Nghiên cứu đã chế tạo thành công kháng nguyên nọc rắn Hổ Mèo (Naja siamensis antigen). Đây là yếu tố quyết định cho việc thiết lập qui trình gây miễn dịch trên ngựa tạo ra kháng thể kháng nọc rắn Hổ Mèo đơn đặc hiệu với hiệu giá cao. Nghiên cứu đã sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn Hổ Mèo (Naja siamensis) F(ab)2 đầu tiên tại Việt Nam và trên thế giới. Đó là tính mới và thời sự. Từ kết quả nghiên cứu này, huyết thanh kháng nọc rắn Hổ Mèo (Naja siamensis antivenom) đơn đặc hiệu đóng vai trò then chốt điều trị hiệu quả trên động vật thực nghiệm với tính an toàn cao, hiệu lực mạnh. Sản phẩm tạo ra phù hợp với xu hướng y học hiện đại sử dụng antidote trong điều trị chống độc an toàn, hiệu quả.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ KHẮC QUYẾN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ KHẮC QUYẾN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO (Naja siamensis) TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Dược lý Độc chất Mã số: 9720118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS TRỊNH XUÂN KIẾM TS.BS HOÀNG ANH TUẤN HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các kết nêu luận án trung thực công bố phần báo khoa học Luận án chưa cơng bố Nếu có điều sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả Lê Khắc Quyến MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RẮN ĐỘC VÀ TAI NẠN RẮN ĐỘC CẮN 1.1.1 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn giới 1.1.2 Rắn độc tai nạn rắn độc cắn Việt Nam Tỉ lệ tử vong rắn độc cắn Trung tâm cấp cứu Sài Gòn năm 1979-1980 20% Tử vong rắn độc cắn Bệnh viện Chợ Rẫy giai đoạn 1985-1990 chưa có HTKNR đặc hiệu 19.5% Tỉ lệ giảm đáng kể từ 19,5% xuống 3.1% có HTKNR điều trị đặc hiệu giai đoạn 1990 -1996 [13] Những trường hợp tử vong rắn hổ mèo, rắn cạp nia Nhiều trường hợp bị RHM cắn để lại hậu nặng nề: cắt cụt tay, chân; di chứng co rút sau ghép da ảnh hưởng đến sống người lao động Hiện nay, Việt Nam chưa có huyết kháng nọc rắn hổ mèo (HTKNRHM) Trên thực tế Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi đồng Nhi Đồng 2, điều trị bệnh nhân bị nhiễm độc nọc RHM HTKNR hổ đất không cải thiện triệu chứng nhiễm độc chỗ tồn thân HTKNR hổ đất (Naja kaouthia) khơng có khả trung hoà chéo nọc RHM (Naja siamensis) lâm sàng [14] Do đó, cần nhanh chóng xúc tiến nghiên cứu sản xuất HTKNRHM đặc hiệu để kịp thời cứu người bị nạn 1.2 NỌC RẮN VÀ NHIỄM ĐỘC NỌC RẮN 1.2.1 Nọc rắn 1.2.2 Nhiễm độc nọc rắn người 1.3 CẤP CỨU VÀ ĐIỀU TRỊ RẮN ĐỘC CẮN 1.3.1 Cấp cứu 1.3.2 Điều trị không đặc hiệu 1.3.3 Điều trị đặc hiệu 1.4 HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN 1.4.1 Khái niệm phân loại huyết kháng nọc rắn 1.4.2 Qui trình sản xuất huyết kháng nọc rắn 1.4.3 Các thử nghiệm đánh giá huyết kháng nọc rắn 1.4.4 Tình hình sản xuất huyết kháng nọc rắn Việt Nam 1.5 RẮN HỔ MÈO 1.5.1 Đặc điểm nhận dạng phân bố 1.5.2 Nọc rắn hổ mèo 1.5.3 Triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng nhiễm độc nọc rắn hổ mèo *Nguồn: theo Lê Khắc Quyến cs (2003)[14] 1.5.4 Điều trị nhiễm độc nọc rắn hổ mèo Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Động vật nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất