Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chuẩn đoán rắn độc cắn ở việt nam

luận văn

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường gặp ở các nước nhiệt đới, với trên 2,5 triệu người bị rắn độc cắn và khoảng 125.000 người tử vong do rắn độc cắn mỗi năm [39], [40], [66], [68], [121]. Ở nước ta, các chuyên gia ước tính mỗi năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn nhưng phần lớn không được báo cáo ghi nhận đầy đủ do nạn nhân tử vong trước khi kịp đến cơ sở y tế hoặc được cấp cứu và điều trị theo các biện pháp dân gian [wilken]. Thống kê số liệu của gần hai nghìn bệnh nhân rắn độc cắn nhập viện, các chuyên gia của Bệnh viện Chợ Rẫy nhận định một số loài rắn độc thường gây tai nạn rắn cắn nhất ở khu vực Miền Nam nước ta là rắn lục xanh (43,3%), hổ đất (23,8%), chàm quạp (19,4%), hổ mèo (10%) và hổ chúa (1,2%) [77]. Nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của nạn nhân sau khi sống sót [39]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, phương pháp điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [114]. Ở Việt Nam, đã có 2 loại HTKNR thương phẩm được sử dụng trên lâm sàng đó là huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh và hổ đất do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) ở Nha Trang sản xuất. Tuy nhiên, việc sử dụng 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu này chỉ thực sự hiệu quả khi xác định sớm và chính xác loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn [2]. Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn để sử dụng HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm. Hiện nay trên thế giới đã có một số loại xét nghiệm được dùng để phát hiện nọc rắn độc của Úc, Ấn Độ và Đài Loan ngay trên thực địa và lâm sàng 2 tại các nước này. Tuy nhiên, do đặc điểm địa lý khác nhau nên có sự phân bố các loài rắn khác nhau giữa các vùng địa lý. Từ đó, xét nghiệm phát hiện nọc của loài rắn độc có ở khu vực này không sử dụng được để phát hiện nọc của loài rắn có ở khu vực khác [15], [56]. Do vậy, cần phải phát triển các xét nghiệm phát hiện riêng nọc rắn của các loài rắn độc sinh sống ở Việt Nam mà cho tới nay nước ta vẫn chưa có [5]. Bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc là bộ xét nghiệm cấp cứu; Ngoài khả năng phát hiện nhanh và chính xác nọc độc, bộ xét nghiệm này còn đòi hỏi phải đơn giản, dễ sử dụng, bền vững trong các điều kiện bảo quản và sử dụng ở thực địa, nơi có trang thiết bị tối thiểu. Với các lý do trên, kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzym (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) thường được áp dụng cho mục đích này. Trong các dạng xét nghiệm ELISA, thì ELISA sandwich sử dụng hệ khuếch đại avidin-biotin (AB-ELISA) và ELISA sandwich sử dụng kháng thể thứ ba gắn enzym (AbE-ELISA) là hai dạng thiết kế được ứng dụng nhiều nhất trong phát triển bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam” được tiến hành nhằm: 1. Chế tạo bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn lục xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa và phát triển bộ xét nghiệm AbE-ELISA phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất ở Việt Nam. 2. Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệm ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. TAI NẠN RẮN CẮN VÀ CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN 1.1.1. Một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn cắn ở Việt Nam Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam. Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có sự đa dạng về các loài rắn độc. Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng (1995), Việt Nam có hơn một trăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới nước [8]. Trong đó, một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn độc cắn ở nước ta đó là: 1.1.1.1. Rắn lục xanh (Trimeresurus albolabris) Hình 1.1. Rắn lục xanh đuôi đỏ *Nguồn: theo Trần Thị Kim Ngân (2011) [9]. 4 Rắn lục xanh (Trimeresurus stejnegeri K. Schmidt, 1925) là loài rắn có chiều dài dưới 1 m, sống ở trên cây, phần trước cơ thể nhỏ phân biệt rất rõ với cổ, có hố má. Mặt lưng màu xanh lá cây, mặt bụng màu xanh lá cây nhạt hơn. Dọc bên thân có thể có đường màu trắng hay vàng, ở cá thể đực đường này thường có màu đỏ. Mỗi lứa đẻ có từ 3 đến 10 rắn con; rắn sơ sinh trông giống rắn trưởng thành. Có nọc độc và nguy hiểm [8]. Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn lục xanh cắn chiếm tỷ lệ 43,3% là loài rắn gây ra tai nạn rắn độc cắn nhiều nhất trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77]. 1.1.1.2. Rắn hổ đất (Naja naja kaouthia) Hình 1.2. Rắn hổ đất *Nguồn: theo Lê Văn Đông (2010) [4]. 5 Rắn hổ đất (Naja naja kouthia Linnaeus 1758) ở miền Nam Việt Nam là loài rắn cỡ lớn, đầu không phân biệt với cổ, không có vảy má. Rắn có khả năng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở phía trên cổ trông rõ một vòng tròn màu trắng. Rắn hổ miền Bắc Việt Nam (từ Đà Nẵng trở ra), ở hai bên vòng tròn có giải màu trắng (gọi là gọng kính). Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen, hoặc đồng màu hoặc có những dải hoa văn như những vạch ngang đơn hoặc kép sáng màu hơn. Chiều dài cơ thể tới 200 cm [8]. Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổ đất cắn chiếm tỷ lệ 23,8 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77]. 1.1.1.3. Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma) Hình 1.3. Rắn chàm quạp *Nguồn theo Lê Văn Đông ( 2010) [4] Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, Boie, in Boie, 1827) là loài rắn có chiều dài khoảng 100cm với chín vảy che rắn chắc và cân đối ở phía 6 trên đỉnh đầu. Mõm nhọn và chĩa lên phía trên. Sống mũi kéo dài từ mắt đến mõm. Thân không dày lắm, các vảy trơn nhẵn. Hoa văn trên thân gồm từ 19 đến 31 dấu hình tam giác màu nâu thẫm viền trắng sắp xếp thành từng đôi hoặc đối diện nhau hoặc xen kẻ. Các con cái đẻ từ 13 đến 30 trứng và canh giữ trong suốt khoảng thời gian từ 5 đến 7 tuần lễ ấp trứng. Rắn con dài từ 13 - 20cm trông giống như rắn trưởng thành [8]. Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn chàm quạp cắn chiếm tỷ lệ 19,4 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77]. 1.1.1.4. Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) Hình 1.4. Rắn hổ mèo *Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77]. Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) là loài rắn có đầu không phân biệt với cổ, không có vảy má. Rắn có khả năng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở 7 phía trên cổ nhìn rõ hai vòng tròn cân đối ở hai bên (giống hai mắt kính nên còn gọi là rắn mắt kính) được nối với nhau bởi một vệt hoa văn hình chữ V (giống gọng kính hình chữ V). Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen, hoặc đồng màu. Chiều dài cơ thể tới 160 cm, chiều dài trung bình khoảng 90 – 120 cm. Rắn con non mới nở có hình dạng giống rắn trưởng thành và có khả năng bạnh cổ [8]. Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổ mèo cắn chiếm tỷ lệ 10 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77]. 1.1.1.5. Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) Hình 1.5. Rắn hổ chúa *Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77]. 8 Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah Cantor, 1836) là loài rắn độc có kích thước lớn nhất, chúng có khả năng bạnh cổ song không bạnh to được bằng rắn hổ mang thường. Mặt trên đầu rắn hổ chúa có 2 tấm vảy chấm lớn. Lưng rắn trưởng thành có màu vàng lục hay nâu nhiều khi chỉ có màu đen chì. Cá thể non lưng có màu đen với nhiều vệt ngang sáng, ở cổ có hình chữ V ngược màu vàng nhạt. Chiều dài cơ thể khoảng 300 – 400 cm, có khi đạt tới 500 cm [8]. Theo nghiên cứu của Lê Khắc Quyến (2003) nhận thấy, tuy tỷ lệ gây tai nạn của rắn hổ chúa chỉ chiếm 1,2 % nhưng tỷ lệ tử vong của những nạn nhân bị rắn hổ chúa cắn phải nhập viện lại rất cao, nếu không có huyết thanh điều trị đặc hiệu [77]. Ngoài những loài rắn được mô tả ở trên còn có một vài loài rắn khác cũng là thủ phạm gây ra tai nạn rắn độc cắn ở Việt Nam như: Rắn cạp nia (Bungarus candidus) chiếm tỷ lệ là 2,1 % và rắn biển (sea snakes) chiếm tỷ lệ là 0,2 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn [77]. 1.