Nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ mèo (naja siamensis) trên thực nghiệm tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ KHẮC QUYẾN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TRÊN THỰC NGHIỆM CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720118 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS BSCC TRỊNH XUÂN KIẾM TS BS HOÀNG ANH TUẤN Phản biện 1: GS.TSKH NGUYỄN THU VÂN Phản biện 2: GS TS HUỲNH ĐÌNH CHIẾN Phản biện 3: PGS.TS NGUYỄN LĨNH TOÀN Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường, họp Học viện Qn Y vào hồi: ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Học viện Quân y tháng năm 2019 ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn bệnh lý nhiệt đới Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) xếp vào nhóm bệnh lý nhiệt đới bị lãng quên Mỗi năm giới có tới triệu người bị rắn cắn, làm chết khoảng từ 20.000 đến 125.000 người 50% số nạn nhân thuộc quốc gia Châu Á Châu Phi Trong đó, nguyên nhân quan trọng làm cho số lượng bệnh nhân rắn cắn tử vong tăng thiếu khơng có huyết kháng nọc rắn (HTKNR) để điều trị HTKNR thuốc đặc trị cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn Trước năm 1990, nước ta chưa sản xuất loại HTKNR để điều trị Vì vậy, tỷ lệ tử vong nhóm bệnh nhân rắn cắn nhiễm độc nặng khoảng 19.5% Từ năm 1990, Bộ Y tế cho phép Đơn vị nghiên cứu rắn, Bệnh viện Chợ Rẫy thực loạt đề tài khoa học chế tạo HTKNR bao gồm: hổ đất (Naja kaouthia), hổ mang (Naja atra), chàm quạp (Calloselasma rhodostoma), hổ chúa (Ophiophagus hannah), cạp nia Nam (Bungarus candidus) lục xanh (Cryptelytrops albolabris) Các HTKNR sản xuất quy mơ phịng thí nghiệm, ứng dụng lâm sàng an tồn hiệu quả, góp phần định giảm tỷ lệ tử vong từ 19,5% xuống khoảng 3,1% Tuy nhiên, bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) (RHM) vấn đề y tế tồn Có khoảng 6,3% bệnh nhân bị RHM cắn nhập Bệnh viện Chợ Rẫy với tỷ lệ tử vong cao để lại thương tật suốt đời chưa có HTKNR đặc hiệu lồi rắn Do đó, đề tài “Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) thực nghiệm” tiến hành với mục tiêu: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) đơn đặc hiệu dạng F(ab’)2 từ ngựa Đánh giá tính an tồn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo thực nghiệm Tóm tắt đóng góp luận án: Nghiên cứu chế tạo thành công kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) Thiết lập qui trình gây miễn dịch ngựa tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo đơn đặc hiệu với hiệu giá cao Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) dạng F(ab')2 từ ngựa Việt Nam giới Huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis antivenom) đơn đặc hiệu có tính an tồn cao hiệu lực mạnh động vật thực nghiệm Bố cục luận án: Luận án gồm 119 trang, bao gồm: Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu: trang; Tổng quan: 34 trang; Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 26 trang; Kết quả: 33 trang; Bàn luận: 18 trang; Kết luận kiến nghị: trang Luận án có 23 bảng, biểu đồ, sơ đồ, 34 ảnh, 110 tài liệu tham khảo (cụ thể 16 tài liệu tiếng Việt, 94 tài liệu tiếng Anh) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN 1.1.1 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn giới Rắn lồi bị sát phân bố khắp nơi giới ngoại trừ bắc cực Theo phân loại học, rắn thuộc ngành Dây sống (Chordata), Có vảy (Squamata), lớp Bị sát (Reptile) [8], [15] Theo Halliday T., Adler K (2002) Mehrtens J.M (1987), số 3.000 lồi rắn có mặt trái đất khoảng 375 lồi rắn độc thuộc vào bốn họ: Viperidae, Elapidae, Atractaspididae Colubridae [16], [17] Theo WHO, hàng năm giới ước tính có khoảng triệu trường hợp bị rắn cắn, có 20.000 -125.000 trường hợp bị chết rắn độc cắn [3], [18] Hai khu vực có nhiều nạn nhân tử vong bị rắn cắn Châu Á Châu Phi [19], [20], [21] Trong đó, khu vực Bắc Mỹ châu Úc có tỉ lệ tử vong thấp [22], [23] 1.1.2 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn Việt Nam Theo Nguyễn Văn Sáng cs (1996), Việt Nam có 146 lồi rắn, có 31lồi rắn độc phân bố cạn nước [8] Rắn độc Việt Nam chủ yếu thuộc hai họ có tầm y học quan trọng họ rắn hổ (trong có phân họ rắn biển) họ rắn lục (trong có phân họ rắn có hố má) [9], [10]: - Họ rắn hổ Elapidae: Rắn hổ đất (Naja kaouthia), rắn hổ mèo (Naja siamensis), rắn hổ mang bành (Naja atra), rắn hổ chúa (Ophiophagus hannah), rắn cạp nia Bungarus candidus (miền Nam), rắn cạp nia Bungarus multicinctus (miền Bắc), rắn cạp nia Sông Hồng B Slowinski, rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) phân họ rắn biển (Hydrophiidae) - Họ rắn lục Viperidae: Rắn lục tre môi trắng hay rắn lục đầu vồ (Cryptelytrops albolabris), rắn lục miền Nam (Cryptelytrops popeorum) phân họ Crotalidae: Rắn choàm quạp (Calloselasma rhodostoma) - Họ Colubridae: Rắn sải cổ đỏ (Rhabdophis subminiata) Tại nước ta, mặt dịch tễ học, chưa có khảo sát cấp độ quốc gia thực để ước tính tỉ lệ bệnh nhân bị rắn cắn thực tế Các chuyên gia ước tính năm nước ta có khoảng 30.000 trường hợp bị rắn cắn Tỷ lệ tử vong rắn độc cắn chưa thống kê đầy đủ [24] 1.2 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 1.2.1 Khái niệm phân loại huyết kháng nọc rắn Năm 1894, Bác sĩ người Pháp A Calmette chế tạo huyết ngựa gây miễn dịch với nọc rắn hổ Viện Pasteur Sài gòn, Việt Nam Năm 1895, HTKNR hổ chứng minh tính hiệu điều trị bệnh nhân bị rắn cắn A Calmette ghi nhận người giới chế tạo sử dụng thành công HTKNR [59], [60] Do xuất xứ ban đầu huyết động vật gây miễn dịch với nọc rắn sử dụng để điều trị nên sản phẩm gọi HTKNR 1.2.2 Phân loại Theo cách gây miễn dịch với nọc loài rắn hay nhiều loài rắn có HTKNR đơn giá hay đơn đặc hiệu đa giá hay đa đặc hiệu [12] Việc chọn lựa đơn đặc hiệu hay đa đặc hiệu lồi rắn tuỳ thuộc vào tình hình lồi rắn có tầm quan trọng y học khu vực quốc gia Theo cách tinh chế HTKNR, có khơng có sử dụng enzyme khác để phân cắt phân tử kháng thể IgG thành mảnh khác nhau: Các dạng HTKNR toàn phân tử IgG nguyên vẹn hay mảnh Fab mảnh F(ab’)2 [12] 1.2.3 Qui trình sản xuất huyết kháng nọc rắn Qui trình sản xuất HTKNR bao gồm bước chính: gây miễn dịch, tinh chế kiểm tra chất lượng Các qui trình tinh chế bao gồm: - Qui trình tinh chế HTKNR tủa phân đoạn ammonium sulfate để tạo HTKNR dạng IgG Nếu sử dụng men pepsin trình tinh chế tạo HTKNR dạng F(ab’)2 [12] - Qui trình tinh chế HTKNR tủa phân đoạn acid caprylic để tạo HTKNR dạng IgG Nếu sử dụng men pepsin trình tinh chế tạo HTKNR dạng F(ab’)2 [12], [71] - Qui trình tinh chế HTKNR sử dụng men papain phân cắt tạo HTKNR dạng Fab [12] 1.2.4 Các thử nghiệm đánh giá huyết kháng nọc rắn Các HTKNR đánh giá thử hiệu lực trung hoà nọc rắn dựa đánh giá liều gây chết trung bình nọc rắn (median lethal dose - LD50) Bước đánh giá hiệu lực trung bình (median effective dose - ED50) [12], [72] Ngoài ra, HTKNR phải kiểm tra áp lực thẩm thấu, nồng độ protein, tính chất tinh khiết, kiểm tra đánh giá chất gây sốt, tính vơ khuẩn, đặc tính gây độc khác (tính an tồn), độ pH hố chất khác [12] Đánh giá tiền lâm sàng HTKNR trước tiên phải xác định LD 50 ED50 Việc đánh giá thực hiện: Khả trung hồ hoạt tính xuất huyết, hoạt tính gây hoại tử, hiệu chống đơng, hoạt tính gây hoại tử vân hoạt tính gây nhiễm độc thần kinh nọc rắn Tuy nhiên đánh giá khơng dự đốn hiệu HTKNR lâm sàng cần phải đánh giá thử nghiệm lâm sàng [12] 1.2.5 Tình hình sản xuất huyết kháng nọc rắn Việt Nam Bác sĩ A Calmette người sản xuất thành công HTKNR hổ (Naja kaouthia) Viện Pasteur Sài Gòn, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh năm 1894 Việt Nam quốc gia giới sử dụng HTKNR để điều trị cho người bị rắn độc cắn [12], [59], [60] 100 năm sau, bệnh nhân (BN) bị nhiễm độc nọc rắn nước ta không điều trị HTKNR đặc hiệu Từ năm 1990, Đơn vị nghiên cứu rắn, Bệnh viện Chợ Rẫy tiến hành nghiên cứu sản xuất HTKNR hổ đất ứng dụng lâm sàng [10], [13], [29] Hiện nay, Việt Nam sản xuất HTKNR hổ đất, lục xanh, hổ chúa, cạp nia chàm quạp Do khơng có kinh phí đầu tư nên HTKNR cạp nia hổ chúa khan Huyết kháng nọc rắn hổ mèo (HTKNRHM) rắn biển chưa nghiên cứu [10] Do đó, nghiên cứu sản xuất HTKNRHM nhu cầu thiết thực góp phần cứu sống nạn nhân 1.3 RẮN HỔ MÈO 1.3.1 Đặc điểm nhận dạng phân bố Rắn hổ mèo (Naja siamensis), thuộc họ rắn Hổ (Elapidae family) loại rắn độc nguy hiểm thường xảy tai nạn nước vùng nhiệt đới Đông Nam Á: Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia Việt Nam Ở nước ta, rắn hổ mèo thường gặp tỉnh vùng Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ Tây Nguyên RHM cắn chiếm tỉ lệ 6.3% trường hợp rắn độc cắn nhập Bệnh viện Chợ Rẫy, gây tử vong để lại nhiều di chứng gây nên tàn phế chưa có HTKNR RHM có khả phun nọc vào mắt bệnh nhân gây viêm, hoại tử giác mạc gây mù 1.3.2 Nọc rắn hổ mèo Nọc RHM có nhiều độc tố độc tố tế bào chiếm tỉ lệ cao gây triệu chứng toàn thân lâm sàng bị rắn cắn Mặc dù neurotoxin có thành phần nọc RHM lâm sàng biểu nhiễm độc thần kinh Nhiễm độc thường gặp lâm sàng BN bị RHM cắn tổn thương đa quan độc tố tế bào (cytotoxin) Thành phần tìm thấy nhiều thành phần nọc RHM mà Namiranian S Hider R.C phân tích [86] Độc tố tế bào gây tổn thương vân nặng dẫn đến hoại tử lâm sàng [14] 1.3.3 Triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ mèo Các triệu chứng lâm sàng chỗ: đau, sưng nề (100%) hoại tử vết cắn (88,2%) Bóng nước (17,6%) xuất muộn Ngồi ra, BN gặp tình viêm kết -giác mạc nọc rắn phun vào mắt (11,8%) [14] Các triệu chứng tồn thân: mệt (70,6%), nơn ói (52,9%), đau bụng (52,9%), tiêu chảy (47,1%), mờ mắt (17,6%), chóng mặt (17,6%), nhức đầu (23,5%) đau (82,4%) Các triệu chứng tụt huyết áp (5,9%), nhịp tim nhanh (17,6%) suy thận cấp (11,8%) xuất chậm Khơng có triệu chứng nhiễm độc thần kinh BN có cảm giác khó thở (23,5%) khơng có suy hơ hấp Xét nghiệm cận lâm sàng ghi nhận xét nghiệm sinh hoá: CPK, LDH, CK-MB tăng cao Troponin I không tăng tăng nhẹ Suy thận cấp với BUN, creatinine tăng hay gặp giai đoạn nơn ói, tiêu chảy kéo dài Myoglobine máu nước tiểu tăng cao Các xét nghiệm vi sinh thường gặp vi khuẩn Morganella morganii ss morganii, Proteus vulgaris, Providencia sp 1.3.4 Chẩn đoán Để xác định RHM cắn nay, cần xác định rắn cắn BN mang đến bệnh viện, vùng dịch tễ bệnh nhân sống triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng BN Cần chẩn đoán phân biệt nhiễm độc nọc RHM với rắn hổ đất rắn hổ chúa 1.3.5 Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo Điều trị không đặc hiệu hay điều trị triệu chứng biện pháp chờ đợi nọc rắn thải trừ Điều trị đặc hiệu: Cho đến giới Việt Nam chưa có HTKNRHM để điều trị đặc hiệu cho BN bị nhiễn độc nọc RHM Xuất phát từ vấn đề trên, đề tài luận án tiếp cận nghiên cứu chế tạo HTKNRHM đơn đặc hiệu dạng F(ab’) từ ngựa theo qui định chung WHO kiểm định quốc gia HTKNR Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Rắn hổ mèo: 50 cá thể thu nhận điều kiện tự nhiên khu vực Miền Đông Nam Ngựa gây miễn dịch: 02 ngựa đực tuổi khỏe mạnh, trọng lượng 300kg dùng để gây miễn dịch Chuột nhắt trắng (17-22g/con) x 154 con, chuột lang 250350g/con x thỏ 1,75 – 2,0 kg/con x 2.2 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu: Các dụng cụ chuyên dụng để bắt rắn, lấy nọc Các hoá chất chuyên dụng trang thiết bị chuyên để tinh chế HTKNR: máy đo pH, lọc vô khuẩn, lọ vô khuẩn, tủ ấm, phiến kính, nước cất vơ trùng, kim tiêm vơ trùng Mơi trường cấy vi khuẩn (thạch máu, thạch Mac Conkey, thioglycolate ủ nghiệt độ 30 - 35 0C), vi khuẩn kỵ khí (thạch thioglycolate, ủ nhiệt độ 20 - 250C) vi nấm (thạch Sabouraud, Soybean casein digest, ủ nhiệt độ 20 - 250C) Tá chất Freund hoàn chỉnh (Complete Freund Adjuvant CFA) tá chất Freund khơng hồn chỉnh (Incomplete Freund Adjuvant - IFA) hãng Sigma (Mỹ) cung cấp 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1 Loại hình nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm phịng thí nghiệm động vật 2.3.2 Nội dung nghiên cứu: Xác lập qui trình tinh chế HTKNRHM dạng F(ab’) sử dụng pepsin tủa muối ammonium sulfate Đánh giá HTKNRHM tính an tồn, hiệu lực theo đơn vị (LD50 ED50), chất gây sốt động vật thực nghiệm đặc tính vơ khuẩn phịng thí nghiệm theo Tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia (Dược điển Việt Nam IV) 2.3.3 Phương pháp tiến hành Thu nhận nọc rắn: Nọc RHM thu nhận theo hướng dẫn WHO phương pháp kích thích học vào hai bên tuyến nọc để rắn nhả nọc vào đĩa petri vô trùng Hỗn hợp nọc 50 cá thể rắn trộn để bảo đảm tính đại diện lồi địa phương phân bố rắn Hỗn hợp nọc ly tâm bỏ cặn sau bảo quản -20ºC liên tục sử dụng Chế tạo kháng nguyên (KN): Nọc RHM pha dung dịch PBS 10% sau khử độc tính glutaraldehyde 20% pH 7,3 37ºC 72 Dung dịch nọc ủ 56 ºC 24 Tiếp ly tâm, bỏ cặn, lọc vơ trùng, đóng lọ, dán nhãn bảo quản tủ lạnh -20ºC Sản phẩm KN giải độc tố nọc RHM kiểm định tính vơ trùng xét nghiệm vi sinh thường qui Gây miễn dịch cho ngựa: Theo hướng dẫn WHO (2010), ngựa gây miễn dịch cách tiêm da lặp lại nhiều lần liều thấp kháng nguyên giải độc tố nọc RHM phối trộn với tá chất miễn dịch Freund hồn chỉnh khơng hồn chỉnh theo lịch trình Bảng 2.1 Liều lượng kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo tá chất Freund dùng cho gây miễn dịch Lần miễn dịch Liều KN (ml) 5 5 5 CFA(ml) 0 0 0 IFA(ml) 0 5 5 5 Tổng số ml KN + Tá chất 10 10 10 10 10 10 10 Kháng thể đặc hiệu kháng nọc RHM máu ngựa gây miễn dịch xác định kỹ thuật khuếch tán miễn dịch đơn (Ouchterlony) Tinh chế HTKNRHM F(ab’)2 theo hướng dẫn WHO năm 2010 phương pháp sử dụng men pepsin tủa muối ammonium sulfate Đánh giá sở theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV, 2009 theo hướng dẫn WHO - Tính LD50: LD50 xác định theo công thức Spearman-Karber [72] Công thức tính LD50: logLD50 = logX100 – logFd ( Trong đó: LD50: Liều chết 50% chuột thí nghiệm, log X 100:log liều