Báo cáo Phân tích thực phẩm SẮC KÝ KHÍ (GC)

Kết quả của việc phân tích sắc kí khí phụ thuộc vào việc lựa chọn đúng cột, chọn đúng nhiệt độ bơm mẫu vào cột, nhiệt độ lò, nhiệt độ ở detector, và còn phụ thuộc vào sự điều chỉnh vận t

Trường Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ Thuật Hóa Học -Báo cáo Phân tích thực phẩm

SẮC KÝ KHÍ (GC)

GVHD:

SVTH: Lê Trung Hiếu 61000953

Lê Tấn Hoàng 61001101

Võ Hoàng Yến 61004166

TP HỒ CHÍ MINH 03-2013

SẮC KÍ KHÍ

I Cơ sở lý thuyết

1 Sơ lược về sắc kí khí

Sắc kí khí là phương pháp sắc kí mà pha động lỏng được thay bằng một dòng khí mang liên tục chạy qua pha tĩnh Các chất được tách ra khỏi hỗn hợp nhờ vào tương tác khác nhau của chúng với pha tĩnh Do khả năng hòa tan rất kém của khí, dòng khí này không đóng vai trò là một pha động thực sự, nó chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi chạy dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác với pha tĩnh Vì thế dòng khí chạy trong pha tĩnh chỉ được gọi là khí mang

Sắc kí khí chuyên dùng để phân tích các chất dễ bay hơi Một số chất dù có nhiệt

độ sôi cao hơn có thể tạo thành cca1 dẫn xuất có nhiệt độ sôi thấp thì cũng có thể phân tích bằng kĩ thuật sắc kí khí Kết quả của việc phân tích sắc kí khí phụ thuộc vào việc lựa chọn đúng cột, chọn đúng nhiệt độ bơm mẫu vào cột, nhiệt độ lò, nhiệt độ ở detector, và còn phụ thuộc vào sự điều chỉnh vận tốc dòng khí mang vào cột chế độ nhiệt độ cao sẽ làm cho các chất có nhiệt độ sôi thấp bị đẩy ngay ra khỏi cột trong khi nhiệt độ quá thấp cũng gây lưu giữ mẫu trong pha tĩnh làm kéo dài thời gian phân tích Do đó, khi phân tích hỗn hợp nhiều mẫu thì việc cần thiết là cần phải triển khai theo chế độ gradient nhiệt độ

2 Hệ thống sắc kí khí

Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thường là N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh) Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau

đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ

Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau:

2.1 Nguồn cung cấp khí mang:

Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trước

đó giải hấp đi tới để tiếp tục tương tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh

Điều kiện để một khí được sử dụng làm khí mang:

- Phân tử lượng nhỏ

- Trơ về mặt hoá học đối với chất phân tích, pha tĩnh, vật liệu làm cột

- Tinh khiết

- Phù hợp với detector sử dụng

Khí mang trong sắc ký khí thường dùng là các khí như heli, nitơ, argon, Với detector ECD có thể vận hành với các khí mang khác nhau Khi làm việc theo kiểu dòng một chiều có thể dùng khí nitơ, khi vận hành theo kiểu xung có thể dùng argon bổ sung 5% metan sẽ cho kết quả tốt hơn

2.2 Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích

2.3 Bộ phận tiêm mẫu

Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless)

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace)

 Phương pháp tiêm mẫu:

Trong phương pháp sắc ký khí, việc lựa chọn kỹ thuật tiêm và tối ưu điều kiện tiêm đóng vai trò quyết định kết quả phân tích Hai kỹ thuật tiêm mẫu thường dùng nhất trong sắc ký khí là tiêm chia dòng và không chia dòng

• Tiêm chia dòng:

- Mẫu được tiêm vào buồng tiêm, tại đây toàn bộ mẫu được hoá hơi, đồng thời cuối buồng tiêm van xả được mở ra phần lớn hơi sẽ theo van ra ngoài, chỉ một phần nhỏ được giữ lại đưa vào cột

- Tỉ lệ gọi là tỉ lệ chia dòng Tỉ lệ chia dòng từ 20:1 đến 100:1

- Các thông số để đánh giá phương pháp tiêm chia dòng là nhiệt độ buồng tiêm, tỉ số chia dòng, áp suất khí mang,

- Phương pháp tiêm chia dòng cho mũi sắc ký nhọn, phù hợp về mặt định tính Về mặt định lượng thì không tốt bởi vì tỉ lệ chia dòng sẽ thay đổi tuỳ thuộc điều kiện tiêm và nhất

là đối với các hỗn hợp mẫu chứa các chất có khả năng bay hơi khác nhau Phương pháp tiêm chia dòng phù hợp cho phân tích mẫu có hàm lượng lớn, nhưng không phù hợp cho phân tích lượng vết do lượng mẫu vào cột rất ít

