Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y HÀ THỊ HẢI NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ XÉT NGHIỆM ELISA ĐỊNH LƢỢNG NỌCRẮN HỔ MANG MIỀN BẮC VIỆT NAM (Najaatra) Chuyênngành: Y họcchứcnăng (Miễndịch) Mãsố: 60 72 01 06 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN ĐẶNG DŨNG HÀ NỘI - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoanluậnvănnàylàcủariêngtơivàcómộtphầnsốliệutrongđềtài (cấpNhànước) cótên: hổmangNajaatracắn” Kết “Nghiêncứuchếtạobộkítchẩnđốn rắn đềtàinàylàthành quả nghiêncứucủatậpthểmàtơilàmộtthànhviênchính Tơiđãđượcchủnhiệmđềtàivàtồnbộcácthànhviêntrongnhómnghiêncứuđồng ý chophépsửdụngsốliệuđềtàinàyvàotrongluậnvănđểbảovệlấybằngthạcsĩ Cácsốliệu, kết nêutrongluậnvănlàtrungthựcvàchưatừngđượcaicơngbốtrongbấtcứcơngtrìnhnào khác Tácgiả HàThịHải LỜI CẢM ƠN Trongqtrìnhhọctập, nghiêncứuvàhồnthànhluậnvăn, tơiđãnhậnđượcrấtnhiềusựgiúpđỡ, tạođiềukiệnthuậnlợicủacácthầycơ, cácanhchị, cácbạnđồngnghiệpvàcáccơquan Trướctiên, tơi xin bàytỏlòngbiếtơnsâusắctới: TS NguyễnĐặngDũng, ChủnhiệmBộmơnMiễndịch, HọcviệnQn Y Thầyđãtậntìnhchỉdạy, hướngdẫnvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợinhấtchotơihồnthànhluậnvănnày Tơi xin bàytỏlòngkínhtrọngvàbiếtơntới PGS.TS LêVănĐơng, ngunphóChủnhiệmBộmơnMiễndịch, HọcviệnQn đãlngiúpđỡvàtheosáttơitrongqtrìnhhọctậpvànghiêncứu Tơi xin trântrọngcảmơntấtcảcácthầycơđãđọcvàchotơinhững Y ý kiếnđónggópqbáutrongqtrìnhhồnthànhluậnvăn Tơi xin trântrọngcảmơn: - Đảngủy, Ban giámhiệu, tậpthểcánbộBộmơnSinhlýbệnh - Miễndịch, tậpthểcánbộkhoaHuyếthọcbệnhviệntrườngĐạiHọc Y – DượcTháiBình - Đảngủy, Ban giámđốc, tậpthểcánbộBộmơnMiễndịch, tậpthểcánbộphòng D3 - Trungtâmnghiêncứu dượchọcQnsựvàphòngSauđạihọc, HọcviệnQn y - Đảngủy, Y Ban giámđốcvàtậpthểcánbộTrungtâmchốngđộcBệnhviệnBạch Mai Đãgiúpđỡvàtạođiềukiệnthuậnlợichotơihồnthànhluậnvănnày Cuốicùng, tơi xin chânthànhcảmơnbố, mẹ, chồngvàcác con, anhchịem, đãlnđộngviên, giúpđỡtơicảvềvậtchấtcũngnhưtinhthầnđểtơintâmhọctập, nghiêncứuvàhồnthànhluậnvănnày Họcviên HàThịHải MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt luận văn Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình Danh mục sơ đồ Danh mục biểu đồ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn Việt Nam 1.1.1 Đặc điểm sinh học rắn hổ mang Naja atra 1.1.2 Dịch tễ học tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn 1.2 Chẩn đoán điều trị nạn nhân rắn hổ mang Naja atra cắn 1.2.1 Chẩn đoán rắn hổ mang Naja atra cắn 1.2.2 Điều trị nạn nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn 1.3 Đặc điểm kháng thể IgG trình tinh chế kháng thể kháng nọc rắn 13 1.3.1 Đặc điểm kháng thể IgG 13 1.3.2 Tinh chế kháng thể 16 1.4 Các phương pháp miễn dịch phát định lượng nọc rắn 19 1.4.1 Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Immunodiffusion) 19 1.4.2 Kỹ thuật điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis) 20 1.4.3 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay - RIA) 21 1.4.4 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence) 22 1.4.5 Kỹ thuật miễn dịch quang (optical immunoassay) 22 1.4.6 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 23 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng ELISA 26 1.5.1 Vật liệu xét nghiệm 26 1.5.2 Dụng cụ thí nghiệm 26 1.5.3 Tiến hành thí nghiệm 26 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Nguyên lý 29 2.2.2 