Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (naja siamensis) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ KHẮC QUYẾN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ KHẮC QUYẾN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Dược lý Độc chất Mã số: 9720118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS TRỊNH XUÂN KIẾM TS.BS HOÀNG ANH TUẤN HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các kết nêu luận án trung thực công bố phần báo khoa học Luận án chưa cơng bố Nếu có điều sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả Lê Khắc Quyến MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN .3 1.1.1 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn giới 1.1.2 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn Việt Nam 1.2 NỌC RẮN VÀ NHIỄM ĐỘC NỌC RẮN .10 1.2.1 Nọc rắn 10 1.2.2 Nhiễm độc nọc rắn người 11 1.3 CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN 16 1.3.1 Cấp cứu 16 1.3.2 Điều trị không đặc hiệu 18 1.3.3 Điều trị đặc hiệu 20 1.4 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 21 1.4.1 Khái niệm phân loại huyết kháng nọc rắn .21 1.4.2 Qui trình sản xuất huyết kháng nọc rắn 24 1.4.3 Các thử nghiệm đánh giá huyết kháng nọc rắn 27 1.4.4 Tình hình sản xuất huyết kháng nọc rắn Việt Nam 30 1.5 RẮN HỔ MÈO 31 1.5.1 Đặc điểm nhận dạng phân bố 31 1.5.2 Nọc rắn hổ mèo .31 1.5.3 Triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ mèo 32 1.5.4 Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo 35 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .38 2.1.1 Động vật nghiên cứu .38 2.1.2 Hóa chất sinh phẩm 39 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu 40 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 40 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 42 2.2.3 Các phương pháp kỹ thuật tiến hành 42 2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 63 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU .64 2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU .64 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .65 3.1 CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO 65 3.1.1 Kết chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo 65 3.1.2 Kết gây miễn dịch ngựa kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo 72 3.1.3 Kết phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo huyết tương ngựa sau lần gây miễn dịch .75 3.1.4 Kết lấy máu, tách huyết tương truyền trả khối hồng cầu 77 3.1.5 Kết tinh chế huyết kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 từ ngựa 77 3.1.6 Kiểm định chất lượng huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế .82 3.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT .83 3.2.1 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo 83 3.2.2 Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo (median effective dose-ED50) 85 3.2.3 Thử nghiệm đánh giá chất gây sốt (Pyrogen test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 88 3.2.4 Thử nghiệm đánh giá tính an toàn (Safety test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo .89 3.2.5 Thử nghiệm đánh giá tính vơ khuẩn (Sterility test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 94 3.2.6 Thử nghiệm xác định hàm lượng Thimerosal, pH natri clorid huyết kháng nọc rắn hổ mèo 94 3.2.7 Đánh giá tính đặc hiệu huyết kháng nọc rắn hổ mèo 95 3.2.8 Kết điện di miễn dịch huyết kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 98 Chương BÀN LUẬN .99 4.1 DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO .99 4.1.1 Dịch tễ rắn hổ mèo cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc 99 4.1.2 Thu nhận nọc rắn hổ mèo 100 4.2 QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ QUI TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH 101 4.2.1 Chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo .101 4.2.2 Lựa chọn động vật gây miễn dịch 102 4.2.3 Lựa chọn tá chất phù hợp kích thích tạo kháng thể .103 4.2.4 Lịch trình gây miễn dịch liều lượng kháng nguyên giải độc tố 105 4.2.5 Lấy máu thu hoạch huyết tương truyền trả khối hồng cầu 107 4.3 QUI TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2 .109 4.3.1 Lựa chọn huyết kháng nọc đặc hiệu đơn giá thực nghiệm .109 4.3.2 Lựa chọn qui trình tinh chế huyết kháng nọc đặc hiệu đơn giá dạng F(ab’)2 110 4.3.3 Qui trình sản xuất công nghiệp 112 4.4 CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 113 4.4.1 Lựa chọn huyết kháng nọc rắn dạng F(ab’)2 .113 4.4.2 Lựa chọn dạng thành phẩm huyết kháng nọc rắn dạng F(ab’)2 113 4.5 ĐÁNH GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM .114 4.5.1 Đánh giá hiệu lực huyết kháng nọc rắn 114 4.5.2 Đánh giá tính an toàn huyết kháng nọc rắn 115 4.5.3 Đánh giá khả trung hòa độc tố nọc rắn 116 4.5.4 Đánh giá tính đặc hiệu huyết kháng nọc rắn 116 4.6 NHỮNG ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA LUẬN ÁN 117 KẾT LUẬN 118 KIẾN NGHỊ .119 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN .120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC 134 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN TT Phần viết tắt ACD Acid citric, citrat natri, dextrose -chất chống đông Ag Al ACD Bạc Nhôm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 ALAT aPTT ASAT BN BSA BT BUN C CK CK-MB CPK CR cs Cu CVP Alanine aminotransferase Activated Partial Thromboplastine Time Aspartate aminotransferase Bệnh nhân Bovine Serum Albumin – Albumin huyết bị Bình thường Blood Urea Nitrogen Nhiệt Độ Celsius Creatine Kinase Creatine Kinase –MB Creatine Phosphokinase Calloselasma rhodostoma – Rắn choàm quạp Cộng Đồng Central venous pressure – Áp lực tĩnh mạch trung ED50 ELISA tâm Median Effective Dose – Liều hiệu lực trung bình Enzyme-linked immunosorbent assay – Xét Fab nghiệm miễn dịch gắn kết men A monovalent immunoglobulin fragment – F(ab’)2 nhánh kháng thể IgG A bivalent immunoglobulin fragment – hai nhánh FCA kháng thể IgG Freund Complete adjuvant – Tá chất Freund hoàn FIA chỉnh Freund Incomplete adjuvant – Tá chất Freund g HC khơng hồn chỉnh Gam Hội chứng 19 20 21 22 23 24 25 26 Phần viết đầy đủ 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 HRP HT HTKN HTKNR HTKNRHM IgG IgY kDa KN KT LD50 LDH g mg ml NK NS OD OPD PBS-Tween Horseradish Peroxidase – Enzym HRP Huyết Huyết kháng nọc Huyết kháng nọc rắn Huyết kháng nọc rắn hổ mèo Immunoglobulin G – Kháng thể G Immunoglobulin Yolk – Kháng thể lịng đỏ trứng Kilơ Dalton Kháng ngun Kháng thể Median Lethal Dose – Liều gây chết trung bình Lactate Dehydrogenase Microgram Milligram Mililittres Naja kaouthia – Rắn hổ đất Naja siamensis – Rắn hổ mèo Optical Density – Mật độ quang O-phenilenediamine - Dung dịch chất Phosphate Buffer Solution -Tween – Dung dịch PT PLA2 RHM STT SD TC V WHO đệm PBS-Tween Prothrombin Time – Thời gian prothrombin Phospholipase A2 Rắn hổ mèo