• Tiêm không chia dòng:

- Toàn bộ mẫu được chuyển thẳng vào cột, tiêm không chia dòng sử dụng buồng tiêm giống như tiêm chia dòng nhưng khác ở chỗ trong quá trình tiêm mẫu van thoát khí sẽ đóng lại Thời gian tiêm không chia dòng từ 40-90 giây, thể tích tiêm 1-2µl

- Nhiệt độ cột sắc ký lúc đầu thấp, sau tăng lên Nhiệt độ đầu thấp hơn nhiệt độ của dung môi 20-300C, khi vào đầu cột gặp nhiệt độ thấp hơn hỗn hợp hơi sẽ đọng lại (gồm hơi chất phân tích và hơi dung môi) như vậy sẽ giúp lôi kéo toàn thể chất phân tích trong buồng tiêm vào cột Khi tăng nhiệt độ hơi dung môi ra trước, các chất phân tích từ từ ra sau cho mũi tương đối nhỏ

- Phương pháp này thích hợp cho phân tích dạng vết, siêu vết nhưng không dùng cho chất

có nhiệt độ sôi thấp hơn dung môi

2.4 Cột phân tích

Trong thực tế có nhiều dạng cột tách dùng cho các mục đích nghiên cứu khác nhau Nhìn chung cột sắc ký cần đạt các yêu cầu sau đây:

- Đảm bảo trao đổi chất tốt giữa pha tĩnh và pha động nhờ việc tối ưu hoá các thông số của phương trình Van-Deemter

- Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định

- Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao

Cột sắc ký được chia làm hai loại cột nhồi và cột mao quản

• Cột nhồi:

Vật liệu làm cột nhồi thường là thủy tinh, polytetrafluoethylene, thép không gỉ, niken hoặc đồng Chiều dài của cột từ 1-3m Do các hạt nhồi thường làm giảm áp suất lớn nên các cột thường ngắn hơn 3m Đường kính của cột khoảng 1/8 đến1/4 inches Đối với cột nhồi yếu tố quan trọng nhất chính là pha tĩnh của cột bởi nó quyết định tính chọn lọc của cột

Cột nhồi thường cho hiệu quả tách thấp Một cột có chiều dài 1m được nhồi bởi các hạt

có kích thước 125-150µm và không bao giờ tạo ra quá 3000 đĩa lý thuyết

Tuy nhiên cột nhồi cũng có những ưu điểm nhất định như hệ số lưu giữ cao, thích hợp với các detector có thể tích lớn, dung lượng mẫu cao, ít chịu ảnh hưởng của chất bẩn trong mẫu nên không đòi hỏi nhiều công tinh chế mẫu

• Cột mao quản:

Cột mao quản là loại cột tách có đường kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột được tẩm pha tĩnh Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đưa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất tách cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (độ chêch lệch

áp suất thấp)

So với cột nhồi, cột mao quản có ưu điểm là:

- Các hỗn hợp phức tạp được tách với hiệu suất cao hơn hẳn

- Tách được cả các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau

- Độ tin cậy cao hơn trong việc nhận biết các cấu tử

- Độ nhạy phát hiện cao hơn

- Giảm thời gian phân tích

- Cho phép nối trực tiếp với khối phổ kế mà không cần bộ tách

2.5 Đầu dò

Detector là bộ phận ghi nhận sự xuất hiện và nồng độ các chất trong dòng khí mang Detector có nhiệm vụ chuyển hoá một đại lượng không điện (nồng độ của các chất được tách khỏi cột sắc ký) thành tín hiệu điện

Tính chất cần có của một detector: độ nhạy cao, có khả năng cho tính hiệu với nhiều loại hợp chất, khoảng tuyến tính rộng, cho tín hiệu nhanh, ổn định, độ ồn thấp

Các loại detector thông dụng trong sắc ký khí:

- Phổ quát: FID, TCD, MS

- Chọn lọc: ECD

- Bảo toàn chất phân tích: TCD

- Phá huỷ chất phân tích: ECD, FPD, FID, MS.dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry) 2.6 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

2.7 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

3 Các đại lượng cơ bản trong phương pháp sắc ký

3.1 H ệ s ố phân b ố:

Cân bằng của cấu tử trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình đơn giản sau:

Hằng số cân bằng cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ số phân bố (partition coefficient), được tính như sau:

Với

• CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

• CM: nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số k phụ thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

3.2 Th ờ i gian l ư u (tR):

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích khi được nạp vào cột sắc ký thì chúng sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh theo một thời gian nhất định gọi là thời gian lưu