Phương pháp tối ưu hóa 31 2.2.3 Tiến hành nghiên cứu 34 2.3 Xử lý số liệu 37 2.4 Đạo đức nghiên cứu 37 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 Kết chế tạo xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang 38 Naja atra 38 3.1.1 Tinh chế kháng thể IgG từ huyết 38 3.1.2 Đánh giá hiệu giá kháng thể 39 3.1.3 Lựa chọn kháng thể 40 3.1.4 Kết tối ưu hóa xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 41 3.1.5 Thẩm định xét nghiệm ELISA định lượng sau tối ưu 50 3.2 Kết đánh giá hiệu định lượng nọc rắn xét nghiệm ELISA mẫu bệnh phẩm lâm sàng 52 3.2.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 52 3.2.2 Kết định lượng nọc rắn xét nghiệm ELISA mẫubệnh phẩm lâm sàng 54 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 56 4.1 Chế tạo xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền Bắc (Naja atra) 56 4.1.1 Tinh chế kháng thể IgG thỏ IgG ngựa đặc hiệu với rắn hổ mang Naja atra 56 4.1.2 Hiệu giá kháng thể kháng thể IgG thỏ IgG ngựa đặc hiệu kháng nọc rắn hổ mang Naja atra sau chạy sắc kí lực 56 4.1.3 Lựa chọn cặp kháng thể 57 4.1.4 Kết tối ưu hóa xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 57 4.2 Thẩm định xét nghiệm ELISA định lượng với điều kiện tối ưu 64 4.3 Kết đánh giá hiệu định lượng nọc rắn xét nghiệm ELISA mẫu bệnh phẩm lâm sàng 65 4.3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 65 4.3.2 Kết định lượng nọc rắn mẫu bệnh phẩm lâm sàng xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 67 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Chữviếttắt Chữviếtđầyđủ BN Bệnhnhân BSA Bovin serum albumin (abuminhuyếtthanhbò) CS Cộngsự ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (Kỹ thuật hấpphụmiễndịchgắn enzyme) HRP Horse Radish Peroxidase (enzyme Peroxidasetừcủcảingựa) HTKNR Huyếtthanhkhángnọc rắn IAC Immuno Affinity Chromatography (sắckýáilựcmiễndịch) IgG Immunoglobulin G (khángthểlớpIgG) IVAC Việnvắc xin vàSinhphẩm y tếNhaTrang 10 KNNR Khángnguyênnọc rắn 11 KTKNR Khángthểkhángnọc rắn 12 OD Optical density (mậtđộquang) 13 OIA Optical immunoassay (xétnghiệmmiễndịchquang) 14 OPD O -phenylenediamine (cơchất) 15 PBS Phosphat buffer salin (dung dịchđệmphosphat) 16 SVDK Snake venoms detection kit (bộxétnghiệmpháthiệnnọc rắn) 17 WHO World health oganization (Tổchức y tếthếgiới) DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Kết lựa chọn cặp kháng thể gắn kháng thể phát 40 3.2 Kết tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát nồng độ kháng thể gắn 7,5 µg/ml 41 3.3 Kết tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát nồng độ kháng thể gắn 10µg/ml 42 3.4 Kết tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát nồng độ kháng thể gắn 12,5 µg/ml 43 3.5 Kết tối ưu hóa dung dịch blocking 44 3.6 Kết tối ưu hóa thời gian ủ mẫu 45 3.7 Kết tối ưu hóa thời gian ủ kháng thể phát 46 3.8 Kết tối ưu hóa thời gian ủ kháng thể gắn enzyme 47 3.9 Kết tối ưu hóa nồng độ kháng thể gắn enzyme 48 3.10 Kết tối ưu hóa thời gian ủ chất 49 3.11 Ngưỡng phát xét nghiệm ELISA 50 3.12 Hệ số biến thiên 51 3.13 Tỷ lệ phục hồi mẫu chuẩn 51 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Hiệu giá kháng thể sau tinh 39 3.2 Đồ thị đường chuẩn phản ứng 50 3.3 Phân bố tuổi giới nhóm BN nghiên cứu 52 3.4 Phân bố nghề nghiệp nhóm BN nghiên cứu 52 3.5 Phân bố thời gian nhập viện sau bị rắn cắn nhóm BN nghiên cứu 53 3.6 Thời gian nằm