sinh phẩm 2.1.3 Dụng cụ trang thiết bị nghiên cứu 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.3 Các phương pháp kỹ thuật tiến hành - Thử nghiệm đánh giá tính an tồn (Safety test): 2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.5 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO 3.1.1 Kết chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo 3.1.2 Kết gây miễn dịch ngựa kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo 3.1.3 Kết phân tích kháng thể kháng nọc rắn hổ mèo huyết tương ngựa sau lần gây miễn dịch 3.1.4 Kết lấy máu, tách huyết tương truyền trả khối hồng cầu 3.1.5 Kết tinh chế huyết kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 từ ngựa 3.1.6 Kiểm định chất lượng huyết kháng nọc rắn hổ mèo F(ab’)2 đơn đặc hiệu Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin sinh phẩm y tế 3.2 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO TRÊN ĐỘNG VẬT 3.2.1 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo Ảnh 3.16 Thử nghiệm xác định liều chết trung bình nọc rắn hổ mèo 3.2.2 Thử nghiệm đánh giá xác định hiệu lực huyết kháng nọc rắn hổ mèo (median effective dose-ED50) - Tiến hành pha nọc rắn hổ mèo 100μg/ml Nọc RHM dùng 100 LD50 Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột 0,5ml hỗn hợp (nọc RHM HKNRHM theo mức 0,010 – 0,030 – 0,050ml ) ủ 60 phút cho bốn lô chuột, lô có chuột: Lơ (lơ chứng) ủ nọc RHM với nước muối sinh lý NaCl 0.9% Lô số 1, 2, 3: mức pha loãng HTKNRHM 0,010 – 0,030 – 0,050ml (Bảng 3.10) 3.2.3 Thử nghiệm đánh giá chất gây sốt (Pyrogen test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.4 Thử nghiệm đánh giá tính an tồn (Safety test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.5 Thử nghiệm đánh giá tính vơ khuẩn (Sterility test) huyết kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.6 Thử nghiệm xác định hàm lượng Thimerosal, pH natri clorid huyết kháng nọc rắn hổ mèo STT 94 Các tiêu chí lý hóa HTKNRHM cần xác định Kết 94 Tiêu chuẩn Quốc gia 94 pH 94 6.5 ± 0.3 94 6,0 - 7,0 94 94 Hàm lượng Thimerosal < 0,01% 94 < 0,02% 94 94 Hàm lượng natri clorid 0,88% ± 0.2% 0,85 - 0,9% 3.2.7 Đánh giá tính đặc hiệu huyết kháng nọc rắn hổ mèo 3.2.8 Kết điện di miễn dịch huyết kháng nọc rắn hổ mèo dạng F(ab’)2 Chương BÀN LUẬN 4.1 DỊCH TỄ RẮN HỔ MÈO CẮN, CÁCH TUYỂN CHỌN RẮN HỔ MÈO LẤY NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO 4.1.1 Dịch tễ rắn hổ mèo cách tuyển chọn rắn hổ mèo lấy nọc 4.1.2 Thu nhận nọc rắn hổ mèo 100 4.2 QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN VÀ QUI TRÌNH GÂY MIỄN DỊCH 101 4.2.1 Chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo .101 Trong sản xuất HTKNR, sử dụng độc tố thành phần nọc rắn dùng nọc độc thô làm nguyên liệu chế tạo kháng nguyên [10], [12] Theo WHO, việc khử độc phá huỷ vị trí gây độc độc tố phá huỷ ln điểm tạo tính kháng nguyên độc tố nọc rắn Khi sử dụng khử độc glutaraldehyde, protein bị phản ứng trùng hợp mức độ khó kiểm sốt khơng hồi phục Việc khử độc làm giảm đáp ứng tạo kháng thể kháng thể trung hoà độc tố tự nhiên có nọc rắn Do đó, WHO (2010) khuyến cáo không nên khử độc nọc rắn mà nên gây miễn dịch với liều