokoyama.Hm Robert C Peranta, Roger Diaz, Sadako Sendo, Ytaka Ikenmori and Yoshikatsu Kodama (1992) Passive Protictive effect of chicken Egg Yolk Immunoglobulins against E.Coli

13

Yolken R.H, leister F, Wee.S.B, Miskuff R and vonderfecht.S (1988) Antibodies to rotaviruses in chicken egg, a potential source of antiviral immunoglobulins suitable for human consumption Pediatics Vol 81, p291 – 295

14 Lê Xuân Cương và CS.,1986 Kết quả dùng gamma globulin phòng bệnh

phân trắng lợn con theo mẹ Tạp chí KHKT nông nghiệp, số1 tr.36-40

15

Phan Thanh Phượng, Phạm Công Hoạt, 2003 ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu chế tạo và giám định kháng thể ANTI-WSD phòng bệnh đốm trắng cho tôm sú Tạp chí KHKT thú y, Tập X, số 4 tr.61-66

16

Lê văn Tạo, Nguyễn Ngã và CS., 2001, Nghiên cứu sản xuất kháng thể khác loài từ lòng đỏ trứng phòng trị bệnh Colibacillosis cho lợn con, Tạp chí KHKT thú y, Tập 8, số 1.tr.20-26

17

Tạ thị Vịnh và CS., 1994, Thử nghiệm chế phẩm huyết thanh siêu mẫn trên lợn con mới sinh để nâng cao khả năng phòng bệnh phân trắng lợn con Tạp chí KHKT thú y, số 3, tr.63-66

18

Đặng Xuân Bình,Trần thị Hạnh,Lê văn Tạo ,2004, Nghiên cứu chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng gà và hiệu quả điều trị tiêu chảy do E.Coli ở lợn con theo mẹ Tạp chí KHKT thú y, Tập XI, số1, tr.57-60

19

Đinh Xuõn Phỏt ; Nguyễn Ngọc Hải ,2005 Khảo sỏt khả năng sinh khỏng thể khỏng E.Coli khỏc loài trong lũng đỏ trứng gà.T.chớ KHKT nụng lõm nghiệp số 2 – 3/2005 ĐH nụng lõm Tp HCM

15 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ ứng dụng (luận cứ

và cách tiếp cận Thiết kế nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ ứng dụng - so sánh với các phương thuốc giải quyết đương sự khác, nêu được tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo của đề án)

- Đó khảo sát tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng & E.Coli ở Việt Nam hiện nay

để xây dựng điểm tiếp nhận và thử nghiệm chế phẩm trong thực tế sản xuất

- Tiếp thu công nghệ cao tách chiết IgG từ kháng thể có trong lòng đỏ trứng của

gà được tối miễn dịch để nâng cao hàm lượng kháng thể có trong chế phẩm và giảm liều lượng sử dụng cho gia súc, tạo hiệu quả cao và thuận lợi cho người sử dụng trong phòng trị bệnh với giá thành hạ

- Tiếp thu tạo đa dạng chế phẩm, chọn dung môi thích hợp , để chế tạo kháng thể nhằm nâng cao công hiệu của chế phẩm trong phòng và trị bệnh,đồng thời, dựng những húa dược dễ kiếm tại Việt nam nhằm hạ giá thành sản phẩm