viện nhóm BN nghiên cứu 53 3.7 Phân bố nồng độ nọc rắn BN lúc vào viện 54 3.8 Tương quan nồng độ nọc rắn lúc vào viện số liều huyết điều trị 54 3.9 Tương quan nồng độ nọc rắn lúc vào viện số liều huyết điều trị nhóm bệnh nhân nhập viện đầu 55 DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Rắn hổ mang 1.2 Phân bố rắn hổ mang Naja atra Châu Á 1.3 Biến chứng hoại tử tổ chức rắn hổ mang Naja atra cắn hình ảnh mẫu vật bệnh nhân đem đến 1.4 Cấu trúc phân tử IgG động vật có vú 14 1.5 Mơ hình sắc ký lọc gel 17 1.6 Nguyên lý trình tự sắc ký lực 18 1.7 Nguyên lý sắc ký lực miễn dịch – IAC 19 1.8 Kỹ thuật Mancini 20 1.9 Kỹ thuật điện di miễn dịch 21 1.10 Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch phóng xạ 21 1.11 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang 22 1.12 Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch quang phát nọc rắn 23 1.13 Nguyên lý kỹ thuật ELISA 26 1.14 Các thao tác ảnh hưởng đến kết phản ứng ELISA 27 2.1 Nguyên lý kỹ thuật ELISA sandwich 29 3.1 Sắc ký đồ tinh chế kháng thể IgG từ huyết thỏ huyết ngựa sử dụng cột Protein A G 38 3.2 Phản ứng ELISA với mẫu nọc rắn chuẩn 50 65 cao Với chất lượng vậy, xét nghiệm hồn tồn sử dụng để ứng dụng định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra lâm sàng 4.3 Kết đánh giá hiệu định lƣợng nọc rắn xét nghiệm ELISA mẫu bệnh phẩm lâm sàng 4.3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Trong số 36 bệnh nhân nghiên cứu, có 34 bệnh nhân nam chiếm tỷ lệ 89% Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Kim Sơn (2008) có 84,2% nam giới bị rắn hổ cắn tổng số 380 bệnh nhân bị rắn hổ cắn trung tâm chống độc Bạch Mai [17], Đỗ Khắc Đại (2013) nghiên cứu có 68,8% nam giới tổng số 122 bệnh nhân bị rắn cắn bệnh viện chợ Rẫy [6] Nghiên cứu phù với nghiên cứu Dong - Zong Hung va cộng (2003) với 68% nam 31 bệnh nhân nghiên cứu [31] Theo Kamolrat Silamut cộng (1978) có 159 bệnh nhân nam tổng số 251 bệnh nhân bị nhiễm độc rắn cắn chiếm 63% [37] Đối tượng bị rắn cắn chủ yếu nam nam giới lực lượng lao động gia đình Độ tuổi trung bình bị rắn cắn 46 tuổi, thấp tuổi cao 89 tuổi Độ tuổi bị rắn cắn nhiều từ 30 – 52 tuổi, người độ tuổi lao động Nghiên cứu có kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Kim Sơn (2008) với độ tuổi bệnh nhân bị nhiễm độc rắn cắn từ 20 – 49 tuổi [17] Theo nghiên cứu George E Allen cộng (2012) thống kê 136 bệnh nhân bị nhiễm độc rắn cắn Úc với độ tuổi trung bình bị rắn cắn 42 tuổi tập trung từ 25 – 53 tuổi [33] Trong nghiên cứu chúng tơi có trường hợp 15 tuổi bị rắn hổ mang Naja atrachiếm 6% đối tượng hiếu động, nên không sợ tiếp xúc với nguy hiểm rắn độc nên chúng thường bắt nghịch rắn điều phù hợp với nghiên cứu Ngô Ngọc Quang Minh [14] 66 Phần lớn bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atracắn nghiên cứu làm ruộng 25 bệnh nhân tổng số 36 bệnh nhân nghiên cứu chiếm 70% Họ người phải thường xuyên tiếp xúc với môi trường hoạt động sinh sống rắn thường vào thời điểm ban đêm rắn săn mồi Phần lớn số gặp rắn họ thường bắt rắn để bán ăn thịt Ngồi tỷ lệ khơng nhỏ chiếm 14% người làm nghề nuôi bắt rắn cơng việc vơ nguy hiểm ảnh hưởng lớn đến tính mạng tổn thất tiền bạc bị rắn cắn Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Kim Sơn (2008) với tỷ lệ lớn phân bố nghề nghiệp người nơng dân làm ruộng (49,5%) nuôi bắt rắn (30,8%) [17] Thời gian kể từ bị rắn cắn