thấp nhủ tương hố tốt với tá chất Freund hồn chỉnh khơng hoàn chỉnh [12] Điều thực nghiên cứu Sapsutthiapas S cs (2015) sản xuất HTKNR đa giá chống lại rắn lục xanh, rắn choàm quạp rắn lục Russel [98] Tuy nhiên, nọc RHM có nhiều độc tố cardiotoxin tác động hệ tuần hoàn cytotoxin tác động hệ thống gây tổn thương hoại tử chỗ nặng nề tử vong Điều ghi nhận quan sát thực tế lâm sàng thực nghiệm Do đó, sử dụng nọc thơ RHM làm ngun liệu sản xuất kháng nguyên để gây miễn dịch nguy động vật chủ chết Nếu sử dụng liều thấp nọc RHM thơ gây miễn dịch khả đáp ứng kháng thể động vật chủ nên nguy nghiên cứu thất bại Vì vậy, nghiên cứu mạnh dạn áp dụng việc khử độc nọc RHM glutaraldehyte nhiệt, tạo giải độc tố kháng nguyên nọc RHM Kháng nguyên giải độc tố nọc RHM làm giảm độc lực nọc rắn sử dụng liều cao để gây miễn dịch Kết nghiên cứu thành công Ngựa tạo kháng thể tốt sau gây miễn dịch tháng thứ kháng nguyên giải độc tố nọc RHM Tổn thương chỗ toàn thân ngựa hạn chế mức thấp Kháng thể tạo từ kháng nguyên giải độc tố nọc RHM có hiệu lực tốt thực nghiệm in vitro in vivo sử dụng nọc RHM thơ Qui trình khử độc để tạo giải độc tố nghiên cứu kinh điển chế tạo vắc xin Nghiên cứu thực tương tự nghiên cứu Trịnh Xuân Kiếm cs (2012) (1997) [10], [13] 101 4.2.2 Lựa chọn động vật gây miễn dịch 102 4.2.3 Lựa chọn tá chất phù hợp kích thích tạo kháng thể .103 Hiện nay, nhà sản xuất HTKNR thường chọn cách gây miễn dịch kháng nguyên nọc rắn chế tạo từ nọc rắn độc tồn phần có làm giảm độc lực không làm giảm độc lực trộn với tá chất Freund hồn chỉnh Freund khơng hồn chỉnh [61], [64], [98] Một số tác giả khác sử dụng aluminium hydroxide làm tá chất kết chưa cao [12] Trong nghiên cứu này, chọn phương pháp làm giảm độc lực nọc RHM tạo kháng nguyên giải độc tố nọc RHM phối hợp với tá chất Freund hoàn chỉnh tháng đầu tá chất Freund không hoàn chỉnh tháng Bằng việc chế tạo thành công kháng nguyên giải độc tố nọc RHM giảm độc lực đảm bảo tiêu chuẩn vô khuẩn theo hướng dẫn WHO, sản phẩm gây miễn dịch ngựa sinh kháng thể tốt làm sở cho việc tinh chế thành công HTKNRHM dạng F(ab’)2 đơn đặc hiệu với hiệu lực an toàn theo tiêu chuẩn Quốc gia yêu cầu [12],[72] 103 4.2.4 Lịch trình gây miễn dịch liều lượng kháng nguyên giải độc tố .105 Cùng với việc chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc RHM, việc gây miễn dịch cho ngựa tạo huyết ngựa có hiệu giá kháng thể đặc hiệu cao làm nguyên liệu cho việc sản xuất HTKNR khâu quan trọng Quy trình gây miễn dịch cho động vật phụ thuộc vào độc tính loại nọc rắn, tính sinh miễn dịch kháng nguyên nọc rắn khả đáp ứng sinh miễn dịch loài động vật lựa chọn Liều kháng nguyên sử dụng tăng dần kích thích tạo kháng thể động vật mà không gây chết động vật thí nghiệm [10], [12], [61] Thời gian gây miễn dịch kéo dài từ đến 15 tháng đạt nồng độ kháng thể cao máu động vật miễn dịch thời điểm để lấy toàn máu động vật miễn dịch Nghiên cứu sử dụng lịch trình gây miễn dịch cách tháng khuyến cáo WHO Thời gian gây miễn dịch tháng cho hiệu giá kháng thể cao 1/64.000 ổn định sau tháng thứ Như vậy, việc tinh chế HTKNRHM tiến hành sau thu hoạch đủ lượng huyết tương ngựa cần thiết 105 KẾT QUẢ ĐIỆN DI MIỄN