độc thấp làm chết 100% chuột thí nghiệm, log Fd: log liều độc xen giữa, n: Số lượng chuột sử dụng liều, t: Số chuột chết liều, Σ: Tổng tất liều, bao gồm từ X - X100 , X0: log liều cao không làm chuột chết - Tính ED50: Tính ED50 theo cơng thức Spearman-Kaber [72]: logED50 =Xo + d/2 – d x ri/n) Trong đó: Xo log thể tích huyết thử nghiệm bảo vệ 100% chuột, d log bậc chênh lệch mức thể tích khác nhau, r i số chuột chết dung dịch trung hoà, n số chuột tiêm dung dịch trung hoà + Pha HTKNRHM tăng dần từ 10μl /ml đến 60μl /ml + Dung dịch nọc RHM pha dung dịch nước muối đẳng trương 0.9% (10mg% = 100µg/ml), trộn với độ pha lỗng huyết kháng nọc (HTKN), thể tích Ủ hỗn dịch 37 0C/1h + Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (dung dịch nọc + HTKN), V=0,5 ml/chuột + Số chuột thí nghiệm con/lơ x lơ + Theo dõi 24 giờ, ghi nhận số chuột Chết / Sống, tính tỉ lệ (%) - Tìm chất gây sốt: 03 thỏ khoẻ mạnh, cân nặng 1,75 - 2,0 kg, ni tuần Ngày thí nghiệm, tiêm HTKNRHM vào tĩnh mạch rìa tai thỏ với thể tích V=1ml/kg x trọng lượng Đo nhiệt độ hậu môn thỏ trước sau tiêm HTKN, thời gian cách Qui định: Mẫu thử được coi đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 0,6 oC tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 1,3 oC - Vô trùng: Cấy HTKN phát vi khuẩn môi trường thạch thioglycolate ủ nhiệt độ 30 - 35 0C nhiệt độ 20 - 25 0C, vi nấm môi trường Soybean Casein Digest, ủ nhiệt độ 20 - 25 0C phịng thí nghiệm Vi sinh, Viện Nghiên cứu Gen-Miễn dịch Quốc tế 11 nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo Môi trường thạch máu thạch Mac Conkey (37°C) Môi trường thioglycolate (20 -25°C) Môi trường Sabouraud (37°C) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 14 Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Nhận xét: Kết cấy vi khuẩn vi nấm cho thấy sản phẩm kháng nguyên giải độc tố nọc RHM đạt tiêu chuẩn vô khuẩn (Bảng 3.3) 3.1.2 Kết gây miễn dịch ngựa kháng nguyên giải độc tố rắn hổ mèo Bảng 3.4 Liều lượng kháng nguyên số mũi tiêm thực tế trình gây miễn dịch Lần miễn Lần dịch Lần Lần Lần Lần Lần Liều KN (ml) 5 5 Lần Lần Lần 5 Nọc rắn 100 300 500 500 500 500 500 500 500 (mg) Tổng ml 10 10 10 10 10 10 10 KN+tá chất Số mũi 12 20 20 20 20 20 20 20 tiêm 3.1.3 Kết phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo huyết ngựa sau lần miễn dịch Trong trình gây miễn dịch theo lịch trình, theo dõi khả sinh KT đặc hiệu với KN giải đốc tố nọc RHM kỹ thuật Ouchterlony miễn dịch gắn kết men (ELISA) Kết cho thấy Kháng thể đặc hiệu xuất sau lần gây miễn dịch, tăng dần hiệu giá sau lần gây miễn dịch nhắc Bảng 3.5 Kết hiệu giá kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo sau gây miễn dịch kỹ thuật ELISA 12 Ngựa Hiệu giá kháng thể sau lần gây miễn dịch (X10-3) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Ngựa số 1/4 1/4 1/64 1/128 1/64 1/64 1/64 1/128 1/128 Biểu đồ 3.1 Hiệu giá kháng thể sau gây miễn dịch lần 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ngựa số1 sau tiêm KN giải độc tố nọc rắn hổ mèo Nhận xét: Đáp ứng kháng thể ngựa số tốt, hiệu giá kháng thể ngựa số cao ổn định mức 1/128.000 từ sau tháng thứ 8, đủ điều kiện để tiến hành lấy máu thu hoạch huyết tương tinh chế kháng thể từ sau tháng thứ (Bảng 3.6) 3.1.4 Kết lấy máu, tách huyết tương truyền trả khối hồng cầu Bảng 3.6 Kết lấy máu tách huyết tương truyền trả hồng cầu Lần lấy máu Số lượng máu (ml) Lần Lần Lần 9000 6000 6000 Số lượng huyết tương (ml) 5600 4600 4600 Số lượng khối hồng cầu truyền 18 12 12 trả (đơn vị) Nhận xét: Bắt đầu lấy máu ngựa số từ tháng thứ 9: Tổng cộng số máu lần lấy 21 lít, tách 14,8 lít huyết tương Số lượng đơn vị hồng cầu truyền trả cho ngựa 42 đơn vị 3.1.5 Kết tinh chế huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu từ ngựa 13 Cắt Fc phân tử KT (IgG) việc sử dụng men pepsin: 10 lít huyết tương ngựa giàu KT đặc hiệu với nọc RHM, trộn 100g pepsin, trì pH huyết tương 3,2 nhiệt độ 20 0C/60 phút, đảm bảo vô khuẩn Tủa thành phần KT ammonium sulfate: Cho 1400g vào 10 lít huyết tương Hồ tan que khuấy thuỷ tinh, đảm bảo vô khuẩn tốt Khử bổ thể nhiệt 560C/60 phút Lọc huyết tương, thu dịch lọc có KT đặc hiệu, loại bỏ cặn thu lít Tủa KT thêm ammonium sulfate tới 36%: Thêm ammonium sulfate dịch lọc, ủ 200C, pH 6,8/60 phút Lọc dịch, thu tủa 600g Thẩm tích màng cellulose acetate để loại bỏ ammonium sulfate Thu hồi dịch thẩm tích 798 ml Lọc vơ trùng màng cellulose acetate, Φ=0.2µm Thu 785ml HTKNRHM F(ab’)2 Đóng lọ vô trùng lọ 5ml 157 lọ, bảo quản nhiệt độ – 80C Đông khô HTKNRHM: Đặt 100 lọ dung dịch HTKN thành phẩm vào hệ thống đông