đến nhập viện sớm hay muộn có ảnh hưởng lớn đến việc điều trị tiến triển bệnh nhân đồng thời ảnh hưởng đến kết định lượng nọc máu bệnh nhân Trong nghiên cứu bệnh nhân nhập viện 24 đầu 34 bệnh nhân tổng số 36 bệnh nhân nghiên cứu chiếm 92% Trong số bệnh nhân nghiên cứu đến viện trước giờlà 26 bệnh nhân tổng số 36 bệnh nhân nghiên cứu chiếm 72% Bên cạnh đó, có bệnh nhân vào viện ngày thứ bệnh nhân vào viện ngày thứ Kết phù hợp với kết nghiên cứu Dong - Zong Hung va cộng (2003)khi nghiên cứu 27 bệnh nhân nhiễm độc rắn Naja atra cắn có 22 bệnh nhân đến viện trước 24 chiếm 81% 18 bệnh nhân đến viện trước chiếm 67%[31] Thời gian từ bị rắn cắn đến nhập viện 69 trường hợp bị rắn độc cắn bệnh viện chợ rẫy nghiên cứu Ngô Ngọc Quang Minh tương tự với 80% nhập viện trước 24 40% nhập viện trước Rắn độc cắn tai nạn gây tử vong cao thường triệu chứng chỗ toàn thân xuất sớm ngày tăng đầu Có lẽ lí khiến bệnh nhân phải đến viện sớm [14] 67 Thời gian nằm viện nhóm bệnh nhân nghiên cứu chủ yếu dao động từ 3-4 ngày, có bệnh nhân nằm điều trị đến ngày, nhiều so với nhóm bệnh nhân bị rắn cạp nia hay số loài rắn độc khác cắn khơng có HTKNR đặc hiệu [17] Những bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn nằm điều trị trung tâm chống độc Bạch Mai phần lớn để truyền HTKNR đến thấy giảm triệu chứng lâm sàng họ thường chuyển tuyến điều trị tiếp biến chứng xin viện tiếp tục điều trị nhà theo hướng dẫn thầy thuốc.Có thể thấy, việc sử dụng HTKNR kịp thời giúp hạn chế di chứng thời gian nằm viện nhóm bệnh nhân này.Tuy nhiên, điều kiện tiên cho sử dụng HTKNR phải xác định loài rắn gây tai nạn, sau phải có sở khoa học để đưa liều HTKNR trường hợp cụ thể Nếu dựa vào triệu chứng lâm sàng hạn chế thực bệnh viện tuyến cuối nơi có chuyên gia nhiều kinh nghiệm Hơn nữa, bệnh viện tuyến cuối, việc xác định loài rắn lựa chọn HTKNR thường thực biểu lâm sàng rõ, điều dẫn đến sử dụng HTKNR muộn, chủ yếu để cứu tính mạng nạn nhân chưa hạn chế di chứng tổn thương nọc độc gây Từ sở khách quan cho thấy, việc phát triển xét nghiệm định lượng nọc rắn có ý nghĩa, kịp thời phù hợp với nhu cầu thực tiễn 4.3.2 Kết định lượng nọc rắn mẫu bệnh phẩm lâm sàng xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra Sau định lượng nọc rắn tổng số 72 mẫu bệnh phẩm huyết 36 bệnh nhân có 36 mẫu lấy lúc vào viện 36mẫu sau truyền HTKNR Nồng độ nọc rắn bệnh nhân lúc vào viện định lượng xét nghiệm ELISA có dải nồng độ từ 2,8 - 159,1 ng/ml Trong đó, có 26 bệnh nhân chiếm 72% có nồng độ nọc rắn 50 ng/ml; có bệnh nhân chiếm 17% có nồng độ nọc rắn từ 50 - 100 ng/ml; bệnh nhân chiếm 68 11% có nồng độ 100 ng/ml Kết định lượng chúng tơi có dải nồng độ ngắn so với kết nghiên cứu Dong – Zong Hung cộng (2003) định lượng 27 mẫu huyết bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn có dải nồng độ từ – 1270 ng/ml [31] Sự khác biệt lý giải số mẫu nghiên cứu thấp nên chưa đủ để mang tính đại diện, nhiều trường hợp vào viện muộn nên kết định lượng khơng tương xứng với triệu chứng lâm sàng Tuy nhiên, với nồng độ nọc rắn định lượng đa phần 50 ng/ml, kết phù hợp với nghiên cứu Andrew Churchman (2010) [26] George E Allen (2012) [33] Từ liệu nồng độ nọc rắn bệnh nhân trước điều trị số lượng lọ HTKNR dùng điều trị cho bệnh nhân chúng tơi xây dựng mối tương quan tuyến tính có ý nghĩa thống kê với hệ số xác định bội R2 = 0,51 Tuy nhiên, phân tích liệu từ nhóm bệnh nhân nhập viện đầu chúng tơi nhận thấy có mối liên quan chặt chẽ với R = 0,72 Điều thấy, sử dụng xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn bệnh nhân nhập viện sớm đầu có ý nghĩa định hướng điều trị Trong nghiên cứu xây dựng phương trình tuyến tính thể mối tương quan song số mẫu dừng lại mức độ định lượng mẫu bệnh phẩm huyết lâm sàng nên việc đưa liều điều trị bị hạn chế Vì để xây dựng phương trình tuyến tính thể mối tương quan nồng độ nọc rắn số lọ HTKNR cần dùng hay nói cách khác để đưa liều lượng cụ thể cho bác sỹ điều trị cần phải tiến hành với cỡ mẫu với số lượng bệnh nhân lớn thời điểm lấy mẫu theo quy định tương ứng với việc sử dụng HTKNR đồng thời phối hợp với triệu chứng lâm sàng bệnh nhân bị rắn cắn 69 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu xây dựng xét nghiệm ELISA định lƣợng nọc rắn hổ mang Naja atra, rút số kết luận nhƣ sau: - Một số điều kiện tối ưu cho phản ứng ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najaatra: + Nồng độ kháng thể gắn (IgG ngựa kháng nọc rắn) 10µg/ml + Nồngđộkhángthểpháthiện (IgGthỏkhángnọc rắn) 5µg/ml + Dung dịch Blocking gelatin 1% + Thờigian ủmẫulà 60 phút + Thờigian ủ kháng thể phát 30 phút + Thời gian ủ kháng thể gắn enzyme 30 phút - Chất lượng xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Najaatravới điều kiện tối ưu: + Ngưỡng phát (LOD) xét nghiệm 0,1 ng/ml + Độ lặp lại đạt yêu cầu xét nghiệm định lượng (hệ số biến thiên CV = 3,13 %) + Tỉ lệ phục hồi mẫu chuẩn 98,12% Kết định lƣợng nọc rắn hổ mang Naja atra: - Dải nồng độ nọc rắn mẫu huyết 36 bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn trước điều trị định lượng xét nghiệm: 2,8 – 159,1ng/ml - Có mối tương quan thuận tuyến tính mức độ chặt chẽ nồng độ nọc rắn với liều sử dụng HTKNR dùng điều trịở nhóm bệnh nhân nhập viện đầu (với R2 = 0,72) 70 KIẾN NGHỊ - Tuy xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra chế tạo từ nguồn sinh phẩm thương mại hóa huyết ngựa đặc hiệu Đài Loan cộng hợp HRP – kháng thể kháng thỏ hãng Thermo cung cấp; chế phẩm IgG thỏ đặc hiệu dùng nghiên cứu dạng nguyên vẹn nên có độ ổn định caonhưng để có xét nghiệm ELISA thương phẩm cần phải đánh giá độ ổn định điều kiện bảo quản xét nghiệm với thời gian tháng, 12 tháng - Để ứng dụng xét nghiệm định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra sở cấp cứu điều trị rắn độc cắn giúp cho định liều HTKNR cần phải tiến hành đánh giá số lượng lớn mẫu bệnh phẩm nhóm bệnh nhân điều trị HTKNR đầu DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Hà Thị Hải, Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Trung Nguyên, Phùng Thế Hải, Nguyễn Đặng Dũng (2015),“Nghiên cứu phát triển kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ”, Tạp chí Y dược học quân sự, số 2, tr 38 – 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vũ Triệu An, Jean claude homberg (2001), “Đáp ứng miễn dịch dịch thể globulin miễn dịch”, Miễn dịch học, nhà xuất y học, tr 190 216 Hoàng Ngọc Anh, Bùi Thanh Xuân, Đặng Trần Hoàng (2006), “Tách neurotoxin từ nọc rắn hổ mang Việt Nam (Naja naja)”, Tạp chí Hố học, 44(4), tr 449-453 Hoàng Ngọc Anh, Đặng Trần Hồng, Trƣơng Nam Hải (2006), “Khảo sát chất có hoạt tính sinh học nọc rắn hổ mang Naja naja”, Tạp chí Dược liệu, (5), tr 198-238 Bùi Quốc Anh, Nguyễn Thành Long, Đỗ Văn Thƣờng (2014), “Phát triển kít ELISA phát nhanh dư