Bài viết nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế huyết thanh kháng nọc (HTKN) rắn Hổ mèo (RHM) (Naja siamensis antivenom); đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc trong phòng thí nghiệm và trên thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 KẾT QUẢ TINH CHẾ, ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TỒN VÀ HIỆU QUẢ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (NAJA SIAMENSIS) TRÊN THỰC NGHIỆM Lê Khắc Quyến*; Trịnh Xuân Kiếm** Hồng Anh Tuấn***; Thái Danh Tun**** TĨM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế huyết kháng nọc (HTKN) rắn Hổ mèo (RHM) (Naja siamensis antivenom); đánh giá tính an tồn hiệu lực thuốc phòng thí nghiệm thực nghiệm Phương pháp: huyết tương ngựa có kháng thể đặc hiệu với nọc RHM hiệu giá cao thu sau gây miễn dịch, tinh chế thành HTKN RHM F(ab’)2 phương pháp sử dụng men pepsin tủa muối ammonium sulfate theo hướng dẫn Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) Đánh giá HTKN RHM tính an tồn, hiệu lực theo đơn vị (LD50 ED50), chất gây sốt động vật thực nghiệm đặc tính vơ khuẩn phòng thí nghiệm theo Tiêu chuẩn Kiểm định Quốc gia Kết quả: thiết lập quy trình tinh chế HTKN RHM F(ab’)2 tinh chế thành công 157 lọ HTKN RHM dạng dung dịch đông khô Thử nghiệm đánh giá phòng thí nghiệm (in vitro) động vật thực nghiệm (in vivo) cho thấy HTKN RHM có tính an tồn cao, hiệu lực mạnh, vơ khuẩn khơng có chất gây sốt Kết luận: HTKN RHM tinh chế thành công đánh giá đạt tiêu chuẩn quốc gia Thành công nghiên cứu mở hướng điều trị đặc hiệu cho BN bị nhiễm độc nọc RHM tương lai * Từ khoá: Rắn Hổ mèo; Huyết kháng nọc; An toàn; Hiệu lực Result of Purification, Assessment of Safety and Effective Tests of Naja Siamensis Antivenom In Vitro and In Vivo Summary Objectives: The study established the purification of F(ab’)2 Naja siamensis (NS) antivenom and gave an assessment of safety and potency tests of this antivenom in vitro and in vivo Methods: Horse hyper-immune plasma against NS venom was collected after immunization, purified into NS antivenom F(ab’)2 by using pepsin digestion and ammonium sulfate precipitation based on World Health Organization (WHO) guidelines An assessment of NS antivenom for safety, potency based on units of median lethal dose (LD50) and median effective dose (ED50), pyrogens tests in vivo and sterility test in vitro under quality control of the National Standard Results: * Bệnh viện FV ** Viện Nghiên cứu Công nghệ Phát triển Nông thôn *** Học viện Quân y **** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Lê Khắc Quyến (lekhacquyen@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/05/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/09/2015 Ngày báo đăng: 30/11/2015 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Established a protocol for purification of F(ab’)2 Naja siamensis antivenom and made successfully 157 liquid and lyophilized vials of NS antivenom An assessment of this antivenom in vitro and in vivo showed high safety, strong efficacy, sterility and no pyrogens Conclusion: Naja siamensis antivenom was made successfully and met National standard The success of this study open the trend of antidote treatment for NS envenomed patients in future * Key words: Naja siamensis; Antivenom; Safety; Efficacy ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 2009, WHO xếp rắn độc cắn vào bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên tái khẳng định HTKN