khô lạnh Chris, 53 Thu 92 lọ HTKNRHM dạng đông khô, 08 lọ bị dịch, tỉ lệ hao hụt 8% 3.1.6 Kiểm định chất lượng huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế Bảng 3.7 Kết kiểm định chất lượng huyết kháng nọc rắn hổ mèo Kiểm tra chất lượng Dung dịch 1.Hiệu giá 2.Thử nghiệm chất gây sốt 3.Thử nghiệm an toàn 4.pH 5.Yêu cầu vô khuẩn 6.Hàm lượng protein 213,6 LD50/lọ Đạt tiêu chuẩn Đạt tiêu chuẩn 7,281 Đạt 40 mg/ml rong suốt, màu vàng nhạt, khơng có vật thể lạ Đơng khơ 190,7 LD50/lọ Đạt tiêu chuẩn Đạt tiêu chuẩn 7,699 Đạt 26 mg/ml 7.Tính chất vật lý: Dạng bột đơng khơ màu hồng có ánh vàng, khơng bong Sau hồn ngun tạo thành dung dịch suốt, màu vàng, vật thể lạ Nhận xét: HTKNRHM đạt tiêu chuẩn quốc gia an tồn, khơng gây 14 sốt, vơ khuẩn hiệu lực cao Có khác biệt hiệu giá HTKNRHM dạng dung dịch đơng khơ thất HTKNRHM q trình đơng khơ sản phẩm Cần hồn thiện qui trình kỹ thuật đơng khơ q trình sản xuất HTKNRHM 3.2 Đánh giá hiệu điều trị huyết kháng nọc rắn hổ mèo động vật 3.2.1 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc RHM Việt Nam (median lethal dose - LD50) Bảng 3.8 Xác định liều chết trung bình (LD50) nọc RHM STT Nồng Số lượng Theo dõi chuột thí nghiệm Tỷ lệ Lơ độ nọc nọc/chuột chuột Sống Chết tổng số chết (%) (μg/ml) (µg) 0 4 60 4 70 4 80 4 90 4 100 10 25 110 11 2 50 120 12 2 50 130 13 2 50 10 140 14 75 11 150 15 4 100 12 160 16 4 100 13 250 25 4 100 14 500 50 4 100 Số chuột thí nghiệm/lơ = Thể tích dịch nọc tiêm chuột (ml) = 0.5 Kết quả: log LD50 = log X100 – log Fd ( = log 15 – (log10+log11+ log12+log13+log14)/4 +log(50x10)/4 = 1,18 - 0,75 - 0,67 = 1,1 Vậy LD50 = 12,59 µg /chuột 3.2.2 Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo 15 Bảng 3.9 Bảng kết thử nghiệm xác định hiệu lực TT HTKN Dung dịch RHM NaCl 0.9% (ml) (ml) Nọc hổ mèo (100 µg/ml) Theo dõi chuột thí nghiệm Chết Sống Tổng số 0,050 3,75 1,200 8 0,030 0,010 3,77 3,79 1,200 1,200 0 8 8 0,000 3,80 1,200 4 Nhận xét: Tính kết ED50 dựa theo công thức logED50 = Xo + d/2 – d x( ri/n) =log 0,010 +0,010/2 -0,010x4/8 = -2,00 Như ED50 = 0,01ml - 01 ml HTKNRHM có khả trung hịa 100 LD 50 = 1.200 µg nọc RHM 3.2.3 Thử nghiệm đánh giá chất gây sốt (Pyrogen test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo Bảng 3.10 Bảng kết thử nghiệm xác định chất gây sốt HTKNRHM TT Trọng Thể Nhiệt độ trước tiêm Nhiệt độ sau tiêm Nhiệt o o thỏ lượng tích HTKNRHM ( C) HTKNRHM ( C) độ thỏ HTKN chênh 30 TB 60 120 180 (kg) (ml) phút phút lệch phút phút phút (oC) 1,8 1,8 38,5 38,5 38,5 38,8 38,7 38,5 0,3 1,9 1,9 38,6 38,6 38,6 38,9 38,7 38,6 0,3 2,0 2,0 38,6 38,6 38,6 39,0 38,8 38,6 0,4 Nhận xét: Chênh lệch nhiệt độ hậu môn thỏ trước sau tiêm HTKNRHM (0,3), (0,3) (0,4 oC) < 0.60C Tổng chênh lệnh nhiệt độ thỏ (0.3) + (0,3) +(0,4) = 1,0 oC < 1.3 oC Kết Luận: Xác định HTKNRHM khơng có chất gây sốt 3.2.4 Thử nghiệm đánh giá tính an tồn (Safety test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 16 Bảng 3.11 Bảng kết thử nghiệm xác định tính an tồn HTKNRHM chuột lang Tăng trọng TT Trọng lượng Rụng lượng lông (g) Ngày Ngày Ngày 270 4,05 Không 270 275 280 + 10 290 4,35 Không 290 296 300 + 10 300 4,50 Không 300 304 310 + 10 Nhận xét: 03 chuột lang thí nghiệm phát triển bình thường, tăng cân, khơng bị rụng lơng, khơng có biểu bệnh lý Kết quả: HTKNRHM an tồn chuột lang thí nghiệm Bảng 3.12: Kết thử nghiệm tính an tồn huyết kháng nọc rắn hổ mèo chuột nhắt trắng Theo dõi chuột nhắt trắng thí nghiệm Tăng Trọng HTKN trọng Trọng lượng TT lượng RHM lượng Xù lông (g) (ml) Ngày Ngày Ngày (g) 18 0,90 Không 18 20 25 + 07 18 0,90 Không 18 20 25 + 07 19 0,95 Không 19 21 26 + 07 19 0,95 Không 19 22 26 + 07 20 1,00 Không 20 23 28 + 08 Nhận xét: + Quan sát chuột nhắt trắng sau tiêm HTKNRHM vịng 2giờ: Chuột ăn uống bình thường, vận động tốt, không xù lông + Quan sát chuột nhắt trắng sau tiêm HTKNRHM 01 tuần sau: Cả 05 chuột nhắt trắng phát triển bình thường, tăng cân, khơng xù lơng khơng có biểu bệnh lý Kết luận: Xác định HTKNRHM an toàn chuột nhắt trắng dòng Swiss 3.2.5 Thử nghiệm đánh giá tính vơ khuẩn (Sterility test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo Bảng 3.13: Kết cấy vô khuẩn huyết kháng nọc rắn hổ mèo Trọng HTKN lượng RHM (g) (ml) Mơi Thioglycolat, Theo dõi chuột lang thí nghiệm Thioglycolat, Soybean Casein 17 trường ủ 30 -350C ủ 20 -250C Digest, ủ 20-250C Ngày 03 07 14 03 07 14 03 07 14 Kết âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính âm tính Kết quả: HTKNRHM khơng có vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí vi nấm môi trường Thioglycolat ủ nhiệt độ 30 - 35 0C