DỊCH CỦA HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO DẠNG F(ab’)2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ VẮC XIN VÀ SINH PHẨM THEO TIÊU CHUẨN VIỆT NAM (DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM 2009) 5.1 Xác định an toàn chung vắc xin sinh phẩm Xác định độc tính bất thường vắc xin - sinh phẩm tiến hành chuột nhắt chuột lang Triệu chứng nhiễm độc chuột biểu sau: + Thay đổi diện mạo bên ngồi, xù lơng + Trạng thái bất thường, giảm hoạt động + Chuột giảm cân + Chuột chết nhiễm độc 5.1.1 Trên chuột lang + Mỗi thử nghiệm dùng chuột lang có trọng lượng 250 g đến 350 g, chưa dùng cho thí nghiệm trước đó, khỏe mạnh, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày đến ngày + Tiêm ổ bụng cho chuột liều tiêm cho người không ml, trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chuyên luận riêng Liều cho người trình nhãn sản phẩm + Cân trọng lượng trước tiêm cân lần vào cuối giai đoạn theo dõi Chuột phải quan sát kỹ đầu sau tiêm hàng ngày suốt ngày để phát dấu hiệu lâm sàng ốm nhiễm độc + Thử nghiệm đạt u cầu tồn chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, tăng trọng giảm cân khơng có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng Nếu có nhiều chuột chết thử nghiệm khơng đạt yêu cầu (nếu thử nghiệm xác định có giá trị) Nếu có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc lần thử đầu tiên, cần làm lại thử nghiệm với số lượng chuột gấp đôi Thử nghiệm đạt yêu cầu lần thử nghiệm thứ khơng có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc 5.1.2 Trên chuột nhắt + Mỗi thử nghiệm dùng chuột nhắt Swiss có trọng lượng 17 g/con đến 22 g/con chưa dùng thí nghiệm trước đó, khỏe mạnh, tăng trọng bình thường thời gian cách ly ngày + Tiêm ổ bụng cho chuột liều tiêm cho người không ml, trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chuyên luận riêng Liều cho người trình nhãn sản phẩm + Cân trọng lượng trước tiêm cân lần vào cuối giai đoạn theo dõi Chuột phải quan sát kỹ hai đầu sau tiêm hàng ngày suốt ngày để phát dấu hiệu lâm sàng ốm nhiễm độc + Thử nghiệm đạt yêu cầu tồn chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, tăng trọng bình thường giảm cân khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ đối chứng Nếu có nhiều chuột chết thử nghiệm khơng đạt u cầu (nếu thử nghiệm có giá trị) Nếu có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc lần thử cần làm lại thử nghiệm với số lượng chuột gấp đôi Thử nghiệm đạt yêu cầu lần thử nghiệm thứ khơng có chuột chết dấu hiệu ốm nhiễm độc 5.2 Xác định tính vơ khuẩn cho vắc xin sinh phẩm 5.2.1 Qui định chung + Một thử nghiệm quan trọng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo để kiểm soát chất lượng vắc xin sinh phẩm y tế thử nghiệm vô trùng Nhằm phát tác nhân ngoại lai vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm, thử nghiệm vô trùng không thực giai đoạn thành phẩm mà phải thực nhiều giai đoạn trình sản xuất + Theo khuyến cáo WHO, thử nghiệm vô trùng phải thực điều kiện hốt Biosafety Cabinet Class II đạt cấp độ A, phòng cấp độ B Phòng phải kiểm sốt áp suất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí giám sát vi sinh Nhân viên