- Khác với các tác giả đã làm trong nước: Trước đây các tác giả thường chiết tách kháng thể từ huyết thanh ngựa được tối miễn dịch, nên số lượng kháng thể thu được ít; đồng thời, giá thành khá cao, nên tính ứng dụng thấp, đầu ra kém Hiện nay có nhiều tác giả nước ta, đã chế tạo thành công kháng thể từ lòng đỏ trứng gà, nhưng theo công nghệ đơn giản: lấy cả lòng đỏ của trứng đã tối miễn dịch, vì chưa chiết tách được kháng thể ra khỏi lòng đỏ, làm hàm lượng kháng thể trong chế phẩm không cao Buộc người tiêm phải dùng một liều tiêm rất cao (thí dụ: tiêm cho 1 lợn con 10kg 40ml kháng thể), mới có đủ lượng kháng thể phòng trị được bệnh Người sử dụng khó chấp nhận liều cao như vậy Do đó, đề tài này chủ yếu giải quyết 2 vấn đề; Thay đổi công nghệ chế tạo nhằm nâng cao hiệu quả của chế phẩm với liều tiêm thấp và làm giá thành sản phẩm hạ, tạo điều kiện thuận lợi cho ứng dụng rộng rãi trong sản xuất Đề tài đã chế tạo được hai dạng kháng thể : Dạng bột và Dạng đông khô Dạng bột cho uống hoặc trộn với thức ăn với liều phòng bệnh 5g/ngày / con ;liều điều trị 10g /ngày/ con Dạng

đông khô pha với nước cất tiêm dưới da với liều phòng bệnh 0,5ml/ngày con ,với liều điều trị 1-2ml /ngày /con

* Phương pháp nghiên cứu

1 - Xác định hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng bằng phương

pháp phương pháp IHA hoặc HI (sau khi gây miễn dịch cơ sở)

- Xác định hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng bằng phương pháp IHA hoặc HI (sau khi gây tối miễn dịch)

2 Xác định tương quan giữa hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh gà và

lòng đỏ trứng của gà được tối miễn dịch bằng phương pháp IHA hoặc HI

3 Tách chiết kháng thể IgY dịch từ lòng đỏ trứng gà thu từ gà mái được

tối miễn dịch bằng công nghệ cao

16 Nội dung nghiên cứu:

16.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng lợn & E.Coli ởViệt Nam,

khảo sát tình hình dịch bệnh hiện nay để chọn điểm thực nghiệm ( như phần trên đã trình bày )

16.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với THT lợn & E.Coli trên đàn gà đẻ

Đã xác định thời gian tồn tại kháng thể thụ động trên cơ thể động vật thí nghiệm Sau khi sử dụng kháng thể qua 10 ngày,15 ngày ( kháng thể dạng bột ), qua 20 ngày ( kháng thể đông khô ) hiệu giá kháng thể thụ động tồn tại trong cơ thể động vật thử nghiệm đạt ở mức khá cao, đều trên ngưỡng bảo hộ ( trên 5log2 )

Đã xác định chế độ bảo quản chế phẩm ở các nhiệt độ có thể áp dụng tại các cơ sở chăn nuôi ở nước ta

- Nhiệt độ 40c – 100c

Chế phẩm dùng được 1 năm

16.3 Đã nghiên cứu tách chiết IgG từ kháng thể THT và E.Coli có trong lòng

đỏ trứng bằng công nghệ cao

16.4 - Đã thử nghiệm chế phẩm trong phòng và trị bệnh THT trong phòng thí

nghiệm và trong thực tế sản xuất

- Sử dụng vào những vùng không an toàn dịch bệnh, hoặc có nguy cơ nhiễm bệnh.Đã sử dụng 126,9 kg kháng thể dạng bột (hơn gấp 15 lần khi

đăng ký – 8kg ) và 1187liều kháng thể đông khô (nhiều hơn khi đăng ký – đăng ký 1000 liều )

Nội dung nghiên cứu các mục 16.2 , 16.3 ,16.4 được trình bày chi tiết trong Phần II – Kết quả nghiên cứu khoa học

17 Nội dung và kế hoạch hợp tác với đối tác nước ngoài:

- Đoàn chuyên gia của Việt Nam được cử đi Hungary khảo sát, nghiên cứu, học tập tại Khoa miễn dịch - Trường Đại học Budapest gồm 4 người Thời gian 8 ngày Đoàn đã tiếp thu tốt những kiến thức hiện đại Đã chế kháng thể thành công từ lòng đỏ trứng gà bằng công nghệ mới