lượng melamine sản phẩm sữa thức ăn chăn nuôi”, Hội thảo quốc tế Hợp tác khoa học công nghệ nghiệp phát triển bền vững nơng nghiệp Lâm Đồng – Tây Nguyên, tr 131- 137 Nguyễn Văn Cƣờng, Đặng Thanh Hà, Thái Hạnh Quyên (2005), “Phát triển phương pháp xác định tồn dư 2,4-D hoa kỹ thuật ELISA”, Nông nghiệp phát triển nông thôn, (1), tr 69 -71 Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Đặng Dũng, Lê Văn Đông (2008), “Nghiên cứu chế tạo huyết kháng nọc rắn bốn loài rắn độc thường gặp Việt Nam làm nguyên liệu chế tạo xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn”, Tạp chí Y dược học Quân sự, số 33, tr 108-113 Lê Văn Đông cs (2013), Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA phát nọc rắn độc ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn Việt Nam, Báo cáo kết đề tài, Học viện Qn Y, Bộ Quốc phòng Phạm Cơng Hoạt, Lê Thị Nhung (2012), “Thiết lập quy trình phản ứng Sandwich – ELISA phát E coli O157: H7 thịt bò”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn, (10), tr 43-49 Phạm Mạnh Hùng, Nguyễn Đặng Dũng, Lê Văn Đông (2011), Miễn dịch học, Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội 10 Trịnh Xuân Kiếm, Lê Thị Hồng Hạnh (2009), “Chế tạo huyết kháng nọc rắn, ứng dụng lâm sàng Việt Nam”, Tạpchí Y họcViệt Nam, (2), tr 11-15 11 Trịnh Xn Kiếm (2011), “Xác định tính an tồn hiệu điều trị huyết kháng nọc rắn hổ đất Việt Nam sản xuất”, Tạp chí y dược học quân sự, (1), tr 1-4 12 Trịnh Xuân Kiếm (2009), “Nghiên cứu thành cơng qui trình kỹ thuật chế tạo huyết kháng nọc rắn hổ chúa”, Y học Việt Nam, (1),tr 38-42 13 Trần Kiên Nguyễn Quốc Thắng (1980), Các loài rắn độc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 14 Ngô Ngọc Quang Minh (2005), “69 trường hợp rắn độc cắn Bệnh viện Nhi đồng I”, Y học thực hành, (2), tr 55-58 15 Đỗ Trung Phấn cs (2005), Kỹ thuật xét nghiệm huyết học truyền máu ứng dụng lâm sàng, Nhà xuất Y học, Hà Nội,tr 176 - 202 16 Nguyễn Thị Lan Phƣơng Cs (2007), “Xây dựng thẩm định phương pháp ELISA- Fetuin định lượng kháng nguyên độc tố ho gà (PT) vacxin ho gà tồn tế bào”, Tạp chí Y học dự phòng,7(92), tr.21-25 17 Nguyễn Kim Sơn (2008), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng điều trị bệnh nhân bị số rắn độc cạn cắn thuộc họ rắn hổ (ELAPIDAE) miền bắc Việt Nam, luận án tiến sỹ y học, Trường Đại học y Hà Nội 18 TCVN 7608:2007 (ISO 24276:2007), Thực phẩm – phương pháp phân tích để phát sinh vật biến đổi gen sản phẩm có nguồn gốc biến đổi gen – yêu cầu chung định nghĩa, phần 3: thuật ngữ định nghĩa 19 Nguyễn Hồng Thanh, Nguyễn Kim Tấn, Trƣơng Nam Hải (2009), “Nghiên cứu thành phần nọc rắn hổ đất (Naja Kaothia)”, Tạp chí sinh học,31(2), tr 89-94 20 Nguyễn Văn Thiết (2006), “Kết tách enzym ribonucleaza từ nọc rắn hổ mang phương pháp sắc kí trao đổi ion cột CM- XEN-LULƠ”, Tạp chí sinh học, 28(3), tr 83-87 21 Nguyễn Văn Thiết (2002), “Nghiên cứu hoạt tính Ribonucleolytic nọc rắn hổ mang”, Tạp chí y dược liệu, 7(6), tr 181-185 22 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2006), “Nghiên cứu chiết tách tính chất nọc rắn hổ mang Việt Nam Naja Naja”, Tạp chí phân tích hóa, lý sinh học, 11(4),tr.66-68 23 Nguyễn Thị Tuấn (2010), Nghiên cứu chế tạo IgG kháng vi rút Colti nhóm B họ Reoviridae cho sinh phẩm elisa sandwich, luận án tiến sỹ, Học viện quân y 24 Thái Danh Tuyên, Trịnh Xuân Kiếm, Đỗ Trung Phấn (2011), “Nghiên