thực thử nghiệm vô khuẩn phải người đào tạo, có hiểu biết kinh nghiệm thực hành, trang bị phương tiện bảo hộ vơ trùng tn thủ qui trình vào khu vực 5.2.2 Môi trường dùng cho thử nghiệm vô khuẩn + Gồm loại môi trường Thioglycolat Soybean Casein Digest (SCD) dạng nước Môi trường Thioglycolat dùng để phát vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Mơi trường Soybean Casein Digest dùng để phát vi khuẩn hiếu khí vi nấm Có thể dùng môi trường khác thay môi trường thẩm định 5.2.3 Lấy mẫu + Mẫu để thử vơ trùng phải mang tính đại diện cho tồn lơ sản xuất bao gồm mẫu lấy phần có nguy bị nhiễm cao Ít giai đoạn bán thành phẩm cuối thành phẩm phải lấy mẫu để kiểm tra vô trùng 5.2.4 Phương pháp cấy trực tiếp để phát nhiễm vi khuẩn nấm + Trước kiểm tra vô trùng cần phải xác định xem vắc xin, sinh phẩm có chứa hay khơng chứa chất bảo quản có khả diệt ức chế phát triển vi sinh vật Nếu có, cần phải áp dụng biện pháp thích hợp chẳng hạn tăng thể tích môi trường nuôi cấy lọc qua màng lọc + Mẫu thử cần khử trùng sơ bên cách xịt ethanol 70% lọc vô trùng, trước chuyển vào phòng + Ngay trước thực thao tác cấy vô trùng, mẫu thử cần khử trùng lại + Với vắc xin, sinh phẩm đóng ống, phải dùng cưa, gạc vơ trùng để cưa bẻ ống mẫu thử Với vắc xin, sinh phẩm dạng đông khô, phải hồi chỉnh với dung dịch kèm trước cấy vào môi trường Riêng với sản phẩm bột khơ đóng dạng viên nén trước cấy phải hòa tan mẫu thử vào nước muối sinh lý nước cất vơ khuẩn Sau đó, cấy sang môi trường Thioglycolat Soybean Casein Digest Lượng môi trường đóng ống định quan kiểm định quốc gia, sau qua thử nghiệm kiểm định Số lượng mẫu cấy, nhiệt độ, thời gian theo dõi tương tự vắc xin, sinh phẩm dạng nước Sau cấy, cần kiểm chứng lại dung dịch nước muối sinh lý nước cất cách lấy ml, cấy ml (cho vào ống) vào ống Thioglcolat ống SCD Các ống Thioglycolat kiểm chứng ủ nhiệt độ 30 -350C, ống SCD ủ nhiệt độ 20 -25 0C với môi trường cấy mẫu kiểm tra + Cách cấy: Lắc kỹ mẫu thử trước cấy vào mơi trướng, dùng bóp cao su pipet aid có cắm pipet Pasteur co trùng để hút mẫu thử Đẩy hết khí thừa đầu pipet Đưa pipet xuống tận đáy ống môi trường, vừa phối hợp động tác bơm mẫu thử vừa kéo pipet khỏi mơi trường thử Với vắc xin, sinh phẩm đóng sẳn bơm tiêm bơm thực tiếp sản phẩm vào mơi trường ni cấy + Mỗi loạt mơi trường pha chế dùng thử nghiệm vô khuẩn phải kiểm tra chất lượng tính vơ trùng, tính tăng sinh, khả trung hòa chất ức chế 5.2.5 Đánh giá + Sản phẩm coi vô trùng khơng có 1ống mơi trường bị nhiễm + Trường hợp bị nhiễm phải làm đồ phiến nhuộm gram soi kính hiển vi để phát vi khuẩn Gram (+), Gram (-) nấm nhắc lại thử nghiệm với mẫu lưu Nếu không bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai sản phẩm coi vô trùng Nếu bị nhiễm lần kiểm tra thứ hai, dù ống có loại vi sinh vật lần thứ loạt sản phẩm không đạt yêu cầu vô trùng, phải hủy bỏ Nếu kết nhuộm soi lần kiểm tra thứ thứ hai không loại vi sinh vật, phải tiến hành kiểm tra lần thứ Nếu lần thứ kết qủa không bị nhiễm, chế phẩm coi vô trùng Nếu lần thứ bị nhiễm dù ống, cho dù loại vi sinh vật sản phẩm coi khơng đạt yêu cầu vô trùng 5.3 Xác định chất gây sốt vắc xin sinh phẩm Thử nghiệm chất gây