Nội, Hà Tây và Vĩnh Phúc nhằm chọn điểm thực

nghiệm :ứng dụng kháng thể vào những đàn lợn

có nguy cơ nhiễm bệnh THT & E Coli

7 – 12 /2006

-TT chuyển giao, KHCN và tư vấn sản xuất thuốc thú y.Hội thú y -Chi cục thú y:

Hà nội ,Hà tây,Vĩnh phúc

2

Tình hình tiêm phòng vacxin THT của các tỉnh,

thành phố nói trên ở Việt nam (tài liệu Cục thú y

và của các Chi cục thú y)

7 – 12

2006

-TT chuyển giao, KHCN và tư vấn sản xuất thuốc thú y

-TT CG KHCN

& TV SX

5 Tiến hành các nghiên cứu cơ bản về chiết tách IgY

trong phòng thí nghiệm

1 – 12

2006

-Viện thú y QG -Cty BTV.JSC

6 Đồng thời gây tối miễn dịch kháng THT& E Coli

cho đàn gà đẻ trứng

8 -12

2006

-Cty BTV.JSC -TT CG KHCN

7

Xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và

trong trứng của đàn gà được gây miễn dịch cơ sở và

gây tối miễn dịch tụ huyết trùng lợn & E.Coli

9 Kiểm nghiệm chế phẩm theo Tiêu chuẩn cơ sở phải

đạt các mặt: An toàn (nơi tiêm và toàn thân) Hiệu

lực: phòng và trị bệnh trên bản động vật (xác định

liều lượng và liệu trình điều trị) Vô trùng: Chế phẩm

tạo ra phải vô trùng ở các dạng: Thuốc tiêm dạng

11 Hoàn thiện công nghệ chế tạo theo công nghệ mới 8 / 2007 -Viện thú y QG

14 Thử nghiệm thời gian bảo quản chế phẩm ở t

Hà nội,Hà tây,Vĩnh phúc

16

Xây dựng quy trình hướng dẫn sử dụng kháng thể

mới có hiệu quả nhất

11 / 2007 -Viện thú y QG

-Hội thú y VN -Cty BTV.JSC

17 Hoàn thiện quy trình hướng dẫn sử dụng kháng thể

trong đại trà sản xuất

11 / 2007 -Hội thú y VN

-Cty BTV.JSC

18 Viết báo cáo, tổ chức tổng kết, đánh giá, nghiệm thu

kết quả, đề xuất các bước thực hiện tiếp theo

12 / 2007 Hội thú y VN

Nhận xét : Đề tài đẫ tiến hành đúng tiến độ như trên

Ngầy 16 /05 /2008 đề tài đã tiến hành nghiệm thu

cấp cơ sở.Trong tháng 06 – 07 / 2008 sẽ nghiệm thu

cấp Nhà nước.Như vậy đề tài kết thúc đúng thời hạn

như Hợp đồng đã ký

III Kết quả của nhiệm vụ

19 Dạng kết quả dự kiến của nhiệm vụ (đánh dấu

20 Yêu cầu học đối với sản phẩm tạo ra (dạng kết quả II, II)

II Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học Chú thích

và kháng thể dạng bột

2 Tiêu chuẩn TCCS Sản phẩm chế tạo ra phải đạt

- Hiệu giá kháng thể của chế phẩm đã chế tạo

- Trình bày chi tiết và phân tích kết quả đạt đ−ợc

Có 2 báo cáo :

-Số liệu -Kết quả

4 Các bài báo/báo cáo khoa học - Xây dựng quy trình chế tạo

nghiên cứu kháng thể kháng THT & E.Coli

- Kết quả chất l−ợng của sản phẩm và hiệu quả trong phòng

kháng thể

Vô

trùng,

an toàn, hiệu lực cao

22 Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu

(Nêu tính dự định của thông số công nghệ, ghi địa chỉ khách hàng và mô tả thức chuyển giao kết quả…)

* Các kết quả nghiên cứu được cả hai bên cùng sử dụng

* Công nghệ chế tạo kháng thể THT sẽ được ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở chăn nuôi lợn để phòng chống bệnh truyền nhiễm nguy hiểm: tụ huyết trùng lợn ở Việt Nam thông qua các Chi cục thú y : Hà nội ,Hà tây , và Vĩnh phúc chuyển giao đến tận tay các hộ chăn nuôi điển hình ở các địa phương nói trên