rắn độc biện pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm độc nọc rắn [9,10] Việc khơng có sẵn HTKN đặc hiệu để điều trị nhiễm độc loài rắn khu vực giới trở thành vấn đề y tế cấp thiết mức độ toàn cầu [10] Từ năm 1894, lần giới Calmette nghiên cứu sản xuất thành cơng HTKN rắn Hổ Viện Pasteur Sài Gòn [4] Từ đây, điều trị rắn độc cắn bước sang trang thuốc đặc trị HTKN [8] Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Trịnh Kim Ảnh, Trịnh Xuân Kiếm CS thành công việc nghiên cứu sản xuất HTKN rắn Hổ đất từ năm 1990 Bệnh viện Chợ Rẫy [3] Tiếp theo, HTKN rắn Choàm quạp, Hổ chúa, rắn Lục rắn Cạp nia sản xuất, giúp giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân (BN) bị rắn độc cắn vào điều trị Bệnh viện Chợ Rẫy từ 20% xuống 2,7% [7] Tuy nhiên, nhiễm nọc độc RHM (Naja siamensis) cắn chiếm tỷ lệ 10% khó khăn lớn cho bác sỹ lâm sàng điều trị, thiếu HTKN đặc hiệu Vì vậy, sản xuất HTKN RHM nhu cầu cấp thiết từ thực tiễn lâm sàng Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình sản xuất HTKN RHM Việt Nam, đánh giá tính an tồn 46 hiệu lực trung hòa nọc độc in vitro in vivo động vật thực nghiệm theo tiêu chuẩn Quốc gia hướng dẫn WHO, góp phần giải vấn đề thiếu HTKN RHM điều trị BN bị loài rắn độc cắn nước ta ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Huyết tương ngựa có kháng thể đặc hiệu đơn giá kháng nọc RHM hiệu giá cao tạo nghiên cứu trước [2] Thu nhận huyết tương điều vô khuẩn, chống đông heparin, ly tâm tách khối hồng cầu sau lấy máu từ 24 - 48 giờ, bảo quản nhiệt độ - 4°C liên tục sử dụng - HTKN RHM sau tinh chế, lấy ngẫu nhiên 30 mẫu - Nọc RHM Công ty Cổ phần Y học công nghệ KLT cung cấp - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Saboraud, Thioglycolate) vi nấm Bệnh viện Chợ Rẫy cung cấp - Chuột nhắt trắng cân nặng từ 18 20 g/con (120 con), chuột lang cân nặng 200 - 250 g/con (3 con) thỏ cân nặng 1,75 - 2,0 kg/con (3 con) Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Phƣơng pháp nghiên cứu * Loại hình nghiên cứu: Nghiên cứu phòng thí nghiệm thực nghiệm động vật * Nội dung nghiên cứu: - Xác lập quy trình tinh chế HTKN RHM dạng F(ab’)2 - Đánh giá HTKN RHM hiệu lực theo đơn vị (LD50 ED50) tính an toàn (chất gây sốt động vật thực nghiệm, tính vơ khuẩn) * Phương pháp tiến hành: - Tinh chế HTKN RHM F(ab’)2 theo hướng dẫn WHO (2010) phương pháp sử dụng enzym pepsin kết tủa muối ammonium sulfate [9] - Đánh giá sở theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) [1] theo hướng dẫn WHO (2010) [9] - Tính LD50: theo cơng thức SpearmanKarber [1] - Tính ED50: + Pha HTKN RHM tăng dần từ 10 μl/ml đến 60 μl/ml + Dung dịch nọc RHM pha dung dịch nước muối đẳng trương 0,9% (10 mg% = 100 µg/ml), trộn với độ pha loãng HTKN, thể tích Ủ hỗn dịch 37°C + Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (dung dịch nọc + HTKN), V = 0,5 ml/chuột + Số chuột thí nghiệm con/lô x lô + Theo dõi 24 giờ, ghi nhận số chuột chết/sống, tính tỷ lệ (%) - Tìm chất gây sốt: 03 thỏ khoẻ mạnh, cân nặng 1,75 - 2,0 kg, nuôi tuần Ngày thí nghiệm, tiêm HTKN RHM thành phẩm nghiên cứu vào tĩnh mạch rìa tai thỏ với thể tích V = ml/kg cân nặng Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước sau tiêm HTKN, thời gian cách Quy định: chênh lệch nhiệt độ cao thấp < 1°C Nếu nhiệt độ tăng > 1°C, chắn chất gây sốt gây - Vô trùng: cấy HTKN phát vi khuẩn mơi trường Saboraud, Thioglycolate nấm Phòng Thí nghiệm, Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy - Tính an