cứu chế tạo kháng nguyên nọc rắn cạp nia dùng sản xuất Antivenom Việt Nam”, Tạp chí y dược học quân sự, (6), tr 69-77 Tiếng Anh 25 A.Rial, V Morais, S Rossi, H Massaldi (2006), “A new ELISA for determination of potency in snake antivenoms”, Toxicon, (48), pp 462-466 26 Andrew Churchman, Margaret A O’Leary, Nicholas A Buckley, et all (2010), “Clinical effects of red – bellied black snake (Pseudechis porphyriacus) envenoming and correlation with venom concentration: Autralian Snakebite Project (ASP-11)”, Bites and stings, (193), pp 696 – 700 27 Biranchni Narayan Mohapatra, CBK Mohanty (2010), “Guidelines for anti snakevenom therapy”, Medicine update, (20), pp 427-430 28 Coligan John E., et al.(2005), Short protocols in Immunology 29 Chi- Wen Juan (2012), “Venomouns Snake Bites in Taiwan”, J Emerg Crit Care Med, (23), pp.93-108 30 Christane K F., Christin Plassen (2008), “Quantitative sandwich ELISA for the determination of fish in foods”, Journal of immunological Methods, pp 45-5 31 D.-Z.Hung, Ming-Yi Liau, Shoei-Yn Lin Shiau (2003), “The clinical significance of venom detection in patients of cobra snakebite”, Toxicon, (41), pp.409-415 32 Emmanuel Selvanayagam Z., Gnanavendhan S.G., et al (1999), “ELISA for detection of venoms from four medically important snakes of India”, Toxicon, (37), pp.757-770 33 George E Allen, Simon G A Brown, Nicholas A.Buckley, et all (2012), “Clinical effects and Antivenom Dosing in Brown Snake (Pseudonaja spp.) Envenoming – Australian Snakebite Project (ASP)”, Brown snake envenoming and antivenom dose, 7(12), pp 1- 34 Hand book (2002), Antibody Purification, Amersham Biosciences, pp 27- 57 35 Howard M Chandler, John G.R Hurrell (1982),“A new enzyme immunoassay system suitable for field use and its application in a snake venom detection kit”, Clinica Chimica Acta, (121), pp.225-230 36 John R Crowther (2000), The ELISA Guidebook, Methods in Moclecular Biology, Humana press, UK 37 Kamolrat Silamut, May Ho, Sornchai Looareesuwan, Chaisin Viravan, Vanaporn Wuthiekanun, David a Warrell (1987), “Detection of venom by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in patients bitten by snakes in Thailand”, British medical journal, (294),pp.402-404 38 Kasturiratne, A.; Wickremasinghe A R., de Silva N., Gunawardena N K., Pathmeswaran A., et al (2008), “The Global Burden of Snakebite: A Literature Analysis and Modelling Based on Regional Estimates of Envenoming and Deaths”, PloS Medicine, Volume 5(11), pp 1591-1604 39 Kulawickrama S, O’Leary MA, Hodgson WC, Brown SG, Jacoby T, Davern K, Isbister GK (2010), “Development of a sensitive enzyme immunoassay for measuring taipan venom in serum”, Toxicon, 55(8), pp 1510-1518 40 Le Van Dong, Emmanuel Selvanayagam Z., Gopalakrishnakone P., Khoo Hoo Eng (2002), “ A new avidin- biotin optical immunoassay for the detection of beta- bungarotoxin and application in diagnosis of experimental snake envenomation”, Journal of immunological Methods,(260), pp 125-136 41 Le Van Dong, Khoo Hoon Eng, et al (2004), “Optical immunoassay for snake venom detection”, Biosensors and Bioelectronics, (19), pp.1285-1294 42 Le Van Dong, Le Khac Quyen, Khoo Hoon Eng, P Gopalakrishnakone (2003), "Immunogenicity of venoms from four common snakes in the South of Vietnam and development of ELISA kit for venom detection", Journal of Immunological