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng rắn độc cắn Rắn độc cắn là vấn đề y tế và xã hội lớn ở nhiều nước trong các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở các nước nghèo và đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Rắn cắn được coi là một tai nạn nghề nghiệp của những người hoạt động bắt rắn, chăn nuôi rắn, những người làm rừng, nông dân, ngư dân. Hai khu vực có nhiều nạn nhân bị rắn cắn là Đông Nam Á và Châu Phi [77]. Tại nước ta, về mặt dịch tễ học, chưa có khảo sát ở cấp độ quốc gia nào được thực hiện để ước tính tỉ lệ bệnh nhân bị rắn cắn thực tế. Theo nghiên cứu của Lê Khắc Quyến năm 2003 cho thấy tai nạn rắn cắn xảy ra ở hầu hết các vùng trong cả nước [77]. Số liệu từ 3 bệnh viện đa khoa khu vực cho thấy số trường hợp rắn cắn điều trị tại các bệnh viện này là các con số đáng kể. Tại 9 bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội năm 2001 có 155 trường hợp và năm 2002 có 129 trường hợp bị rắn cắn nhập viện. Tại Bệnh viện 17 Đà Nẵng năm 1991 có 84 bệnh nhân bị rắn cắn. Tại bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh hàng năm có từ 600 đến 1.000 ca rắn cắn nhập viện [77]. Các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân nhiễm độc do rắn cắn rất đa dạng, phong phú, bao gồm các triệu chứng tại chỗ và toàn thân. Các triệu chứng phụ thuộc vào loài rắn độc đã gây ra tai nạn rắn cắn và lượng nọc rắn độc xâm nhập vào trong cơ thể nạn nhân. Trong đó, những bệnh nhân bị các loài rắn hổ cắn với biểu hiện tại chỗ rất mờ nhạt, hầu như chỉ xác nhận có dấu răng và có móc độc tại chỗ vết cắn. Theo Nguyễn Kim Sơn năm 2008, dấu hiệu có dấu răng và có móc độc tại chỗ vết cắn chiếm tỷ lệ là 56,6 % trong tổng số 380 bệnh nhân bị rắn hổ cắn điều trị tại khoa hồi sức cấp cứu A9 và Trung tâm Chống độc Bệnh viện Bạch Mai [7]. Riêng bệnh nhân bị rắn hổ mèo cắn có biểu hiện sưng nề lan rộng, viêm hoại tử tổ chức xung quanh vết cắn rất mạnh, có thể có sốt và rối loạn tiêu hóa. Toàn thân có thể có hội chứng nhiễm độc thần kinh với biểu hiện ý thức từ lơ mơ đến hôn mê. Có thể có biểu hiện suy hô hấp ở các mức độ khác nhau, trường hợp nặng có thể gây ngừng thở dẫn đến tử vong nếu không được điều trị kịp thời [5], [90]. Các bệnh nhân nhiễm độc do các loài rắn thuộc họ rắn lục cắn thường có biểu hiện tổn thương tại chỗ rõ ràng hơn như chảy máu tại vết cắn, sưng nề, bóng nước và nhiễm trùng xung quanh vết cắn. Toàn thân có thể có biểu hiện xuất huyết dưới da và xuất huyết đa cơ quan hay gặp ở bệnh nhân bị rắn chàm quạp cắn. Xét nghiệm đông máu 20 phút tại giường cho kết quả dương tính chiếm tỷ lệ 46,5 % [7]. Bệnh nhân có thể có biểu hiện rối loạn đông máu toàn bộ như giảm tiểu cầu, thời gian co cục máu đông kéo dài . [77], [91]. Tuy nhiên, các xét nghiệm nói trên chỉ có giá trị trong xác định triệu chứng rối loạn đông máu của bệnh nhân mà không có giá trị trong chẩn đoán xác định loài rắn cắn trên lâm sàng. 10 Theo WHO, đến nay huyết thanh kháng nọc rắn vẫn là loại thuốc điều trị đặc hiệu và hiệu quả nhất cho các nạn nhân bị rắn độc cắn. Liều khởi đầu HTKNR cần được sử dụng càng sớm càng tốt theo đường tiêm truyền tĩnh mạch với tốc độ là 1 ml/phút. Liều tiếp theo HTKNR được nhắc lại sau 3 giờ nếu chưa thấy dấu hiệu lâm sàng cải thiện rõ rệt [114]. HTKNR không có liều giới hạn tối đa, tùy thuộc tình trạng cải thiện nhiễm độc trên lâm sàng [11]. HTKNR tiêm dưới da, xung quanh vết cắn có hiệu quả giảm đau đáng kể nên được khuyến cáo sử dụng. Việc sử dụng HTKNR không phụ thuộc vào thời gian nhập viện của bệnh nhân mà căn cứ vào thực tế mức độ nhiễm độc trên lâm sàng và kết quả xét nghiệm phát hiện nọc độc của từng bệnh nhân. Thời gian trung bình từ khi bị rắn cắn đến khi tử vong là 8 giờ với rắn hổ (giới hạn từ 12 phút đến 120 giờ), ba ngày (giới hạn từ 15 phút đến 264 giờ) với rắn lục. Nhiều bệnh nhân rắn cắn nhập viện muộn sau 10 ngày, khi được điều trị HTKNR vẫn có hiệu quả tốt [34], [77]. HTKNR trung hòa nọc độc theo các cơ chế: kết hợp trực tiếp với nọc độc, ngăn cản độc tố tiến tới tế bào đích; làm tăng cường quá trình thực bào và kích hoạt hệ thống bổ thể. Hồng cầu với thụ thể CR1 (CR1 receptor) được hỗ trợ bởi phân tử C3b bổ thể đóng vai trò quan trọng trong cơ chế thải loại nọc độc sau khi đã bị cố định bởi HTKNR. Trong đó kháng nguyên (nọc độc) + kháng thể (HTKNR) tạo thành phức hợp miễn dịch sẽ gắn với hồng cầu thông qua thụ thể CR1 và bị đại thực bào bắt giữ, xử lý và loại bỏ khỏi cơ thể. Điều đáng lưu ý là các độc tố hoại tử mô, độc tố thận, độc tố cơ….độc tố tiền synape và độc tố hậu synape chuỗi dài khi đã gắn vào tế bào đích thì HTKNR không thể tách độc tố ra khỏi tế bào đích. Mặt khác, HTKNR có thể trung hòa các độc tố hemorrhagins và độc tố hậu synape chuỗi ngắn để giải phóng tế bào đích [11], [64], [65]. Ở Việt Nam, tuy là nước đầu tiên phát minh ra huyết thanh kháng nọc rắn (1892) tại Viện Paster Sài Gòn bởi bác sĩ Albert Calmette. Nhưng từ đó