Thời gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải hoàn toàn ra khỏi cột, tại thời điểm đó chất phân tích có nồng độ cực đại

Với:

• tR: thời gian lưu của cấu tử chất phân tích (min)

• t0: thời gian để cho chất hoàn toàn không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột, hay là thời gian pha động đi vào cột đến khi ra khỏi cột và còn gọi là thời gian chết (min)

• tR’: thời gian lưu hiệu chỉnh (min)

tR’ = tR - t0 (2)

Hình 3.1: Thời gian lưu của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ 3.3 H ệ s ố dung l ượ ng:

Được định nghĩa theo công thức sau:

Với:

• VS: thể tích pha tĩnh

• VM: thể tích pha động

• K’ là đại lượng quan trọng nhất trong sắc ký và được đo bằng thực nghiệm, có thể tính theo công thức:

• Nếu K’~ 0, tR ~t0: chất ra sớm nhất, cột không có khả năng giữ chất lại

• K’ càng lớn (tR càng lớn) chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng dài thì mũi sắc ký có khả năng bị tù

• K’ nhỏ thì các mũi chất ra nhanh và khả năng tách kém

(4) (3)

• Khoảng K’ lý tưởng là từ 2-5 nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp thì K’ có thể chấp nhận 1- 20

3.4 S ố đĩ a lý thuy ế t c ủ a c ộ t:

Số đĩa lý thuyết (N) của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột

Hình 3.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết

Với :

• Wb: bề rộng đáy của mũi sắc ký

• W 1/2: bề rộng đáy của mũi sắc ký ở phân nửa chiều cao

Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng Wb càng nhỏ thì mũi sắc ký càng nhọn

Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng tách của cột càng cao

3.5 Độ ch ọ n l ọ c:

Độ chọn lọc (α) là đại lượng biễu diễn sự khác nhau của các mũi kề nhau trong một hệ sắc ký đã chọn Khi α càng khác 1 thì sự tách của hai chất càng rõ Độ chọn lọc α thay đổi theo sự thay đổi của thành phần pha động và pha tĩnh

(5)

3.6 Độ phân gi ả i:

Độ phân giải (RS) được dùng để đánh giá khả năng tách hai mũi sắc ký gần

nhau

Với :

• tR1: thời gian lưu của cấu tử thứ nhất

• tR2: thời gian lưu của cấu tử thứ hai

• W1: bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ nhất

• W2: bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ hai

• α: độ chọn lọc của cột sắc ký cho hai cấu tử 1 và 2

Trường hợp RS=1, hai mũi có độ lớn tương tự nhau được phân tách khỏi nhau khoảng 95% Nếu RS= 1.5 thì sự phân giải được coi là hoàn toàn (99.7%)

II Cách tiến hành

1 Chuẩn bị mẫu

2 Tiến hành chạy sắc kí

3 Tính kết quả

III Ứng dụng

Khác với các máy phân tích dư lượng kháng sinh như sắc ký lỏng ghép khối

phổ (LC/MS/MS), thì sắc ký khí ghép khối phổ độ phận giải cao (HRGC/HRMS),

GC/MSN sắc ký ghép khối phổ có ứng dụng phân tích các độc chất trong nước tương, nước mắm (3 MCPD );

Nghiên cứu chiết xuất và xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp

chất khác nhau

IV Tiến hành thí nghiệm

(6)

(7)

Cách thức chuẩn bị mẫu

Pha 400µl paraxylen và 100µl alcohol

Loại cột sử dụng

GC-Shimadzu 2010 Plus

Thông số cột: SPBS – chiều dài 30m, đường kính trong 0.25mm Chiều dày lớp film 0.25µm 1 cấu tử không bị lưu giữ bởi cột đi xuyên qua cột mất 1.5phút

Thành phần pha động

Diethyl ether

Bài tập

 Độ phân giải lý thuyết

Rs= A A

( ) ( ) 2

t − t = ∆t

Trong đó

R

t

∆ = 4.105 – 2.705 = 1.4

A

W = 0.08 (min)

WB= 0.19 (min)

Vậy Rs = 10.37 >1.5 => các cấu tử tách ra hoàn toàn

 Số đĩa lý thuyết của cột

N1 = 5,54 2

A1/2

W

RA

t

= 25.3 x103

N2 = 5,54 2

B1/2

W

RB

t

= 10.3 x103

N= (N1 N2)

2

+

= 17.8 x103

 Chiều cao đĩa lý thuyết

H = L

N = 1.68 x10

-3 m

Chiều cao đòi hỏi của cột để đạt độc phân giải là 1.5

Ta có:

1 1

2 2

( ) ( )

S S

N R

R = N = 10.37

1.5 =

3

2

17.8 x10

N

 N2 = 372