Bài viết nghiên cứu chế tạo kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo đơn giá và gây miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể đơn đặc hiệu đóng vai trò quyết định trong sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn Hổ mèo.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH TẠO KHÁNG HUYẾT THANH NGỰA ĐƠN ĐẶC HIỆU KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TẠI VIỆT NAM Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xn Kiếm**; Hồng Anh Tuấn*** TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu chế tạo kháng nguyên (KN) nọc rắn Hổ mèo (RHM) đơn giá gây miễn dịch cho ngựa tạo kháng thể (KT) đơn đặc hiệu đóng vai trò định sản xuất huyết kháng nọc (HTKN) RHM Phương pháp: chế tạo KN nọc RHM từ nọc tổng số theo phương pháp giảm độc lực, gây miễn dịch cho ngựa theo phương pháp tiêm da nhiều mũi liều thấp nhắc lại nhiều lần Kết quả: tạo 300 ml KN chuẩn, xác lập lịch trình gây miễn dịch thành công cho ngựa thu huyết tương có KT đặc hiệu làm nguyên liệu chế tạo HTKN RHM đơn đặc hiệu Kết luận: tạo KN chuẩn gây miễn dịch thành công cho ngựa thu huyết tương có KT đặc hiệu * Từ khóa: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis); Kháng nguyên nọc rắn Hổ mèo; Huyết kháng nọc rắn Hổ mèo Study of Antigen Production and Immunization Created Horse Monospecific Antiserum Against Indochinese Spitting Cobra (Naja siamensis) Venom in Vietnam Summary Objectives: To prepare Naja siamensis (NS) monovalent antigen and to immunize horse for the production of NS monospecific antibody Methods: NS monovalent venom antigen was prepared from whole venom by detoxification method; horse hyper-immunization was done by subcutaneous multiple site and repeated low dose injections Results: 300 ml of standard antigen was prepared, immunization for horse against NS venom and collected hyperimmune was established succesfully Horse plasma containing specific antibody has been obtained as a material for NS monospecific antivenom production Conclusion: NS standard antigen has been succesfully prepared and used for immunization of horse to produce specific antibody in horse plasma * Key words: Naja siamensis; Naja siamensis antigen; Naja siamensis antivenom ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn mối hiểm họa cho quốc gia phát triển vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á Mỹ Latinh, có Việt Nam Năm 2008, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp bệnh lý rắn độc cắn vào bệnh lý “Nhiệt đới bị lãng quên” [8] * Bệnh viện FV ** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn *** Học viện Quân y Ngi phn hi (Corresponding): Lê Khắc Quyến (lekhacquyen@yahoo.com) Ngy nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/01/2015 Ngày báo đăng: 29/01/2015 43 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Việt Nam quốc gia giới sản xuất điều trị HTKN rắn Hổ từ nghiên cứu A Calmette Viện Pasteur Sài Gòn năm 1894 [5] Hơn 100 năm sau, Việt Nam chưa tự sản xuất HTKN rắn Ước tính có đến 30.000 trường hợp bị rắn cắn năm Từ năm 1990, Trịnh Xuân Kiếm CS nghiên cứu phát triển kỹ thuật sản xuất HTKN rắn [2, 4] Hiện có loại HTKN rắn Chàm quạp, Hổ đất, rắn Lục, Cạp nia Hổ chúa Tỷ lệ tử vong giảm từ 19,5% lúc chưa có huyết xuống 3,1% sau điều trị HTKN đơn đặc hiệu [4] Rắn Hổ mèo thường gây tai nạn cho bệnh nhân (BN) sinh sống vùng Đông Nam Bộ, nhiều trường hợp tử vong để lại thương tật nặng nề cắt cụt chi da rộng gây sẹo co rút khả lao động Việc điều trị chủ yếu điều trị triệu chứng chưa có HTKN đặc hiệu [6] Nghiên cứu sản xuất HTKN RHM cần thiết yêu cầu cấp bách vấn đề cứu chữa người