nhiệt độ 20 250C Soybean Casein Digest ủ nhiệt độ 20 - 25 0C thời gian 14 ngày Kết luận: HTKNRHM đạt vô khuẩn Biểu đồ 3.2 Kết định lượng protein huyết kháng nọc rắn hổ mèo Kết đo OD HTKNRHM là: 0,206 với bậc pha lỗng 64 Tính nồng độ protein HTKNRHM dựa hàm số protein chuẩn là: y = 0.1271x + 0.0737 = (0,206 – 0,073) / 0,127 = 67,2 (mg/ml) Nhận xét: Kết định lượng protein HTKNRHM 67,2 mg/ml 18 Chứng âm + 3SD Biểu đồ 3.3 Kết đánh giá hiệu giá kháng thể đặc hiệu huyết kháng nọc rắn hổ mèo phương pháp ELISA đạt 1/64.000 Kết đo OD: Chứng âm: 0.076, SD: 0.002, Chứng âm+3SD: 0.082 HTKNRHM pha lỗng thấp dương tính: 0.099 (với độ pha loãng 1/64.000) so với chứng âm+3SD 0.082 Như hiệu giá kháng thể HTKNRHM tương đương 0.10 bậc pha loảng 1/64.000 3.2.7 Kết điện di miễn dịch huyết kháng nọc rắn hổ mèo Kết điện di miễn dịch xác định thành phần HTKNRHM dạng F(ab’)2 : Kết điện di miễn dịch HTKNRHM dạng F(ab’)2 cho thấy thành phần chủ yếu gamma globulin chiếm 68,44% Thành phần albumin cịn 5,74% Kháng thể dạng IgG, IgA, IgM thấp Protein chiếm 35,0 g/l Chương BÀN LUẬN 4.1 DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO 19 4.1.1 Dịch tễ rắn hổ mèo cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc Nghiên cứu thu nhận RHM từ môi trường thiên nhiên lấy nọc RHM nghiên cứu thu nhận từ tỉnh vùng miền Đông Nam Bộ Nam Trung Tây Ninh, Bình Dương Đồng Nai Như vậy, RHM đại diện cho vùng địa lý, khu vực gây bệnh, phù hợp khuyến cáo WHO Rắn thu nhận có kích thước đa dạng với trọng lượng trung bình 105 g/con nên nọc rắn thu nhận bao gồm lứa tuổi RHM Nọc rắn lấy từ rắn hoang dã, nên giữ ngun tính chất lý hóa rắn môi trường hoang dã môi trường nuôi nhốt nên gây miễn dịch cho KT đặc hiệu cho RHM khu vực Nam Trung Đông Nam 4.1.2 Thu nhận nọc rắn hổ mèo Lấy nọc rắn phương pháp kích thích học vào hai bên tuyến nọc, để rắn nhả nọc vào petri vơ trùng Nọc RHM sau ly tâm loại bỏ cặn, đông khô bảo quản theo hướng dẫn lấy nọc rắn bảo quản phù hợp khuyến cáo WHO (2010) [12] Hơn nữa, WHO (2010) đưa RHM vào danh mục lồi rắn độc có tầm quan trọng y học khu vực Đơng Nam Á Do cần thiết phải sản xuất HTKNRHM phục vụ cho khu vực dân cư sinh sống khu vực 4.2 QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ GÂY MIỄN DỊCH 4.2.1 Chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo Nghiên cứu dùng nọc RHM thô để chế tạo KN Do nọc RHM có nhiều thành phần gây tổn thương chỗ nặng nề nên dùng nọc rắn thô phải giảm liều KN tránh gây nguy hiểm cho động vật gây miễn dịch Nếu sử dụng KN liều thấp nguy thất bại gây miễn dịch cho động vật cao Việc khử độc nọc RHM glutaraldehyde nhiệt làm giảm độc tính độc tố nọc rắn lên vật chủ ngựa Vì vậy, nghiên cứu chúng tơi chế tạo KN giải độc tố nọc RHM để gây miễn dịch Tuy nhiên, theo WHO, việc khử độc phá huỷ vị trí gây độc độc tố phá huỷ ln điểm tạo tính KN độc tố nọc rắn Khi sử dụng khử độc glutaraldehyde, protein bị phản ứng trùng hợp mức độ khó kiểm sốt khơng hồi phục Việc khử độc làm giảm đáp ứng tạo KT KT trung hoà độc tố tự nhiên có nọc rắn Do đó, WHO (2010) khuyến cáo không nên khử 20 độc nọc rắn mà nên gây miễn dịch với liều thấp nhủ tương hoá tốt với tá chất Freund hồn chỉnh khơng hồn chỉnh [12] Điều thực nghiên cứu Sapsutthiapas S cs (2015) [98] Qui trình khử độc để tạo giải độc tố kinh điển chế tạo vắc xin Nghiên cứu thực tương tự nghiên cứu Trịnh Xuân Kiếm cs trước (2012), (1997) 4.2.2 Lựa chọn động vật gây miễn dịch Sản xuất HTKNR thường phải chọn lựa động vật gây miễn dịch Những động vật là: Ngựa, cừu, lạc đà, dê, thỏ, gà phổ biến ngựa Ngựa động vật thường chọn lựa ưu điểm: Thu hoạch lượng huyết lớn, phù hợp với quy mô sản xuất HTKNR [12], [99] Ngựa dễ ni, ni nhiều quốc gia khác Các nghiên cứu sản xuất HTKNR ứng dụng ngựa nên có nhiều kinh nghiệm trình sản xuất Cừu sử dụng sản xuất HTKNR dạng Fab [12] Ở số nước Châu Phi, lạc đà cho lựa chọn phù hợp phù hợp mơi trường sa mạc tập quán sinh sống vùng miền Một số sở sản xuất HTKNR từ huyết thỏ, dê,…để sử dụng trường hợp BN dị ứng với huyết ngựa Như vậy, tùy thuộc vào khu vực địa lý quốc gia tình hình tơn giáo phù hợp văn hố khu vực, việc chọn lựa động vật gây miễn dịch khác nhà sản xuất 4.2.3 Lựa chọn tá chất phù hợp kích thích tạo kháng thể Tá chất dùng phối hợp dạng huyền dịch muối Một lần khẳng định, tá chất Freund có khả tạo kháng thể tốt nọc rắn Nghiên cứu mạnh dạn sử dụng tá chất freund khơng hồn chỉnh hồn chỉnh để gây miễn dịch Các tá chất muối nhôm bentonite cho kháng thể kháng nọc thấp nên khơng cịn sử dụng Một số tác giả sử dụng nọc thô pha nước muối sinh lý để gây miễn dịch Nghiên