Phân tích tồn lưu kháng sinh doxycycline trong nguyên liệu cá tra bằng hệ thống sắc ký lỏng năng cao

Tuy nhiên, việc sử dụng và lạm dụng kháng sinh này trong nuôi trồng thủy sản sẽ gây ra những vấn đề rất nghiêm trọng về khả năng kháng kháng sinh của các loại vi khuẩn và dư lượng kháng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN VĂN TẤN

PHÂN TÍCH TỒN LƯU KHÁNG SINH DOXYCYCLINE

TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA (Pangasianodon

hypophthalmus) BẰNG HỆ THỐNG

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN VĂN TẤN

PHÂN TÍCH TỒN LƯU KHÁNG SINH DOXYCYCLINE

TRONG NGUYÊN LIỆU CÁ TRA (Pangasianodon

hypophthalmus) BẰNG HỆ THỐNG

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths TRẦN MINH PHÚ

2011

XÁC NHẬN

Luận văn tốt nghiệp với tên đề tài “Phân tích tồn lưu kháng sinh

Doxycycline trong nguyên liệu cá tra bằng hệ thống sắc ký lỏng năng cao”

do sinh viên Nguyễn Văn Tấn thực hiện đã được cán bộ hướng dẫn góp ý

chỉnh sửa và phê duyệt

Cần Thơ, ngày 10 tháng 07 năm 2011

Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện

ThS Trần Minh Phú Nguyễn Văn Tấn

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã quan tâm giúp đỡ và động viên tôi trong suốt khoảng thời gian học tập vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 10 tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Tấn

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Thí nghiệm (1) với cột sắc kí Gemini C18(5µm, 3.00 x 150 mm); Tốc độ dòng 0,5 mL/min, tỉ lệ pha động ACN : Acid oxalic là 20:80; Bước sóng 350nm thì sẽ phát hiện tốt nhất kháng sinh Doxycycline Hiệu suất thu hồi của qui trình chiết tách đạt 62,6 % Giới hạn phát hiện là 250 ppb trên mẫu cơ thịt cá

Kết quả phân tích hàm lượng Doxycycline mẫu thức ăn nhiễm ở mức 10,16±8,5 ppm Sau 7 ngày cho ăn kháng sinh ta thấy tồn lưu của Doxycycline trong cơ thịt cá tăng dần và đạt mức cao nhất 1289 ± 302 ppb ở ngày thứ 7 Sau 30 ngày ngừng cho ăn kháng sinh mức độ tồn lưu Doxycycline trong cơ thịt cá được phát hiện ở mức 219 ± 16,2 ppb

Thí nghiệm (2) thời gian tồn lưu kháng sinh Doxycycline trên cá tra sẽ dưới giới hạn phát hiện sau 30 ngày thí nghiệm

MỤC LỤC

Chương 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Thời gian thực hiện 2

Chương 2 3

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tìm hiểu về nhóm kháng sinh nhóm Tetracycline (TCs) 3

2.1.1 Sơ lược về nhóm Tetracycline 3

2.1.2 Tình hình sử dụng kháng sinh nhóm Tetracycline 5

2.1.3 Các ứng dụng của nhóm Tetracyclin 8

2.1.4 Tác hại của nhóm TCs 9

2.2 Phương pháp xác định dư lượng TCs 10

2.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng Tetracyclin trong mẫu tôm và sữa nguyên chất bằng cách sử dụng sắc ký lỏng đầu dò UV và xác nhận lại bằng đầu dò khối phổ (Andersen et al., 2004) 11

2.2.2 Phương pháp 2: Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong cơ thịt lợn bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép phổ khối lượng (Cherlet et al., 2003) 11

2.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kết hợp với ion hóa bằng áp suất khí quyển (APCI LC-MS/MS) (Nakazawa et al., 1999) 12

2.3 Mức độ tồn lưu của nhóm kháng sinh TCs 13

2.4 Qui định của một số quốc gia về việc sử dụng thuốc và hóa chất trong sản xuất kinh doanh thủy sản 14

Chương 3 15

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 15

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 15

3.1.1 Địa điểm thực hiện 15

3.1.2 Nguyên liệu 15

3.1.3 Thời gian 15

3.2 Vật liệu và phương pháp 15

3.2.1 Vật liệu 15

3.2.2 Phương pháp thí nghiệm 17

3.2.3 Xử lí số liệu 24

Chương 4 25

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Tối ưu hóa các thông số hệ thống HPLC 25

4.1.1 Cố định cột phân tích với cột Gemini C 18 25

4.1.2 Cố định cột phân tích với cột Synersi C 18 27

4.1.3 Tối ưu hóa các thông số cho phân tích Docycyclin trên hệ thống HPLC-UV vis 28

4.2 Thí nghiệm tồn lưu của kháng sinh Doxycycline trên cá tra 30

4.2.1 Các yếu tố môi trường 30

4.2.2 Tồn lưu Doxycycline trong cá Tra 31

CHƯƠNG 5 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề xuất 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 1 36

PHỤ LỤC 2 41

PHỤ LỤC 3 47

PHỤ LỤC 4 49

PHỤ LỤC 5 51

PHỤ LỤC 6 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả diện tích peak ở các lần spike chuẩn 29