sốt phương pháp sinh học dùng để đánh giá tính chất gây sốt vắc xin, sinh phẩm dựa tăng thân nhiệt thỏ trước sau tiêm vào tĩnh mạch dung dịch mẫu thử 5.3.1 Lựa chọn động vật thí nghiệm Thỏ khỏe mạnh, trưởng thành, đực (nhưng không mang thai), cân nặng khơng 1,5 kg, nuôi dưỡng thức ăn không chứa chất kháng sinh không bị sụt cân suốt 01 tuần trước thử nghiệm Trong thời gian 03 ngày trước thử nghiệm, khơng sử dụng thỏ cho thí nghiệm tương tự khác Cũng sử dụng thỏ trước tuần làm thử nghiệm chất gây sốt kết lần thử trước âm tính 5.3.2 Phòng thí nghiệm Thử nghiệm tiến hành phòng yên tĩnh, tránh tiếng động ánh sáng làm ảnh hưởng đến kết thí nghiệm nhiệt độ phòng khơng chênh lệch 3oC so với nơi cũ Thỏ ni riêng phòng n tĩnh có nhiệt độ 20 oC đến 25oC, cho ăn thức ăn tổng hợp khơng có chất kháng sinh Trước ngày tiêm, để thỏ nhịn ăn qua đêm (nhưng uống nước) thí nghiệm kết thúc Khơng cho uống nước thời gian làm thí nghiệm 5.3.3 Thiết bị, dụng cụ + Nhiệt kế: Để đo nhiệt độ thỏ dùng nhiệt kế thiết bị điện có độ xác 0,1 oC Khi đo nhiệt độ, nhiệt kế phải đặt sâu trực tràng thỏ cm, phải để tối thiểu phút Nếu dùng thiết bị điện, phải đặt yên trực tràng 90 phút trước tiêm giữ ngun vị trí suốt thời gian thí nghiệm + Dụng cụ thủy tinh, bơm tiêm, kim tiêm: tất phải rữa nước để pha thuốc tiêm (WFI) sấy khô 250 oC 30 phút 200oC 60 phút, dùng đồ nhựa phải không chứa chất gây sốt phải vô trùng + Lồng thỏ chuyên dụng: Trước bắt đầu, đặt thỏ lồng chuyên dụng tư thoải mái không tí trì suốt thời gian làm thí nghiệm 5.3.4 Thí nghiệm thăm dò (preliminary test) ngày đến ngày trước tiến hành tiêm vắc xin, sinh phẩm cần kiểm tra sơ tính nhạy cảm cho thỏ thí nghiệm cách tiêm vào tĩnh mạch 10 ml/kg trọng lượng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% không chứa chất gây sốt làm ấm lên khoảng 38,5 oC Ghi nhiệt độ trước tiêm tiếp tục vòng sau tiêm dung dịch nước muối sinh lý Nếu thỏ có nhiệt độ giao động so với nhiệt độ ban đầu > 0,6 oC bị loại, khơng dùng đưa vào thử nghiệm 5.3.5 Thử nghiệm (main test): Đối với mẫu vắc xin, sinh phẩm + Thỏ thí nghiệm thỏ đạt tiêu chuẩn để lồng chuyên dụng 60 phút để ổn định Sau tiến hành đo nhiêt độ thỏ lần, lần cách 30 phút (nếu đo tay) theo chương trình cài đặt (nếu đo thiết bị) Nhiệt độ ban đầu thỏ giá trị trung bình lần đo Tiêu chuẩn đưa vào thí nghiệm thỏ có nhiệt độ chênh lệch lần đo không 0,2 oC nhiệt độ ban đầu nằm khoảng 38 oC đến 39,8 oC Mỗi mẫu thử tiêm cho nhóm thỏ con, nhiệt độ chênh lệch nhó khơng q 1oC + Dung dịch dùng để tiêm thỏ vắc xin, sinh phẩm dạng nước hoàn nguyên dung dịch nước hồi chỉnh kèm dạng đông khô Trừ số vắc xin, sinh phẩm đặc biệt theo chuyên luận riêng ( đước pha lỗng dung dịch nước mối sinh lý không chứa chất gây sốt) + Tiêm chậm dung dịch vào tĩnh mạch vành tai thỏ khoảng thời gian không kéo dài phút Thể tích tiêm cho thỏ tương ứng ml/kg cân nặng Nên làm ấm dung dịch đến 38,5 oC trước tiêm Đo nhiệt độ thỏ khoảng thời gian tùy vào thiết bị sử dụng (nếu đo tay đo lần; trường hợp dùng thiết bị, nhiệt độ đo tự động theo chương trình cài đặt) khoảng thời gian sau tiêm Nhiệt độ tối đa nhiệt độ cao đo khoảng thời gian 5.3.6 Đánh giá kết + Đáp ứng