Số thứ tự Standard Deviation - Độ lệch chuẩn Clotting Time – Thời gian máu đơng Volume – Thể tích World Health Organization – Tổ chức Y tế Thế Zn giới Kẽm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Đặc điểm lâm sàng phân biệt loại rắn độc cắn thường gặp 35 2.1 Liều lượng kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo loại tá chất Freund dùng cho gây miễn dịch 46 2.2 Tiêu chuẩn Quốc gia huyết kháng nọc rắn cần đạt 54 3.1 Kết tuyển chọn lấy nọc rắn hổ mèo 65 3.2 Kết chuẩn bị kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo theo lịch trình gây miễn dịch cho ngựa 67 3.3 Kết cấy vi trùng, vi khuẩn kỵ khí vi nấm với kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo .69 3.4 Liều lượng kháng nguyên số mũi tiêm thực tế trình gây miễn dịch 72 3.5 Bảng theo dõi sức khoẻ ngựa trình gây miễn dịch 74 3.6 Kết hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo sau gây miễn dịch kỹ thuật ELISA .76 3.7 Bảng kết lấy máu ngựa tách huyết tương truyền trả hồng cầu 77 3.8 Kết kiểm định chất lượng huyết kháng nọc rắn hổ mèo 83 3.9 Xác định liều gây chết trung bình (LD50) nọc rắn hổ mèo 84 3.10 Bảng kết thử nghiệm xác định hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo 86 KẾT QUẢ ĐIỆN DI MIỄN DỊCH CỦA HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ VẮC XIN VÀ SINH PHẨM THEO TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM 2009) 5.1 Xác định an toàn chung vắc xin sinh phẩm Xác định độc tính bất thường vắc xin - sinh phẩm tiến hành chuột nhắt chuột lang Triệu chứng nhiễm độc chuột biểu sau: + Thay đổi diện mạo bên ngồi, xù lơng + Trạng thái bất thường, giảm hoạt động + Chuột giảm cân + Chuột chết nhiễm độc 5.1.1 Trên chuột lang + Mỗi thử nghiệm dùng chuột lang có trọng lượng 250 g đến 350 g, chưa dùng cho thí nghiệm trước đó, khỏe mạnh, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày đến ngày + Tiêm ổ bụng cho chuột liều tiêm cho người không ml, trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chuyên luận riêng Liều cho người trình nhãn sản phẩm + Cân trọng lượng trước tiêm cân lần vào cuối giai đoạn theo dõi Chuột phải quan sát kỹ đầu sau tiêm hàng ngày suốt ngày để phát dấu hiệu lâm sàng ốm nhiễm độc + Thử nghiệm đạt u cầu tồn chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, tăng trọng giảm cân ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng Nếu có nhiều chuột chết thử nghiệm khơng đạt u cầu (nếu thử nghiệm xác định có giá trị) Nếu có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc lần thử đầu tiên, cần làm lại thử nghiệm với số lượng chuột gấp đôi Thử nghiệm đạt yêu cầu lần thử nghiệm thứ khơng có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc 5.1.2 Trên chuột nhắt + Mỗi thử nghiệm dùng chuột nhắt Swiss có trọng lượng 17 g/con đến 22 g/con chưa dùng thí nghiệm trước đó, khỏe mạnh, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày + Tiêm ổ bụng cho chuột liều tiêm cho người không ml, trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chuyên luận riêng Liều cho người trình nhãn sản phẩm + Cân trọng lượng trước tiêm cân lần vào cuối giai đoạn theo dõi Chuột phải quan sát kỹ hai đầu sau tiêm hàng ngày suốt ngày để phát dấu hiệu lâm sàng ốm nhiễm độc + Thử nghiệm đạt yêu cầu tồn chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường giảm cân khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng Nếu có nhiều chuột chết thử nghiệm khơng đạt