toàn: 03 chuột lang khoẻ, cân nặng từ 200 - 250 g Ni tuần trước thí nghiệm Tiêm HTKN RHM vào phúc mạc chuột, V = ml/100 g x cân nặng chuột Theo dõi chuột tuần cân nặng rụng lông Chuột phát triển bình thường tăng cân HTKN an tồn động vật thí nghiệm * Dụng cụ trang thiết bị: - Thiết bị chuyên dùng tinh chế HTKN: buồng lạnh vô trùng, bồn nước thay đổi nhiệt độ, pH meter, bồn inox vô trùng chứa huyết tương ngựa, phễu lọc, giấy lọc, màng lọc cellulose acetate, tủ sấy hấp dụng cụ, máy hút, bình lọc, dụng cụ sát trùng, đèn cồn, hệ thống đông khô lạnh (Christ ly°Chameer Guard), lọ đựng HTKN thành phẩm, nút cao su vơ trùng - Thiết bị, dụng cụ, động vật thí nghiệm dùng để đánh giá chất lượng HTKN RHM - Hố chất chun dụng: pepsin (Merck), ammonium sulfat (Merck), axít sulfuric, axít chlorhydric, NaOH, toluen, nước cất vơ trùng 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 * Thời gian địa điểm: - Tủa thành phần kháng thể ammonium sulfate: cho từ từ 1.400 g ammonium sulfate vào 10 lít huyết tương Hòa tan que khuấy thủy tinh, đảm bảo vô khuẩn tốt - Thời gian: từ tháng 07 - 2012 đến 10 - 2013 - Địa điểm tiến hành: + Bộ môn Khoa Huyết Học - Truyền máu, Bệnh viện Quân y 103 - Khử bổ thể nhiệt 56°C/60 phút - Lọc huyết tương, thu dịch lọc có kháng thể đặc hiệu, loại bỏ cặn thu lít + Phòng Protein - Độc chất - Tế bào, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y - Tủa kháng thể thêm ammonium sulfate tới 36% bão hòa: thêm ammonium sulfate dịch lọc, ủ 20°C, pH 6,8/60 phút Lọc dịch, thu tủa 600 g + Bộ mơn Độc học Phóng xạ Quân sự, Học viện Quân y + Khoa Vi sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy - Thẩm tích màng cellulose acetate để loại bỏ ammonium sulfate Thu hồi dịch thẩm tích 798 ml KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Xác lập quy trình tinh chế HTKN RHM F ab’ - Lọc vô trùng màng cellulose acetate, Φ = 0,2 µm Thu 785 ml HTKN RHM F(ab’) Đóng lọ vơ trùng: 157 lọ, bảo quản nhiệt độ - 8°C - Cắt Fc phân tử kháng thể IgG huyết tương ngựa enzym pepsin: 10 lít huyết tương ngựa có hiệu giá kháng thể đặc hiệu cao với nọc RHM, trộn 100 g pepsin, trì pH huyết tương 3,2 nhiệt độ 20°C/60 phút, đảm bảo vô khuẩn - Đông khô HTKN RHM: đặt 100 lọ dung dịch HTKN thành phẩm vào hệ thống đông khô lạnh Chris, 53 Thu 92 lọ HTKN RHM dạng đông khô, 08 lọ bị dịch, tỷ lệ hao hụt 8/100 = 8% Hiệu lực (potency) HTKN RHM * Liều chết 50% (Lethal dose-LD50) nọc RHM Việt Nam: Bảng 1: Xác định LD50 nọc RHM Việt Nam STT lô Nồng độ nọc μg/ml Số lƣợng nọc/chuột (µg) 48 Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ chuột chết (%) Sống Chết Tổng 4 60 4 70 4 80 4 90 4 100 10 25 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 110 11 2 50 120 12 2 50 130 13 2 50 10 140 14 75 11 150 15 4 100 12 160 16 4 100 13 250 25 4 100 14 500 50 4 100 Số chuột thí nghiệm/lơ = Thể tích dịch nọc tiêm chuột = 0,5 ml Tính toán kết từ bảng cho giá trị LD50 nọc RHM Việt Nam = 12 µg/chuột (20 g) * Hiệu lực (Effective dose-ED50) HTKN RHM: Bảng 2: Xác định ED50 HTKN RHM HTKN RHM (ml) Dung dịch NaCl Nọc RHM 0,9% (ml) (8,33 LD50) (ml) Theo dõi chuột thí nghiệm Số LD50/ chuột Chết Sống Tổng số 0,05 3,75 1,20 8 0,03 3,77 1,20 8 0,01 3,79 1,20 8 0,00 3,80 1,20 4 ED50 = 100 LD50 /ml = 1.200 µg/ml = 500 LD50/lọ = 6.000 µg/lọ Kết quả: - 01 ml HTKN RHM có khả trung hòa 100 LD50 = 1.200 µg nọc RHM - 01 lọ HTKN RHM (5 ml) trung hòa 500 LD50 = 6.000 µg nọc RHM Độ an toàn HTKN RHM * Kiểm tra chất gây sốt (pyrogen