thỏ hiệu số nhiệt độ tối đa sau tiêm mẫu thử nhiệt độ ban đầu + Đáp ứng thỏ nhiệt độ tối đa sau tiêm thấp nhiệt độ ban đầu + Mẫu thử được coi đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 0,6 oC tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ ≤ 1,3 oC Nếu > 2,4 oC coi không đạt yêu cầu + Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ nằm khoảng > 1,3 oC đến 2,4oC thử nghiệm cần tiến hành thỏ khác Mẫu thử đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ ≤ oC Nếu > 4,1 oC coi không đạt yêu cầu + Nếu tổng nhiệt độ chênh lệch (cộng dồn) thỏ nằm khoảng > oC đến 4,1oC cần phải làm thêm lần cuối thỏ khác Mẫu thử coi đạt yêu cầu tiêu chuẩn chất gây sốt tổng nhiệt độ chênh lệch thỏ (cộng dồn) phải ≤ 4,9 oC Nếu > 4,9 oC coi không đạt yêu cầu phải hủy vắc xin hay sinh phẩm thử nghiệm 5.4 Xác định hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm 5.4.1 Phương pháp hóa lý - Làm song song 02 mẫu (mẫu vắc xin thử mẫu chứng nước cất), lấy 0,2ml mẫu cho vào bình nút mài riêng biệt có dung tích 100ml - Cho vào bình 1,2 ml acid sulfuric đậm đặc (TT), pha lỗng lần tính theo thể tích đun nhẹ bình số (chứa mẫu vắc xin mẫu thử) cách thủy tan hết - Thêm vào bình 05ml dung dịch kali permanganat 5% (TT), lắc để yên - Loại bỏ kali permanganat thừa cách thêm 1,5 ml dung dịch hydrocylamin clorid 10% (TT), thêm 35 ml nước cất lần, 05ml dung dịch acid acetic 6M (TT) trộn - Dùng buret thêm xác vào bình 10ml dung dịch dithizon 0,001% lắc 30 giây - Chuyển toàn dung dịch thử bình vào bình lắng gạn riêng biệt, tách lớp cloroform qua lớp hấp sấy khô vào ống nghiệm - Đo mật độ quang bước sóng 580 nm ± 10 nm (kính lọc màu da cam) bước sóng 597 nm ± 10 nm (kính lọc màu đỏ) Hàm lượng thimerosal (X,%) có sinh phẩm thử tính theo công thức: a x 100 x 100 X= - = a x 0,00101 0,2 x 49,55 x 1000000 Trong đó: a lượng thủy ngân (µg) xác định theo đường chuẩn 0,2 số ml dung dịch vắc xin mẫu thử 49,55 hàm lượng thủy ngân có 100 phần Thimerosal 100 100 phần thimerosal 100 đổi phần trăm 1000000 hệ số chuyển đổi 5.4.2 Phương pháp vi sinh vật - Pha thạch thường, đun nóng chảy hoàn toàn đổ thạch dày mm lên phiến kính hình chử nhật phẳng Để thạch nguội hồn tồn, đục lỗ thạch (đường kính mm), khoảng cách lỗ 30 mm - Cấy chủng staphylococcus aureus thạch nghiêng, ủ 37 0C 18 đến 24 Gặt pha vi khuẩn nước muối sinh lý vô khuẩn thành huyền dịch 109 vi khuẩn/ml Láng huyền dịch vi khuẩn (0,5ml/đĩa thạch) đĩa thạch đục lỗ Nhỏ vào lỗ 100µl dung dịch thimerosal chuẩn chứa 1g thimerosal / lít độ pha loảng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, ủ 37 0C 24 - Đọc kết quả: Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn mọc đậm độ thimerosal chuẩn, xây dựng đường chuẩn Dựa vào đường chuẩn đường kính vùng ức chế vắc xin mẫu thử để tính hàm lượng thimerosal có vắc xin mẫu thử 5.4.3 Tiêu chuẩn chấp thuận Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal vắc xin sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản (1/10.000 merthiolat) không vượt 0,01% 5.5 Xác định pH vắc xin sinh phẩm 5.5.1 Phương pháp tiến hành - pH dung dịch vắc xin, sinh phẩm đo máy đo pH (pH meter) Máy đo pH điện kế có trở kháng