23 Các tác động kết quả nghiên cứu

* Tạo kháng thể dạng mới ,chưa có tại Việt nam.Chất lượng đạt vô trùng, an toàn và có hiệu lực cao trong phòng trị bệnh THT & E.Coli, góp phần hạn chế tổn thất kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn

* Tạo được thực phẩm an toàn sinh học, sạch, không tồn dư kháng sinh và hoá dược, tạo môi tường sạch , an toàn nhằm bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

IV Các tổ chức/ cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ

24 Hoạt động của các tổ chức phối hợp thực hiện đề án (ghi tất cả tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ và phần nội dung công việc tham gia trong nhiệm vụ, không quá 5 tổ chức mỗi bên)

TT Tên tổ chức Địa chỉ Nội dung hoạt động/đóng góp cho đề tài

A Phía Việt Nam

1 Trung tâm kiểm

nghiệm thuốc thú

y Quốc gia

11/78 đường Giải Phóng-Phương Mai- Đống Đa -

Hà Nội

-Tiếp nhận công nghệ tách chiết và ứng dụng kháng thể mới vào sản xuất

-Theo dõi thực nghiệm tại các cơ sở chăn nuôi

3 Viện thú y Quốc

gia

86 đường Trường Chinh q.Đống đa,

Hà nội

Hợp tỏc xỏc định HGKT chế phẩm đó tạo ra

4 Các Chi cục thú y Hà nội, Hà Tây,

- Tiếp nhận công nghệ chế tạo kháng thể bằng công nghệ mới ,đa dạng sản phẩm : dạng đông khô, dạng bột

- ứng dụng kết quả vào sản xuất cùng với các chi cục thú y tham gia hoàn thành Nhiệm vụ này

21, Hungary

Tel:3613110691

Fax:3611113849

H-1103 Budapest Gergely U.79., Hungary

- Chuyên gia Hungary tư vấn trao đổi kinh nghiệm cựng với chuyên gia Việt Nam, phát triển ứng dụng công nghệ tách chiết IgY và chế tạo các dạng sinh phẩm (thuốc tiêm và thuốc bột) phòng bệnh với giá thành hạ, tạo điều kiện thuận lợi cho ứng dụng rộng trong thực địa

Đội ngũ cán bộ thực hiện nhiệm vụ

(Ghi những người có đóng góp chính thuộc tất cả tổ chức chủ trì và tham gia

đề tài, không quá 6 người)

6 BSTY Hoàng Triều TT chuyển giao công nghệ & tư

vấn Hội thú y Việt nam 6 tháng

B Phía đối tác nước ngoài

Fax:3611113849

2 Prof Laszlo Fodor H-1400 Budapest P.O.Box-2

3 Prof Dr.Scheiber Pal

Department.of Immunobiochemics - College of Veterinary Medicine,Budapest Hungary

Liên kết với sản xuất và đời sống:

- Các Chi Cục thú y Hà nội, Hà tây, Vĩnh phúc phối hợp sử dụng kháng thể đã chế được có hiệu quả cao trong thực tế sản xuất của 3 địa phương nói trên

- Người sử dụng: Là các hộ chăn nuôi điển hình của địa phương

- Các dạng kháng thể tạo ra (dạng tiêm, dạng uống, dạng trộn thức ăn) tạo điều kiện cho người chăn nuôi lựa chọn phù hợp cho phương thức chăn nuôi của mình,

Kết quả nghiên cứu khoa học ( Trình bày tóm tắt các thí nghiệm )

Thí nghiệm I

Khảo sát CHẤT LƯỢNG CÁC CHỦNG TỤ HUYẾT TRÙNG VÀ E.COLI DÙNG ĐỂ CHẾ KHÁNG THỂ CHO LỢN

Một trong những khõu tối quan trọng để hiệu giỏ khỏng thể đạt mức độ cao

là chất lượng cỏc khỏng nguyờn dựng để chế khỏng thể Vỡ vậy trước khi chế khỏng thể chỳng tụi tiến hành khảo sỏt cỏc khỏng nguyờn dựng trong nghiờn cứu này