test): Bảng 3: Xác định HTKN RHM khơng có chất gây sốt Thứ tự Cân nặng Thể tích tiêm thỏ (kg) HTKN (ml) o Nhiệt độ thỏ trƣớc/sau tiêm HTKN RHM ( C) Trước Sau Sau Sau Nhiệt độ chênh lệch 1,75 5,25 39,0°C 38,8°C 39,5°C 39,5°C + 0,5°C 1,80 5,40 39,9°C 39,5°C 39,4°C 39,4°C - 0,5°C 1,90 5,70 39,3°C 39,2°C 39,2°C 39,45°C + 0,15°C Trong liên tiếp, nhiệt độ thay đổi thỏ sau tiêm HTKN RHM < 1°C Kết cho thấy HTKN RHM khơng có chất gây sốt 49 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 * Kiểm tra tính an tồn (safety test): Bảng 4: Thử nghiệm an toàn HTKN RHM chuột lang Theo dõi chuột thí nghiệm Thứ tự Cân nặng ban đầu (g) HTKN (ml) Thay đổi cân nặng (g) Cân nặng (g) Rụng lông Tuần Tuần Tuần 210 4,2 Không 215 220 230 + 20 200 4,0 Không 205 210 230 + 30 220 4,4 Không 230 240 245 + 25 Kết cho thấy 03 chuột lang thí nghiệm phát triển bình thường, tăng cân, khơng bị rụng lơng, khơng có biểu bệnh lý, chứng tỏ HTKN RHM an toàn chuột thí nghiệm * Kiểm tra vơ trùng (sterility test): Cấy HTKN RHM môi trường Saboraud (20 - 25°C), thioglycolate (30 - 35°C) nấm Phòng Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy Theo dõi liên tục phát vi khuẩn nấm 07 ngày không phát vi khuẩn khí, kỵ khí nấm mốc mọc môi trường cấy HTKN nghiên cứu Như vậy, HTKN RHM sản phẩm nghiên cứu bảo đảm vơ khuẩn, khơng có nấm mốc BÀN LUẬN Chọn lựa quy trình tinh chế HTKN dạng F(ab')2 enzym pepsin tủa ammonium sulfate - HTKN rắn thường sản xuất dạng IgG, F(ab')2 Fab tùy theo quy trình sản xuất nhà sản xuất, tùy sở vật chất tùy tình hình kinh tế quốc gia [5, 9] Hiện nay, HTKN rắn dạng F(ab') nhiều nhà sản xuất chọn lựa có nhiều ưu điểm so với HTKN dạng IgG Fab như: thời gian phân bố thuốc thể trung bình (3 giờ), thải trừ khỏi thể đủ dài (60 giờ), thải trừ qua mô miễn dịch, nên không gây tổn thương thận, lực mơ tốt khơng gây hoạt hố bổ thể [5, 8, 9] 50 HTKN dạng Fab tạo cách sử dụng enzym papain có nhiều ưu điểm tác dụng phụ thải trừ nhanh nên lâm sàng có tình trạng tái nhiễm độc biến chứng thận đường thải trừ, hiệu lực cao giá thành cao Do đó, nghiên cứu chọn lựa quy trình sản xuất F(ab')2 sử dụng enzym pepsin tủa ammonium sulfate Quy trình dựa kinh nghiệm sản xuất loại HTKN trước đây, có nhiều ưu điểm cho sản phẩm tốt, phản ứng phụ, giá thành thấp phù hợp với điều kiện nước ta [2, 3, 7, 9] Việc sản xuất HTKN F(ab')2 enzym pepsin tủa axít caprylic tương tự quy trình sản xuất F(ab')2 sử dụng enzym pepsin tủa ammonium sulfate Với quy trình này, sản phẩm TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 có phản ứng phụ HTKN thấp hơn, giá thành cao Cần có thời gian để nghiên cứu hồn thiện kinh phí để thực nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết HTKN RHM bối cảnh [6, 9] - Sản phẩm lọ đông khô HTKN RHM lần thực cho sản phẩm HTKN Việt Nam Cần phải có nhiều thử nghiệm quy trình đơng khơ lạnh để tìm quy trình tối ưu cho việc sản xuất (thuốc phải đạt đông lạnh tốt, áp lực hút, thời gian đông khơ ) Tỷ lệ hao hụt quy trình đơng khơ lạnh 8% cao, cần nghiên cứu giảm thấp HTKN dạng đơng khơ có nhiều ưu điểm thời gian sử dụng dài hơn, dễ bảo quản so với dạng dung dịch Do đó, thuốc dễ dàng phân phối đến vùng sâu vùng xa, điều trị kịp thời cho người bị RHM cắn nhằm giảm bớt tỷ lệ tử vong thương tật lâu dài Đánh giá huyết kháng nọc RHM in vitro in vivo - Xác định liều gây chết 50% (LD50) nọc RHM Việt Nam Đây tiền đề cho việc đánh giá hiệu lực HTKN RHM nghiên cứu nọc RHM Hiện nay, nghiên cứu nọc RHM Do đó, xác định liều