bị RHM cắn Do đó, yêu cầu đặt chế tạo KN, xác lập quy trình lịch gây miễn dịch cho động vật lớn ngựa để tạo huyết ngựa có KT kháng nọc RHM với hiệu giá cao, làm nguyên liệu tiến tới sản xuất HTKN RHM Việt Nam ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Rắn Hổ mèo: 50 cá thể thu nhận điều kiện tự nhiên khu vực miền Đơng Nam Bộ, kích thước từ 0,2 - 1,5 m, 44 nặng từ 100 g - 2,5 kg, màu vàng nhạt oliu màu vàng nhạt trắng Rắn bạnh mang phun nọc độc xa tới m Mặt lưng cổ phình mang có vòng tròn nối với theo hình chữ U V: mắt kính khơng có gọng kính, phía mang vùng bụng có đốm đen - khoang đen Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis) - Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùng để gây miễn dịch Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu - Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd 20%, methanol, thạch agarose, thuốc nhuộm coomasie blue 0,025%, axit acetic, máy đo pH, lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủ ấm, phiến kính, nước cất vơ trùng, kim tiêm vơ trùng - Môi trường cấy vi khuẩn Sabouraud, thioglycolat nấm - Tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete Freund Adjuvant - CFA) tá chất Freund khơng hồn chỉnh (Incomplete Freund Adjuvant - IFA) (Hãng Sigma, Mỹ) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm phòng thí nghiệm động vật * Thu nhận nọc rắn: Thu nhận nọc RHM theo hướng dẫn Tổ chức Y tế Thế giới phương pháp kích thích học vào hai bên tuyến nọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng Trộn hỗn hợp nọc 50 cá thể rắn để bảo đảm tính đại diện lồi địa phương phân bố rắn [8] Ly tâm bỏ cặn hỗn hợp nọc, sau bảo quản -20ºC liên tục đến sử dụng * Chế tạo KN: Chế tạo KN nọc RHM đơn giá theo kỹ thuật khử nọc rắn độc dung dịch glutaraldehyd, sau dùng phương pháp nhiệt để tạo KN đặc hiệu [8] Kiểm định tính vơ trùng KN nọc RHM xét nghiệm vi sinh thường quy * Gây miễn dịch cho ngựa: Được thực theo kinh nghiệm sản xuất HTKN rắn Hổ đất Trịnh Xuân Kiếm CS (1997) [4] hướng dẫn WHO (2010) [8] Ngựa gây miễn dịch cách tiêm da lặp lại nhiều lần liều thấp KN nọc RHM đơn giá phối trộn với tá chất miễn dịch Freund hồn chỉnh khơng hồn chỉnh, tăng dần theo tháng Xác định KT đặc hiệu kháng nọc RHM máu ngựa gây miễn dịch kỹ thuật khuếch tán miễn dịch đơn [1] Bảng 1: Lịch trình miễn dịch, liều lượng KN phối hợp tá chất Liều KN (ml) CFA (ml) IFA (ml) 1 3 5 5 5 5 5 5 5 Tổng số (KN + tá chất) (ml) 10 10 10 10 10 10 10 * Địa điểm nghiên cứu: - Bộ mơn Độc học Phóng xạ Quân sự, Học viện Quân y - Trung tâm Nghiên cứu sản xuất thuốc, Học viện Quân y (Hoà Lạc) - Bộ môn - Khoa Huyết học - Truyền máu, Bệnh viện Quân y 103 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết thu nhận nọc rắn chế tạo KN Pha 30 gr nọc RHM thu nhận từ 50 cá thể rắn dung dịch PBS 10% tạo thành 300 ml dung dịch nọc RHM Khử độc 45 dung dịch nọc glutheraldehyd 20%, sau ủ nhiệt, ly tâm, bỏ cặn, lọc vô trùng, thu 270 ml sản phẩm Sau lấy mẫu cấy khuẩn kiểm tra độ vô khuẩn, chia nhỏ 100 ml sản phẩm sau lọc, đóng lọ nắp cao su với thể tích ml, ml ml Sản phẩm đánh số thứ tự, dán nhãn, ghi ngày sản xuất, tên KN, điều kiện thời gian bảo quản Bảo quản thành phẩm KN đóng lọ sản phẩm lại tủ lạnh -20ºC liên tục đến sử dụng TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Hình 2: KN nọc RHM Kết cấy khuẩn nấm môi trường Sabouraund, thioglycolat theo dõi ngày không thấy vi khuẩn nấm mọc, cho thấy sản phẩm KN nọc RHM đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Kết gây miễn dịch ngựa Sau tiêm KN + CFA với tỷ lệ 1:1 (V/V), lần đến lần thấy ngựa mệt mỏi, yếu, nằm, bỏ ăn Tại chỗ có biểu viêm, sưng