Chủng THT lợn: Trong đề tài này đã sử dụng chủng FgHC Đõy là chủng

Quốc gia ,nờn chất lượng bảo đảm khụng cần cỏc khảo sỏt đặc biệt

Cỏc chủng E.Coli : Vỡ cỏc chủng E.Coli tự phõn lập, được giỏm định bằng

cỏc khỏng huyết thanh mua của nước ngoài, để cú cơ sở sử dụng đó chế sinh phẩm 88-99 nhằm khảo sỏt tớnh sinh miễn dịch của cỏc chủng E.Coli trờn

bản động vật trước khi tiến hành chế khỏng thể cho đề tài được giao

Khảo sỏt tớnh sinh miễn dịch của cỏc chủng E.Coli:

#1- Chế sinh phẩm 88 & 99: Đó dựng cỏc chủng K88 ,K99 và 987P để chế sinh

phẩm 88 – 99.Từng chủng riờng rẽ được nuụi cấy trờn thạch BHI Sau 24 giờ nuụi cấy , kiểm tra thuần khiết, nếu đạt yờu cầu, thu hoạch ngay

Kiểm tra đậm độ CFU trong canh trựng vừa thu hoạch.,dựa trờn số liệu này chuẩn

độ sinh phẩm 88 & 99 để làm sao cứ 1ml sinh phẩm cú chứa 4,5 – 5,0 triệu CFU.Sinh phẩm được vụ hoạt bằng 0,5% formol và bổ sung 20% keo phốn

#2- Khảo sỏt hiệu lực miễn dịch của sinh phẩm 88 & 99:

Đã sử dụng phương pháp thay thế - phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để

đánh giá hiệu lực miễn dịch của sinh phẩm 88 & 99

#3 Gây miễn dịch bằng sinh phẩm 88-99

-Tiêm bắp lần 1 với liều 1ml/con

-Tiêm bắp lần 2 sau 10 ngày với liều 2ml/con

- Sau khi tiêm Sinh phẩm 88-99 tiến hành theo dõi tỷ lệ mắc bệnh/khỏi bệnh,

tăng trọng, thân nhiệt con vật, xác định biến động l−ợng kháng thể trong huyết

thanh lợn đ−ợc tiêm sinh phẩm 88-99 qua 15, 22 và 35 ngày

- Số lần lấy máu xét nghiệm đối với lợn tiêm sinh phẩm : 03 lần

Kết quả thực nghiệm sinh phẩm 88-99

Bảng 2 :Khảo sát biến động hiệu gia kháng thể trong máu

sau khi tiêm sinh phẩm 88-99

TT Thời điểm lấy

mẫu sau tiêm

HGKT lợn TN HGKT lợn ĐC Ghi chú

1 15 ngày 7,16 log2 ± 0,1 3,5log2 ± 0,1

2 22 ngày 7,50 log2 ± 0,1 3,5log2 ± 0,1

3 35 ngày 10,0 log2 ± 0,2 3,6log2 ± 0,1

Đàn tiêm sinh phẩm sau 15 ngày đã xuất hiện kháng thể và tăng dần đến 35 ngày

sau tiêm.Chứng tỏ sinh phẩm 88 – 99 đã gây ra một đáp ứng miễn dịch khá mạnh :

Khảo sỏt cỏc chỉ tiờu khỏc:

- Phản ứng sau khi tiêm

- Thân nhiệt sau khi tiêm

- So sánh tăng trọng của 2 đàn thí nghiệm và đối chứng

Thí nghiệm II

Xây dựng quy trình chế tao kháng thể từ lòng

đỏ trứng gà bằng công nghệ mới

1 Địa điểm : - Viện thú y

- Viện vệ sinh dịch tễ