cứu Waghmare A cs dùng IMS 3012 tạo KT tốt giảm tổn thương chỗ [101] Ratanabanangkoon K cs sử dụng liều thấp, nhiều mũi thay nọc rắn thô độc tố trọng lượng phân tử thấp làm tăng đáp ứng KT chống lại nhiều họ rắn hổ Châu Á [88] 4.2.4 Lịch trình gây miễn dịch liều lượng kháng nguyên giải độc tố Thời gian gây miễn dịch kéo dài từ đến 15 tháng đạt nồng độ KT cao máu động vật miễn 21 dịch thời điểm để lấy toàn máu động vật miễn dịch Nghiên cứu chúng tơi sử dụng lịch trình gây miễn dịch cách tháng khuyến cáo WHO Thời gian gây miễn dịch tháng cho hiệu giá KT cao 1/64.000 ổn định sau tháng thứ Như vậy, việc tinh chế HTKNRHM tiến hành sau thu hoạch đủ lượng huyết tương ngựa cần thiết Kỹ thuật gây miễn dịch: Đường tiêm da liều nhỏ nhiều mũi tiêm để tăng diện tiếp xúc KN vật chủ Chotwiwatthanakun C cs (2001) Sripratpat S cs (2003) áp dụng cách gây miễn dịch cho ngựa nghiều mũi tiêm liều nhỏ đạt hiệu giá KT cao [61], [98] 4.2.5 Lấy máu thu hoạch huyết tương truyền trả khối hồng cầu Xu hướng lấy máu nhiều lần qua việc tách huyết tương truyền máu hồn hồi có tính kinh tế hiệu cao [12] Nghiên cứu lấy khối lượng máu lớn từ ngựa 21 lít vịng tháng, tách 14,8 lít huyết tương Truyền trả 42 đơn vị khối hồng cầu, giúp ngựa khỏe cho KT tốt Nếu sử dụng động vật khác khó thực Theo León G cs (2018), ngựa lấy máu thu hoạch huyết tương ngày đầu 1,5%, 1,5% 0,8% trọng lượng thể Truyền lại khối hồng cầu phối hợp Ringer lactate Như vậy, thu hoạch 10-12 lít huyết tương ngựa [94] Nghiên cứu sử dụng phương pháp truyền trả khối hồng cầu thu hoạch 14,8 lít huyết tương ngựa đạt u cầu cho lơ sản xuất mà không gây nguy hiểm cho ngựa 4.3 QUI TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2 4.3.1 Lựa chọn huyết kháng nọc đặc hiệu đơn giá thực nghiệm HTKNR thường sản xuất dạng IgG, F(ab') Fab tuỳ theo qui trình sản xuất nhà sản xuất, tuỳ sở vật chất tuỳ tình hình kinh tế quốc gia Hiện nay, thị trường có HTKNR hổ đất đơn giá Nghiên cứu chế tạo HTKNR dạng đơn giá Khi cần trộn lẫn tạo thánh HTKNR hổ đất để tạo nên HTKNR đa giá 4.3.2 Lựa chọn qui trình tinh chế huyết kháng nọc đặc hiệu đơn giá dạng F(ab’)2 22 Nghiên cứu chọn lựa qui trình tinh chế HTKN F(ab')2 men pepsin tủa ammonium sulfate vì: - Hiện nay, HTKNR dạng F(ab')2 nhiều nhà sản xuất chọn lựa có nhiều ưu điểm so sánh với HTKNR dạng IgG Fab như: thời gian phân bố thuốc thể trung bình (3 giờ), thải trừ khỏi thể đủ dài (60 giờ), thải trừ qua mô miễn dịch nên không gây tổn thương thận, lực mô tốt khơng gây hoạt hố bổ thể HTKN dạng Fab tạo cách sử dụng men papain có nhiều ưu điểm tác dụng phụ, hiệu lực cao giá thành cao, thải trừ nhanh nên lâm sàng có tình trạng tái nhiễm độc biến chứng thận đường thải trừ - Qui trình dựa kinh nghiệm sản xuất loại HTKNR trước có nhiều ưu điểm cho sản phẩm tốt, phản ứng phụ, giá thành thấp phù hợp với điều kiện nước ta Việc sản xuất HTKNR F(ab') men pepsin tủa acid caprylic tương tự qui trình sản xuất F(ab')2 sử dụng men pepsin tủa ammonium sulfate Tuy nhiên sản phẩm có phản ứng phụ HTKNR thấp giá thành cao cần có thời gian để nghiên cứu hồn thiện kinh phí để thực nghiên cứu nhu cầu HTKN RHM bách bối cảnh 4.4 CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 4.4.1 Lựa chọn huyết kháng nọc rắn dạng F(ab’)2 Nghiên cứu này, đề tài chọn sản xuất HTKNRHM đơn giá Hiện nay, Việt Nam có HTKNR hổ đất đơn giá có ứng dụng tốt lâm sàng [13], [84], [85] Do đó, tiến hành sản xuất HTKNRHM đơn giá, đáp ứng nhu cầu điều trị Nếu phối hợp hai loại HTKNR hổ này, có HTKNR hổ đa giá (lưỡng giá) cho bệnh nhân rắn hổ cắn miền Nam Việt Nam tương lai 4.4.2 Lựa chọn dạng thành phẩm huyết kháng nọc rắn dạng F(ab’)2 Sản phẩm lọ đông khô HTKNRHM lần thực cho sản phẩm HTKN Việt Nam Cần phải có nhiều thử nghiệm qui trình đơng khơ lạnh để tìm qui trình tối ưu cho việc sản xuất (thuốc phải đạt đông lạnh tốt, áp lực hút, thời gian đông khô ) Tỉ lệ hao hụt qui trình đơng khơ lạnh (8%) chấp nhận cần phải giảm thấp nghiên cứu HTKN dạng đơng khơ có nhiều ưu điểm thời gian sử dụng dài hơn, dễ bảo 23 quản so với dạng dung dịch Do đó, thuốc dễ dàng phân phối đến vùng sâu vùng xa, nơi trang thiết bị thiết yếu hạn chế cần cho việc điều trị sớm giảm bớt tỉ lệ tử vong thương tật lâu dài cho người bị RHM cắn 4.5 ĐÁNH GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 4.5.1 Đánh giá hiệu lực huyết kháng nọc rắn Xác định liều gây chết 50% (LD50) nọc RHM Việt Nam Đây tiền đề cho việc đánh giá hiệu lực HTKNRHM nghiên cứu nọc RHM Hiện có nghiên cứu nọc RHM Do đó, xác định liều gây chết 50% nọc RHM cần thiết nghiên cứu độc học Việt Nam Hiệu lực