tấy tạo áp xe Tiêm lần 2, 3, chỗ xuất vết loét, chảy mủ, dịch Tiêm KN từ lần thứ đến lần thứ 9, ngựa vận động ăn uống bình thường, chỗ bị viêm, loét chảy mủ Trong tất lần tiêm gây miễn dịch, khơng thấy ngựa có biểu rối loạn đơng máu tồn thân suy hơ hấp, có tổn thương chỗ tiêm Bảng 2: Theo dõi ngựa sau lần miễn dịch L Ç n m iƠ n d Þ c h Vận động N g ù a Tồn thân Hơ hấp Tiêu hóa Tại chỗ Tồn thân Vận động Hơ hấp Tiêu hóa Tại chỗ Yếu BT Bỏ ăn Viêm Yếu BT Bỏ ăn Viêm Yếu BT Bỏ ăn Loét Yếu BT Bỏ ăn Loét Yếu BT Bỏ ăn Loét Yếu BT Bỏ ăn Viêm BT BT BT Loét Yếu BT BT Viêm BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét BT BT BT Loét (BT: bình thường) 46 N g ù a TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Kết xác định KT đặc hiệu với KN nọc RHM huyết ngựa ảnh hưởng đến chất lượng sống [6] Sinh hóa học nọc rắn Hổ Trong trình gây miễn dịch theo lịch nghiên cứu kỹ giới trình, theo dõi khả sinh KT đặc hiệu với nước [9] Sự khác biệt loài rắn (Hổ đất, Hổ KN nọc RHM kỹ thuật Ouchterlony cho mèo Hổ mang bành) phân bố địa lý thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với KN nọc rắn khả quan KT đặc hiệu xuất sau lần gây miễn dịch lần gây miễn dịch nhắc lại khác biệt trình tự xếp aminoaxit mtADN Wüster Thorpe chứng minh [10] Vì vậy, nhu cầu cần thiết cấp bách chế tạo HTKN RHM phục vụ điều trị lâm sàng Nghiên cứu chế tạo thành công KN nọc RHM theo hướng dẫn WHO Sản phẩm KN nọc RHM tạo đảm bảo tiêu chuẩn vô khuẩn sinh KT tốt ngựa, đảm bảo hiệu lực an toàn theo tiêu chuẩn yêu cầu [8] - Cùng với việc chế tạo KN nọc RHM, việc gây miễn dịch cho ngựa tạo huyết ngựa có hiệu giá KT đặc hiệu cao, làm nguyên liệu sản xuất HTKN khâu Hình 3: Vết tủa KN nọc RHM KT từ huyết quan trọng Việc tính tốn liều lượng KN, tá ngựa gây miễn dịch chất khoảng cách hai lần tiêm thạch (kỹ thuật Ouchterlony) cho hợp lý, đảm bảo sinh KT tốt mà khơng gây nguy hiểm cho ngựa, giảm chi phí BÀN LUẬN - Rắn Hổ mèo với đặc tính hình dạng khác biệt: màu vàng nhạt oliu, hai mắt kính khơng gọng kính, đặc biệt có khả phun nọc rắn xa (> m) [6, 9] Các triệu chứng nghiên cứu Đây lần xác định lịch miễn dịch cho ngựa KN nọc RHM áp dụng Việt Nam giới Lịch trình gây miễn dịch dựa kinh nghiệm sản xuất HTKN rắn Hổ đất [4] hướng dẫn WHO (2010) [8] Tuy lâm sàng BN bị loài cắn khác nhiên, nọc RHM gây hoại tử chỗ độc biệt với BN bị rắn Hổ đất cắn: khơng có hội tố tồn thân, tim mạch nặng chứng nhiễm độc thần kinh, có nề [3] Vì vậy, nghiên cứu đề quy trình hội chứng nhiễm độc tế bào rối loạn đông khẳng định lịch miễn dịch, liều lượng KN, tá cầm máu nhẹ BN không đáp ứng điều trị chất phù hợp, ngựa đáp ứng sinh KT tốt với huyết kháng nọc rắn Hổ đất làm an tồn Trong đó: tăng tỷ lệ tử vong, để lại di chứng nặng nề, 47 + Thời gian miễn dịch cần - tháng để có KT tốt TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 + Liều KN tăng dần từ - ml, liều KN - Bằng kỹ thuật Ouchterlony, vết tủa KN - đủ lớn để kích thích hệ miễn dịch ngựa tăng KT thạch khẳng định KT đặc hiệu kháng dần Điều dựa nghiên cứu sản xuất nọc RHM hình thành máu HTKN rắn Hổ đất thành công từ năm 1997 [4] Sử dụng liều thấp, tiêm nhiều mũi, nhiều vị trí ngựa, rút ngắn thời gian gây miễn ngựa, lấy máu, sản xuất HTKN RHM từ tháng thứ tháng [1] KẾT LUẬN dịch, tăng hiệu lực HTKN so với phương pháp khác [7] + Sử dụng tá chất Freund hoàn chỉnh (FCA) có chứa BCG tháng đầu, sau tá chất Freund khơng hồn chỉnh (FIA) phát huy hiệu gây miễn dịch ngựa, giúp ngựa tạo KT tốt Kết Nghiên cứu chế tạo thành công KN nọc RHM đơn giá đạt tiêu chuẩn, có chất lượng sinh miễn dịch an tồn Từ sản phẩm này, xác lập quy trình gây miễn dịch ngựa với liều