đầu vào gấp 100 lần trở kháng điện cực sử dụng thường phân độ theo đơn vị pH có độ nhạy để phát thay đổi cỡ 0,05 đơn vị pH 0,003V Các điện cực thủy tinh phù hợp kiểu máy đo pH, kể máy đo pH số, phải đáp ứng yêu cầu Vận hành máy đo pH tùy theo loại máy đo pH tùy theo hướng dẫn nhà sản xuất Tất phép đođều cần phải tiến hành điều kiện nhiệt độ khoảng từ 20 - 25 C, trừ trường hợp có qui định khác chuyên luận riêng - Trước đo pH mẫu thử, cần chuẩn định máy đo pH dung dịch pH nhà sản xuất cung cấp (tối thiểu sử dụng dung dịch pH chuẩn mà pH dung dịch mẫu thử phải nằm khoảng đó) - Tráng đầu điện cực pH nước cất hai lần, dùng giấy thấm mềm chuyên dụng để thấm khô đầu điện cực Số lượng mẫu thử tối thiểu dùng để kiểm tra pH 15ml đến 20ml nên để nhiệt độ phòng trước đo Lắc rót mẫu thử vào cốc đựng mẫu, nhúng ngập điện cực vào cốc mẫu thử số pH hình ổn định xác định pH mẫu thử Sau đo pH mẫu thử xong, cần tráng lại đầu điện cực nước cất lần, dùng giấy thấm mềm chuyên dụng thấm khô đầu điện cực nhúng ngập đầu điện cực máy đo pH vào dung dịch bảo quản điện cực, ngắt điện máy đo pH 5.5.2 Tiêu chuẩn chấp thuận - Tiêu chuẩn pH chấp thuận tùy theo yêu cầu loại mẫu thử 5.6 Xác định hàm lượng natri clorid với có mặt protein vắc xin sinh phẩm 5.6.1 Nguyên lý - Phương pháp dựa phản ứng ion Cl- với một lượng bạc nitrat thừa Protein mẫu thử được oxy hóa kali permanganat mơi trường acid - Xác định lưọng bạc nitrat thừa dung dịch amoni sulfocyanid 5.6.2 Phương pháp tiến hành - Hút 0,2 ml mẫu thử vào bình nón dung tích 50 ml Thêm ml dung dịch bạc nitrat 0,01N Thêm 1ml acid nitric đậm đặc (TT) Thận trọng đun bếp sôi - Thêm giọt dung dịch bảo hòa kali permanganat có màu tím Tiếp tục đun sơi phút Thêm đường glucose bột để khử màu - Trên đáy bình xuất tủa trắng Làm nguội Thêm 0,5 ml dung dịch phèn sắt amoni bảo hòa Chuẩn độ bạc dung dịch amoni sulfocynamid 0,01 N (CĐ) có màu hồng - Song song tiến hành làm mẫu trắng (thay mẫu thử nước cất) Lượng natri clorid có tiêu tính mg% theo công thức: (A-B) x K x 0,585 x 100 X = 0,2 Trong đó: A lượng ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) dùng để chuẩn độ mẫu trắng B lượng ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) dùng để chuẩn độ mẫu thử K hệ số điều chỉnh dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N 0,585 lượng natri clorid tương ứng với 1ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (mg) 0,2 số ml dung dịch mẫu thử đem kiểm tra 100 chuyển thành % 5.6.3 Tiêu chuẩn chấp thuận: Từ 0,85% đến 0,9% ... Peroxidase – Enzym HRP Huyết Huyết kháng nọc Huyết kháng nọc rắn Huyết kháng nọc rắn hổ mèo Immunoglobulin G – Kháng thể G Immunoglobulin Yolk – Kháng thể lòng đỏ trứng Kilơ Dalton Kháng ngun Kháng thể... TUYỂN CHỌN RẮN HỔ MÈO L Y NỌC VÀ THU NHẬN NỌC RẮN HỔ MÈO 4.1.1 Dịch tễ rắn hổ mèo cách tuyển chọn rắn hổ mèo l y nọc 4.1.2 Thu nhận nọc rắn hổ mèo 100 4.2 QUI TRÌNH CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN... 3.1 CHẾ TẠO HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN HỔ MÈO 3.1.1 Kết chế tạo kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo 3.1.2 Kết g y miễn dịch ngựa kháng nguyên giải độc tố nọc rắn hổ mèo