HTKNRHM đánh giá động vật thực nghiệm cho thấy hiệu giá cao 500 LD50/lọ (05ml), trung hồ 6000µg nọc RHM (6mg/lọ) Điều chứng tỏ chất lượng tốt nguồn nguyên liệu, khẳng định tốt qui trình chế tạo KN gây miễn dịch 4.5.2 Đánh giá tính an tồn huyết kháng nọc rắn HTKNRHM chứng minh tính an tồn chuột lang thí nghiệm, đạt tiêu chuẩn vơ khuẩn khơng có chất gây sốt Đây tiêu chuẩn cần thiết HTKNR điều trị 4.5.3 Đánh giá tính đặc hiệu huyết kháng nọc rắn Để theo dõi đáp ứng KT kháng nọc RHM q trình gây miễn dịch, chúng tơi sử dụng kỹ thuật Ouchterlony Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, phù hợp điều kiện theo dõi miễn dịch Việt Nam Sau đó, chúng tơi sử dụng kỹ thuật ELISA để xác định lại tính đặc hiệu tính hiệu giá KT HTKNRHM Sử dụng kỹ thuật ELISA nghiên cứu nọc rắn phản ứng KN – KT Theakston R.D.G cs ứng dụng lần đầu năm 1977 [74] Nghiên cứu xác định KT kháng nọc RHM xuất ngựa gây miễn dịch từ tháng thứ KT tăng dần đạt giá trị cao ổn định từ tháng Trong ngựa gây miễn dịch, ngựa số cho đáp ứng KT tốt Ngựa số đáp ứng KT Sriprapat S.và cs (2003) ghi nhận đạt kết tốt 52,3% ngựa gây miễn dịch [64] KẾT LUẬN Nghiên cứu chế tạo thành công huyết kháng nọc rắn hổ mèo Nghiên cứu chế tạo thành công HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơn đặc hiệu từ ngựa Bắt đầu qui trình kỹ thuật chế tạo thành 24 công KN giải độc tố nọc RHM đạt tiêu chuẩn, có khả kích thích sinh miễn dịch mạnh an toàn cao Từ sản phẩm này, nghiên cứu xác lập qui trình gây miễn dịch ngựa với liều KN giải độc tố nọc RHM tăng dần từ 333 µg/kg trọng lượng ngựa đến 1666 µg/kg trọng lượng ngựa (gấp lần liều ban đầu), phối hợp tá chất Freund hồn chỉnh khơng hồn chỉnh vừa an toàn cho ngựa, vừa đạt hiệu giá kháng thể tối đa (1/128.000 tháng thứ 8) Nghiên cứu xác lập thành cơng qui trình kỹ thuật tinh chế HTKNRHM F(ab’)2 đơn đặc hiệu từ ngựa kỹ thuật phân cắt kháng thể sử dụng men pepsin kết hợp tủa phân đoạn muối ammonium sulfat Đây qui trình kỹ thuật tinh chế HTKNR tiên tiến phù hợp với Việt Nam Sản phẩm nghiên cứu ứng dụng phục vụ điều trị lâm sàng Đề tài chế tạo thành công 785 ml HTKNRHM, đóng lọ ml/lọ thu nhận 157 lọ dung dịch đông khô, đạt tiêu chuẩn kiểm định Quốc gia Đã xác định tính an tồn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo Huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu đạt tiêu chuẩn an toàn (Safety) thực nghiệm: An toàn động vật thí nghiệm (in vivo), khơng có chất gây sốt, không nhiễm vi khuẩn vi nấm Huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu có hiệu lực mạnh Liều chết trung bình LD50 nọc RHM Việt Nam 12,59 µg/ 20g chuột nhắt trắng/ đường tiêm ổ bụng Hiệu lực trung hòa trung bình (ED50) HTKNRHM F(ab’)2 100 LD50/ml Mỗi lọ HTKNRHM F(ab’)2 (5ml) có khả trung hồ 500 LD 50 nọc RHM, tương đương 6mg nọc rắn hổ mèo Điều khẳng định sinh phẩm HTKNRHM F(ab’)2 đơn đặc hiệu an toàn hiệu lực mạnh nghiên cứu KIẾN NGHỊ Có thể triển khai qui trình chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo đề tài qui mô lớn hơn, với số động vật nhiều để thu sản lượng huyết đủ lớn phục vụ cho thử nghiệm lâm sàng người theo tiêu chuẩn thử nghiệm huyết kháng nọc rắn Bộ Y tế, tiến tới sản xuất sử dụng lâm sàng nhằm giảm tỉ lệ tử vong di chứng cho bệnh nhân bị rắn hổ mèo cắn DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, Hoàng Anh Tuấn (2015) Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên gây miễn dịch tạo kháng huyết ngựa đơn đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) Việt Nam Tạp chí Y Dược học quân sự, 40(2):43-49 Lê Khắc Quyến, Trịnh Xuân Kiếm, Hoàng Anh Tuấn, Thái Danh Tuyên (2015) Nghiên cứu chế tạo thành công huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) Việt Nam Tạp chí Y học Việt Nam, 436(2):24 -28 Le Khac Quyen, Trinh Xuan Kiem, Hoang Anh Tuan (2019) The final assessment of Naja siamensis antivenom in experimental tests Revue Médicale - Journal of Vietnam Medical Association, 1:100111 ... rắn Do đó, đề tài ? ?Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) thực nghiệm? ?? tiến hành với mục tiêu: Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) đơn đặc hiệu... ngựa tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo đơn đặc hiệu với hiệu giá cao 2 Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) dạng F(ab')2 từ ngựa Việt Nam giới Huyết kháng nọc rắn hổ mèo. .. giá tính an toàn hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo thực nghiệm Tóm tắt đóng góp luận án: Nghiên cứu chế tạo thành công kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo (Naja siamensis) Thiết lập qui