KN nọc RHM tăng khả quan, tương đương với nghiên cứu dần, phối hợp tá chất Freund hoàn chỉnh Spriprapat CS đạt 99,6% đáp ứng miễn khơng hồn chỉnh vừa an toàn cho ngựa, dịch từ ngựa sử dụng tá chất Freund so vừa kích thích ngựa sinh KT tốt Đây tiền với tá chất khác [7] đề quan trọng cho việc - Theo dõi sức khoẻ, tình trạng toàn thân chỗ ngựa miễn dịch với KN sản xuất HTKN RHM đơn đặc hiệu phục vụ cho việc chữa trị BN bị RHM cắn Việt Nam nọc RHM tự chế tạo, thấy: ngựa khơng khoẻ tháng đầu q trình TÀI LIỆU THAM KHẢO miễn dịch, yếu, bỏ ăn, sau thời gian chăm Dược điển Việt Nam IV, Bộ Y tế Huyết sóc tốt hồi phục dần Khơng có triệu kháng nọc rắn Nhà xuất Y học 2009, chứng liệt hô hấp, chứng tỏ liều lượng KN tr.647-648; phụ lục XV, tr.320-325 hợp lý, không gây nguy hiểm cho ngựa Các Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc Quyến, Thái triệu chứng toàn thân tốt dần lên sau Danh Tuyên Rắn độc chế tạo huyết tháng đầu, cho thấy ngựa tạo KT kháng nọc điều trị đặc hiệu Việt Nam Tạp chí chống lại độc tố nọc RHM Sử dụng Y học Việt Nam 2014, (2), tr.34-37 phương pháp tiêm nhiều mũi, rải cổ Trịnh Xuân Kiếm, Trần Thị Ngân, Lê Khắc mông ngựa với số lượng KN nhỏ, tạo Quyến Rắn độc độc tố loài rắn độc miễn dịch tốt an toàn cho ngựa [7] Phản Việt Nam Tạp chí Y học Việt Nam 2014, ứng viêm loét chỗ phù hợp tình trạng (2), tr.72-76 tiêm KN + FCA KN + FIA WHO Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc Quyến, Nguyễn khuyến cáo [8], nọc RHM gây Bá Phước Nghiên cứu sản xuất huyết hoại tử [6] Các vết loét lành sau thời kháng nọc rắn hổ đất (Naja kouthia antivenom) gian chăm sóc tốt Kết ứng dụng lâm sàng Hội thảo khoa học lần thứ 2, lần khẳng định tính an tồn, tính sinh Hội Hoá sinh Y Dược học, Hội Y Dược học TP KN hiệu KN nọc RHM tự sản xuất nước giới 48 Hồ Chí Minh 1997, tr.1-23 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Bon C Serum therapy was discovered 100 years ago Envenomings and their treatment, Eds CBon and M Goyffon Fondation Marcel Mérieux 1996, pp.03-09 Le Khac Quyen Clinical envenomation of snakebites in Vietnam: study from Choray Hospital MSc Thesis, National University of Singapore 2003 Sripratpat S, Aeksowan S, Sapsutthipas S, Chotwiwattanakun C, Suttijitpaisal P, Pratanaphon R, Khow O, Sitprija V, Ratanabanangkoon K The impact of a low dose, low volume, multi-site immunization on the production of therapeutic antivenom in Thailand Toxicon 2003, 41, pp.57-64 49 WHO WHO guidelines for the production, control and regulation of snake antivenom immunoglobulins 2010, pp.17-40 Wüster W, Warrell DA, Cox MJ , Jintakune P, Nabhitabhata P Redcription of Naja siamensis (Sepentes: Elapidae), a widely overlooked spitting cobra from S.E.Asia: geographic variation, medical importance and desianation of a neotype The Zoological Society of London 1997, 243, pp.771-788 10 Wüster W, Thorp RS Naja siamensis, a cryptic species of venomous snake revealed by mtDNA sequencing Experientia 1994, 50, pp.75-79 ... loài rắn (Hổ đất, Hổ KN nọc RHM kỹ thuật Ouchterlony cho mèo Hổ mang bành) phân bố địa lý thấy đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với KN nọc rắn khả quan KT đặc hiệu xuất sau lần gây miễn dịch lần gây miễn. .. khoang đen Hình 1: Rắn Hổ mèo (Naja siamensis) - Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300 kg, dùng để gây miễn dịch Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu - Dung dịch PBS 10%, glutaraldehyd... huy hiệu gây miễn dịch ngựa, giúp ngựa tạo KT tốt Kết Nghiên cứu chế tạo thành công KN nọc RHM đơn giá đạt tiêu chuẩn, có chất lượng sinh miễn dịch an toàn Từ sản phẩm này, xác lập quy trình gây