gây chết 50% nọc RHM cần thiết nghiên cứu độc học Việt Nam - Huyết kháng nọc RHM chứng minh tính an tồn chuột lang thí nghiệm, đạt tiêu chuẩn vô khuẩn chất gây sốt Đây tiêu chuẩn cần thiết HTKN điều trị lâm sàng [8, 9] - Hiệu lực HTKN RHM đánh giá động vật thực nghiệm cho thấy hiệu giá cao 500 LD50/lọ (05 ml), trung hồ 6.000 µg nọc RHM (6 mg/lọ) Điều chứng tỏ chất lượng tốt nguồn nguyên liệu, khẳng định tốt quy trình chế tạo kháng nguyên gây miễn dịch Nó chứng minh hồn thiện quy trình tinh chế HTKN RHM, phù hợp điều kiện kinh tế thực tế Việt Nam Từ kết nghiên cứu cho phép xây dựng thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu HTKN RHM thời gian tới nhằm đáp ứng nhu cầu thiết HTKN điều trị cho BN bị RHM cắn KẾT LUẬN Đã xử lý tinh chế thành công HTKN RHM đơn đặc hiệu dạng Fab’2 từ huyết tương ngựa gây miễn dịch với nọc RHM Sản phẩm đáp ứng tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia Khuyến cáo WHO độ an toàn hiệu lực động vật thực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Dược điển Việt Nam IV Huyết kháng nọc rắn, 647-648 Bộ Y tế Nhà xuất Y học Phụ lục XV 2009, tr.320-325 Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, Hoàng Anh Tuấn Rắn độc chế tạo huyết kháng nọc điều trị đặc hiệu Việt Nam Tạp chí Y học Việt Nam 2014, tháng 4, số 2, tr.34-37 Trịnh Xuân Kiếm, Lê Khắc Quyến, Nguyễn Bá Phước Nghiên cứu sản xuất huyết kháng nọc rắn hổ đất (Naja kouthia antivenom) ứng dụng lâm sàng Hội thảo Khoa học lần thứ 2, ngày 29 - - 1997 51 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2015 Hội Hoá sinh Y Dược học, Hội Y Dược học TP HCM 1997, tr.1-23 Bon, C Serum therapy was discovered 100 years ago Envenomings and their treatments (Pr°Ceedings of the first international congress, held at the Institute Pasteur, Paris, France on 7-9 June 1995), Bon, C and Goyffon, M edited, Fondation Marcel Mérieux 1996, pp.03-09 Chippaux JP The development and use of immunotherapy in Africa Toxicon, 1998, Vol 36, No 11, pp.1503-1506 Dos santos MC, Lima MRD, Furtado GC, Colletto GMDD, Kipnis TL, Dias Da Silva W Purificatio of F(ab')2 anti-snake venom by caprylic acid: A fast method for obtaining IgG fragments with high neutralization activity, purity and yield Toxicon 1989, Vol 27, No 3, pp.297-303 52 Le Khac Quyen Clinical evaluation of snakebites in Vietnam: study from Choray Hospital MSc Thesis, National University of Singapore 2003 Theakston RDG An objective approach to antivenom therapy and assessment of firstaid measures in snake bite Annals of Tropical Medicine & Parasitology 1997, Vol 91, No 7, pp.857-865 WHO Guidelines for the production, control and regulation of snake antivenom immunoglobulins 2010, pp.17-40 10 Williams D, Gutierrez JM, Harrison R, Warrell DA, White J, Winkle KD; Gopalakrishnakone P The global snake bite initiative: an antidote for snake bite Lancet 2010, 375, pp.89-91 ... dài Đánh giá huyết kháng nọc RHM in vitro in vivo - Xác định liều gây chết 50% (LD50) nọc RHM Việt Nam Đây tiền đề cho việc đánh giá hiệu lực HTKN RHM nghiên cứu nọc RHM Hiện nay, nghiên cứu nọc. .. cứu phòng thí nghiệm thực nghiệm động vật * Nội dung nghiên cứu: - Xác lập quy trình tinh chế HTKN RHM dạng F(ab’)2 - Đánh giá HTKN RHM hiệu lực theo đơn vị (LD50 ED50) tính an toàn (chất gây... nước ta ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Huyết tương ngựa có kháng thể đặc hiệu đơn giá kháng nọc RHM hiệu giá cao tạo nghiên cứu trước [2] Thu nhận huyết tương điều