yêu cầu (nếu thử nghiệm có giá trị) Nếu có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc lần thử cần làm lại thử nghiệm với số lượng chuột gấp đôi Thử nghiệm đạt yêu cầu lần thử nghiệm thứ khơng có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc 5.2 Xác định tính vơ khuẩn cho vắc xin sinh phẩm 5.2.1 Qui định chung + Một thử nghiệm quan trọng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo để kiểm soát chất lượng vắc xin sinh phẩm y tế thử nghiệm vô trùng Nhằm phát tác nhân ngoại lai vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm, thử nghiệm vô trùng không thực giai đoạn thành phẩm mà phải thực nhiều giai đoạn trình sản xuất + Theo khuyến cáo WHO, thử nghiệm vô trùng phải thực điều kiện hốt Biosafety Cabinet Class II đạt cấp độ A, phòng cấp độ B Phịng phải kiểm sốt áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí giám sát vi sinh Nhân viên thực thử nghiệm vô khuẩn phải người đào tạo, có hiểu biết kinh nghiệm thực hành, trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng tuân thủ qui trình vào khu vực 5.2.2 Mơi trường dùng cho thử nghiệm vô khuẩn + Gồm loại môi trường Thioglycolat Soybean Casein Digest (SCD) dạng nước Môi trường Thioglycolat dùng để phát vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Mơi trường Soybean Casein Digest dùng để phát vi khuẩn hiếu khí vi nấm Có thể dùng môi trường khác thay môi trường thẩm định 5.2.3 Lấy mẫu + Mẫu để thử vơ trùng phải mang tính đại diện cho tồn lơ sản xuất bao gồm mẫu lấy phần có nguy bị nhiễm cao Ít giai đoạn bán thành phẩm cuối thành phẩm phải lấy mẫu để kiểm tra vô trùng 5.2.4 Phương pháp cấy trực tiếp để phát nhiễm vi khuẩn nấm + Trước kiểm tra vô trùng cần phải xác định xem vắc xin, sinh phẩm có chứa hay khơng chứa chất bảo quản có khả diệt ức chế phát triển vi sinh vật Nếu có, cần phải áp dụng biện pháp thích hợp chẳng hạn tăng thể tích mơi trường ni cấy lọc qua màng lọc + Mẫu thử cần khử trùng sơ bên ngồi cách xịt ethanol 70% lọc vơ trùng, trước chuyển vào phòng + Ngay trước thực thao tác cấy vô trùng, mẫu thử cần khử trùng lại + Với vắc xin, sinh phẩm đóng ống, phải dùng cưa, gạc vơ trùng để cưa bẻ ống mẫu thử Với vắc xin, sinh phẩm dạng đông khô, phải hồi chỉnh với dung dịch kèm trước cấy vào môi trường Riêng với sản phẩm bột khơ đóng dạng viên nén trước cấy phải hòa tan mẫu thử vào nước muối sinh lý nước cất vơ khuẩn Sau đó, cấy sang môi trường Thioglycolat Soybean Casein Digest Lượng mơi trường đóng ống định quan kiểm định quốc gia, sau qua thử nghiệm kiểm định Số lượng mẫu cấy, nhiệt độ, thời gian theo dõi tương tự vắc xin, sinh phẩm dạng nước Sau cấy, cần kiểm chứng lại dung dịch nước muối sinh lý nước cất cách lấy ml, cấy ml (cho vào ống) vào ống Thioglcolat ống SCD Các ống Thioglycolat kiểm chứng ủ nhiệt độ 30 -350C, ống SCD ủ nhiệt độ 20 -25 0C với môi trường cấy mẫu kiểm tra + Cách cấy: Lắc kỹ mẫu thử trước cấy vào mơi trướng, dùng bóp cao su pipet aid có cắm pipet Pasteur co trùng để hút mẫu thử Đẩy hết khí thừa đầu pipet Đưa pipet xuống tận đáy ống môi trường, vừa phối hợp động tác bơm mẫu thử vừa kéo pipet khỏi môi trường thử Với vắc xin, sinh phẩm đóng sẳn bơm tiêm bơm thực tiếp sản phẩm vào mơi trường ni cấy + Mỗi loạt môi trường pha chế dùng thử nghiệm vô khuẩn phải kiểm tra chất lượng tính vơ trùng, tính tăng sinh, khả trung hịa chất ức chế 5.2.5 Đánh giá + Sản phẩm coi vơ trùng khơng có 1ống mơi trường bị nhiễm + Trường hợp bị nhiễm phải làm đồ phiến nhuộm gram soi kính hiển vi để phát vi khuẩn Gram (+), Gram (-) nấm nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu Nếu không bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai sản phẩm coi vô trùng Nếu bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai, dù ống có loại vi sinh vật lần thứ loạt sản phẩm khơng đạt u cầu vơ trùng, phải hủy bỏ Nếu kết nhuộm soi lần kiểm tra thứ thứ hai không loại vi sinh vật, phải tiến hành kiểm tra lần thứ Nếu lần thứ kết qủa không bị nhiễm, chế phẩm coi vô trùng Nếu lần thứ bị nhiễm dù ống, cho dù loại vi sinh vật sản phẩm coi không đạt yêu cầu vô trùng 5.3 Xác định chất gây sốt vắc xin sinh phẩm Thử nghiệm chất gây sốt phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt vắc xin, sinh phẩm dựa tăng thân nhiệt thỏ trước sau tiêm vào tĩnh mạch dung dịch mẫu thử 5.3.1 Lựa chọn động vật thí nghiệm Thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực (nhưng không mang thai), cân nặng khơng 1,5 kg, nuôi dưỡng thức ăn không chứa chất kháng sinh không bị sụt cân suốt 01 tuần trước thử nghiệm Trong thời gian 03 ngày trước thử nghiệm, không sử dụng thỏ cho thí nghiệm tương tự khác Cũng sử dụng thỏ trước tuần làm thử nghiệm chất gây sốt kết lần thử trước âm tính 5.3.2 Phịng thí nghiệm Thử nghiệm tiến hành phòng yên tĩnh, tránh tiếng động ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết thí nghiệm nhiệt độ phịng khơng chênh lệch 3oC so với nơi cũ Thỏ ni riêng phịng n tĩnh có nhiệt độ 20 oC đến 25oC, cho ăn thức ăn tổng hợp khơng có chất kháng sinh Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn qua đêm (nhưng uống nước) thí nghiệm kết thúc Khơng cho uống nước thời gian làm thí nghiệm 5.3.3 Thiết bị, dụng cụ + Nhiệt kế: Để đo nhiệt độ thỏ dùng nhiệt kế thiết bị điện có độ xác 0,1 oC Khi đo nhiệt độ, nhiệt kế phải đặt sâu trực tràng thỏ cm, phải để tối thiểu phút Nếu dùng thiết bị điện, phải đặt yên trực tràng 90 phút trước tiêm giữ ngun vị trí suốt thời gian thí nghiệm + Dụng cụ thủy tinh, bơm tiêm, kim tiêm: tất phải rữa nước để pha thuốc tiêm (WFI) sấy khô 250 oC 30 phút 200oC 60 phút, dùng đồ nhựa phải không chứa chất gây sốt phải vô trùng + Lồng thỏ chuyên dụng: Trước bắt đầu, đặt thỏ lồng chuyên dụng tư thoải mái khơng tí trì suốt thời gian làm thí nghiệm 5.3.4 Thí nghiệm thăm dò (preliminary test) ngày đến ngày trước tiến hành tiêm vắc xin, sinh phẩm cần kiểm tra sơ tính nhạy cảm cho thỏ thí nghiệm cách tiêm vào tĩnh mạch 10 ml/kg trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% không chứa chất gây sốt làm ấm lên khoảng 38,5 oC Ghi nhiệt độ trước tiêm tiếp tục vòng sau tiêm dung dịch nước muối sinh lý Nếu thỏ có nhiệt độ giao động so với nhiệt độ ban đầu > 0,6 oC bị loại, khơng dùng đưa vào thử nghiệm 5.3.5 Thử nghiệm (main test): Đối với mẫu vắc xin, sinh phẩm + Thỏ thí nghiệm thỏ đạt tiêu chuẩn để lồng chuyên dụng 60 phút để ổn định Sau tiến hành đo nhiêt độ thỏ lần, lần cách 30 phút (nếu đo tay) theo chương trình cài đặt (nếu đo thiết bị) Nhiệt độ ban đầu thỏ giá trị trung bình lần đo Tiêu chuẩn đưa vào thí nghiệm thỏ có nhiệt độ chênh lệch lần đo khơng 0,2 oC nhiệt độ ban đầu nằm khoảng 38 oC đến 39,8 oC Mỗi mẫu thử tiêm cho nhóm thỏ con, nhiệt độ chênh lệch nhó khơng q 1oC + Dung dịch dùng để tiêm thỏ vắc xin, sinh phẩm dạng nước hoàn nguyên dung dịch nước hồi chỉnh kèm dạng đông khô Trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chun luận riêng ( đước pha lỗng dung dịch nước mối sinh lý không chứa chất gây sốt) + Tiêm chậm dung dịch vào tĩnh mạch vành tai thỏ khoảng thời gian không kéo dài phút Thể tích tiêm cho thỏ tương ứng ml/kg cân nặng Nên làm ấm dung dịch đến 38,5 oC trước tiêm Đo nhiệt độ thỏ khoảng thời gian tùy vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay đo lần; trường hợp dùng thiết bị, nhiệt độ đo tự động theo chương trình cài đặt) khoảng thời gian sau tiêm Nhiệt độ tối đa nhiệt độ cao đo khoảng thời gian 5.3.6 Đánh giá kết + Đáp ứng thỏ hiệu số nhiệt độ tối đa sau tiêm mẫu thử nhiệt độ ban đầu + Đáp ứng thỏ nhiệt độ tối đa sau tiêm thấp nhiệt độ ban đầu + Mẫu thử được coi đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 0,6 oC tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 1,3 oC Nếu > 2,4 oC coi không đạt yêu cầu + Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ nằm khoảng > 1,3 oC đến 2,4oC thử nghiệm cần tiến hành thỏ khác Mẫu thử đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ ≤ oC Nếu > 4,1 oC coi không đạt yêu cầu + Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ nằm khoảng > oC đến 4,1oC cần phải làm thêm lần cuối thỏ khác Mẫu thử coi đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ (cộng dồn) phải ≤ 4,9 oC Nếu > 4,9 oC coi không đạt yêu cầu phải hủy vắc xin hay sinh phẩm thử nghiệm 5.4 Xác định hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm 5.4.1 Phương pháp hóa lý - Làm song song 02 mẫu (mẫu vắc xin thử mẫu chứng nước cất), lấy 0,2ml mẫu cho vào bình nút mài riêng biệt có dung tích 100ml - Cho vào bình 1,2 ml acid sulfuric đậm đặc (TT), pha loãng lần tính theo thể tích đun nhẹ bình số (chứa mẫu vắc xin mẫu thử) cách thủy tan hết - Thêm vào bình 05ml dung dịch kali permanganat 5% (TT), lắc để yên - Loại bỏ kali permanganat thừa cách thêm 1,5 ml dung dịch hydrocylamin clorid 10% (TT), thêm 35 ml nước cất lần, 05ml dung dịch acid acetic 6M (TT) trộn - Dùng buret thêm xác vào bình 10ml dung dịch dithizon 0,001% lắc 30 giây - Chuyển toàn dung dịch thử bình vào bình lắng gạn riêng biệt, tách lớp cloroform qua lớp hấp sấy khô vào ống nghiệm - Đo mật độ quang bước sóng 580 nm ± 10 nm (kính lọc màu da cam) bước sóng 597 nm ± 10 nm (kính lọc màu đỏ) Hàm lượng thimerosal (X,%) có sinh phẩm thử tính theo cơng thức: a x 100 x 100 X= - = a x 0,00101 0,2 x 49,55 x 1000000 Trong đó: a lượng thủy ngân (µg) xác định theo đường chuẩn 0,2 số ml dung dịch vắc xin mẫu thử 49,55 hàm lượng thủy ngân có 100 phần Thimerosal 100 100 phần thimerosal 100 đổi phần trăm 1000000 hệ số chuyển đổi 5.4.2 Phương pháp vi sinh vật - Pha thạch thường, đun nóng chảy hồn tồn đổ thạch dày mm lên phiến kính hình chử nhật phẳng Để thạch nguội hồn tồn, đục lỗ thạch (đường kính mm), khoảng cách lỗ 30 mm - Cấy chủng staphylococcus aureus thạch nghiêng, ủ 37 0C 18 đến 24 Gặt pha vi khuẩn nước muối sinh lý vô khuẩn thành huyền dịch 109 vi khuẩn/ml Láng huyền dịch vi khuẩn (0,5ml/đĩa thạch) đĩa thạch đục lỗ Nhỏ vào lỗ 100µl dung dịch thimerosal chuẩn chứa 1g thimerosal / lít độ pha loảng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, ủ 37 0C 24 - Đọc kết quả: Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn mọc đậm độ thimerosal chuẩn, xây dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn đường kính vùng ức chế vắc xin mẫu thử để tính hàm lượng thimerosal có vắc xin mẫu