Methods, (282), pp.13-31 43 Long- sen Chang, Hsien-bin Huang, Shinne-ren Lin (2000), “The multiplicity of cardiotoxins from Naja naja atra (Taiwan cobra) venom”, Toxicom,(38), pp 1065-1076 44 OF Wong, Tommy SK Lam, HT Fung, CH Choy (2010), "Five years experience with Chinese cobra (Naja atra) related injures in two acute hospitals in Hong Kong", Hong Kong Med J , (16), pp 36-43 45 Paula G.S (2003), “Animal experimentation in snake venom reseach and in vitro alternatives”, Toxicon,(42), pp 115-113 46 Pukrittayakamee S., Ratcliffe P J., et al (1987), “ A competitive activator of Russell’s viper venom”, Toxicon, (25), pp 721- 729.Salvi N.C., Deopurkar R.L., Waghmare A.B., et al (2010), “Validation of indirect ELISA for quantitative testing of rabies antibodies during production of antirabies serum using equines”, Procedia in Vaccinology, (2), pp 3-11 47 Sarah M Andrew, Julie A Titus of (2000),“Purification immunoglobulin G”, Curent Protocols in Cell Biology, 16.3.1-16.3.12 48 Sutherland S K., Coulter A R., Broad A J., et al (1975), “ Human snake bite victims: The successful detection of circulating snake venom by radioimmunoassay”, The medical Journal of australia pp 27 – 29 49 Theakston, R.D., Lloyd-Jones, M.J., Reid, H.A., (1977), “MicroELISA for detecting and assaying snake venom and venomantibody”,Lancet, (2), pp 639–641 50 VíctorMorais, Patricia Berasain, et al (2012), “Humoral immune responses to venom and antivenom of patients bitten by Bothropssnackes”, Toxicon, (59), pp 315- 319 51 WHO, David A War (2010),“Guidlines for the management of snakebites”, pp 33-34 52 WHO, David A War (2010),“Guidlines for the management of snakebites”,pp 77-89 BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã NC: Chếtạobộxétnghiệm ELISA định lƣợng nọc rắn hổmangNajaatra I Phầnhànhchính: Họvàtênbệnhnhân: Tuổi Giới Mãlưutrữ: Mãbệnhnhân: Địachỉ: Nghềnghiệp: Ngàyvàoviện: Ngàyraviện: Tổngsốngàyđiềutrị: II Mộtsốđặcđiểmđánhgiá nạnnhânbị rắn hổmangNajaatracắn 𝑁ơ𝑖 𝑏ị 𝑟ắ𝑛 𝑐ắ𝑛: Nhà  Cánhđồng  Trênđườngđi  Nơikhác  Nuôibắt rắn  Gặp rắn bắt  Giếtvàtrêu rắn  Lý khác   Rắn ninhốt  Đầu, cổ  Thânmình  Chân  Tay  Lý bị rắn cắn: Nơi rắn cưtrú: Rắn tựnhiên Vịtrívếtcắn: Mẫu rắn: Mangđượccả rắn đến Cóảnhcủa rắn  Mangđượcbộphậncủa rắn  Môtảlại Trọng lượng rắn: gram Thờiđiểm rắn cắn: Khoảngthờigiantừkhibị rắn cắnđếnkhitớitrungtâmchốngđộc Sơcứutrướckhiđếntrungtâmchốngđộc Khơnglàmgì  Nặnvàchíchrạch Garo Đắpthuốc  Rửavếtcắn   10 Chẩnđoán rắn hổmangNajaatra Mẫu rắn  Triệuchứnglâmsàng Khác Test nhanh   11 Thờiđiểmdùnghuyếtthanhsaukhi rắn cắn: 12 Số lượng huyếtthanhkhángnọcdùngđiềutrịchobệnhnhân lọ  lọ  5-10 lọ Trên 20 lọ  13 Mẫuxétnghiệmlấytạicácthờiđiểm: 14 Kết điềutrị : Tửvong  Nặnghơn  KhôngĐỡ  Đỡ  Khỏi  15 Tìnhhìnhraviện Ra viện Chuyểnviện Xin về ... chế tạo xét nghiệm ELISA định lƣợng nọc rắn hổ mang miền Bắc Việt Nam (Naja atra)”nhằm mục tiêu sau: Chế tạo xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền Bắc (Naja atra) Đánh giá khả định lượng. .. hóa xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 57 4.2 Thẩm định xét nghiệm ELISA định lượng với điều kiện tối ưu 64 4.3 Kết đánh giá hiệu định lượng nọc rắn xét nghiệm ELISA. .. ưu hóa xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 41 3.1.5 Thẩm định xét nghiệm ELISA định lượng sau tối ưu 50 3.2 Kết đánh giá hiệu định lượng nọc rắn xét nghiệm ELISA mẫu