thử 5.4.3 Tiêu chuẩn chấp thuận Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản (1/10.000 merthiolat) không vượt 0,01% 5.5 Xác định pH vắc xin sinh phẩm 5.5.1 Phương pháp tiến hành - pH dung dịch vắc xin, sinh phẩm đo máy đo pH (pH meter) Máy đo pH điện kế có trở kháng đầu vào gấp 100 lần trở kháng điện cực sử dụng thường phân độ theo đơn vị pH có độ nhạy để phát thay đổi cỡ 0,05 đơn vị pH 0,003V Các điện cực thủy tinh phù hợp kiểu máy đo pH, kể máy đo pH số, phải đáp ứng yêu cầu Vận hành máy đo pH tùy theo loại máy đo pH tùy theo hướng dẫn nhà sản xuất Tất phép đođều cần phải tiến hành điều kiện nhiệt độ khoảng từ 20 - 25 C, trừ trường hợp có qui định khác chuyên luận riêng - Trước đo pH mẫu thử, cần chuẩn định máy đo pH dung dịch pH nhà sản xuất cung cấp (tối thiểu sử dụng dung dịch pH chuẩn mà pH dung dịch mẫu thử phải nằm khoảng đó) - Tráng đầu điện cực pH nước cất hai lần, dùng giấy thấm mềm chuyên dụng để thấm khô đầu điện cực Số lượng mẫu thử tối thiểu dùng để kiểm tra pH 15ml đến 20ml nên để nhiệt độ phòng trước đo Lắc rót mẫu thử vào cốc đựng mẫu, nhúng ngập điện cực vào cốc mẫu thử số pH hình ổn định xác định pH mẫu thử Sau đo pH mẫu thử xong, cần tráng lại đầu điện cực nước cất lần, dùng giấy thấm mềm chuyên dụng thấm khô đầu điện cực nhúng ngập đầu điện cực máy đo pH vào dung dịch bảo quản điện cực, ngắt điện máy đo pH 5.5.2 Tiêu chuẩn chấp thuận - Tiêu chuẩn pH chấp thuận tùy theo yêu cầu loại mẫu thử 5.6 Xác định hàm lượng natri clorid với có mặt protein vắc xin sinh phẩm 5.6.1 Nguyên lý - Phương pháp dựa phản ứng ion Cl- với một lượng bạc nitrat thừa Protein mẫu thử được oxy hóa kali permanganat mơi trường acid - Xác định lưọng bạc nitrat thừa dung dịch amoni sulfocyanid 5.6.2 Phương pháp tiến hành - Hút 0,2 ml mẫu thử vào bình nón dung tích 50 ml Thêm ml dung dịch bạc nitrat 0,01N Thêm 1ml acid nitric đậm đặc (TT) Thận trọng đun bếp sôi - Thêm giọt dung dịch bảo hịa kali permanganat có màu tím Tiếp tục đun sơi phút Thêm đường glucose bột để khử màu - Trên đáy bình xuất tủa trắng bơng Làm nguội Thêm 0,5 ml dung dịch phèn sắt amoni bảo hòa Chuẩn độ bạc dung dịch amoni sulfocynamid 0,01 N (CĐ) có màu hồng - Song song tiến hành làm mẫu trắng (thay mẫu thử nước cất) Lượng natri clorid có tiêu tính mg% theo công thức: (A-B) x K x 0,585 x 100 X = 0,2 Trong đó: A lượng ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) dùng để chuẩn độ mẫu trắng B lượng ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) dùng để chuẩn độ mẫu thử K hệ số điều chỉnh dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N 0,585 lượng natri clorid tương ứng với 1ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (mg) 0,2 số ml dung dịch mẫu thử đem kiểm tra 100 chuyển thành % 5.6.3 Tiêu chuẩn chấp thuận: Từ 0,85% đến 0,9% ... TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT .83 3.2.1 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo 83 3.2.2 Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo. .. kháng nọc rắn hổ mèo chuột nhắt trắng ngày ngày 93 3.22 Kết định lượng protein huyết kháng nọc rắn hổ mèo 95 3.23 Kỹ thuật thực đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu huyết kháng nọc rắn hổ mèo. .. thực nghiệm? ?? tiến hành với mục tiêu: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) đơn đặc hiệu dạng F(ab’)2 từ ngựa Đánh giá tính an tồn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo thực