Bảng 4.2 Kết quả chạy chuẩn Doxycycline 29

Bảng 4.3 Nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm 30

Bảng 4.4 pH trong quá trình thí nghiệm 30

Bảng 4.5 Hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm 31

Bảng 4.6 Sự tồn lưu trên cá tra sau 7 ngày cho ăn kháng sinh 31

Bảng 4.7 Sự tồn lưu trên cá tra sau 30 ngày ngưng cho ăn kháng sinh 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 So sánh các phương pháp phân tích dư lượng OTC mẫu cá 13

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19

Hình 3.2 Sơ đồ chiết tách qui trình 1 22

Hình 3.4 Sơ đồ thu mẫu 24

Hình 4.1 Tối ưu hóa thông số với cột Gemini C18; ACN – NaH2PO4 26

Hình 4.2 Tối ưu hóa thông số với cột Synersi C18; ACN – NaH2PO4 27

Hình 4.3 Tối ưu hóa thông số với cột Gemini C18; ACN – Acid oxalic 28

Hình 4.4 Biểu đồ đường chuẩn 30

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Thủy sản hiện nay là một trong những ngành mũi nhọn đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của nước ta hiện nay Theo số liệu từ Tổng cục thống kê thì tổng sản lượng thủy sản sáu tháng đầu năm 2011 ước đạt 2.510,8 ngàn tấn, tăng 3,2% so với cùng kì năm trước, trong đó sản lượng khai thác ước đạt 1.251,9 ngàn tấn, tăng 1,4 % so với cùng kì năm trước Trong các mặt hàng xuất khẩu thì cá da trơn, đặc biệt mặt hàng cá tra là một mặt hàng chiếm

ưu thế khá lớn, sản xuất cá tra tại các địa phương phát triển theo hướng nuôi quy mô lớn, hộ chăn nuôi gắn kết chặt chẽ với doanh nghiệp nên sản lượng sáu tháng đầu năm ước tính đạt 517 nghìn tấn, tăng 4,7% so với cùng kỳ năm

2010 Do sự cạnh tranh gây gắt trên thị trường quốc tế và cùng với yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, đòi hỏi sản phẩm làm ra không chỉ mang lại giá trị dinh dưỡng cao mà còn phải đảm bảo các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm Trong đó tồn lưu kháng sinh trong sản phẩm thủy sản là một vấn

đề đang rất được quan tâm của hầu hết các quốc gia xuất nhập khẩu thủy sản trên thế giới

Nhóm Tetracycline (TCs) là một trong những nhóm kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành thủy sản, chúng không chỉ được sử dụng nhiều tại Việt Nam mà còn ở nhiều nước khác trên thế giới Đây là nhóm kháng sinh phổ rộng có khả năng kháng các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản bao gồm cả vi khuẩn gram âm và gram dương, hiếu khí, kỵ khí, xoắn khuẩn và

vi khuẩn nội bào Tuy nhiên, việc sử dụng và lạm dụng kháng sinh này trong nuôi trồng thủy sản sẽ gây ra những vấn đề rất nghiêm trọng về khả năng kháng kháng sinh của các loại vi khuẩn và dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản, điều này sẽ gây ảnh hưởng hết sức nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng và cũng gây ra những thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế Vì

vậy, đề tài “Phân tích tồn lưu kháng sinh Doxycycline trong nguyên liệu cá tra bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao” được tiến hành là rất cần thiết

nhằm đảm bảo tốt vấn đề về chất lượng sản phẩm thủy sản và phương thức sử dụng kháng sinh một cách hợp lí trong công tác nuôi trồng thủy sản

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình phân tích nhóm kháng sinh Tetracycline bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Xác định thời gian tồn lưu và dư lượng tồn lưu của kháng sinh Doxycycline trong sản phẩm cá tra

1.3 Nội dung nghiên cứu

Tối ưu hóa các thông số hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phân tích kháng sinh TCs; Doxycycline và khảo sát qui trình chiết tách

Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh doxycyline trong sản phẩm

cá tra

1.4 Thời gian thực hiện

Từ tháng 01/2011 đến tháng 07/2011

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tìm hiểu về nhóm kháng sinh nhóm Tetracycline (TCs)

2.1.1 Sơ lược về nhóm Tetracycline

TCs là nhóm kháng sinh nằm trong danh mục những loại kháng sinh cần kiểm soát chặt chẽ trong sản xuất và kinh doanh thủy sản Nhóm kháng sinh Tetracycline gồm 4 chất: Tetracycline (TC); Chlortetracycline (CTC); Oxytetracycline (OTC); Doxycycline (DC)

Theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 03 năm 2009 của

Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, giới hạn tồn lưu cho phép trong thủy sản của TCs cụ thể là: TC; CTC; OTC là 100ppb

2.1.1.1 Giới thiệu về nhóm Tetracycline

Là nhóm kháng sinh có công thức cấu tạo 4 vòng 6 cạnh, lấy từ tổng

hợp Streptomyces aureofaciens (Chlorotetracycline, 1947), hoặc bán tổng

hợp Các Tetraycyline thường ở dạng bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị đắng Dạng base ít tan trong nước nhưng tan được trong ethanol, acol và các

dung môi hữu cơ (Nguồn từ: http://www.wattpad.com, cập nhật ngày 07/12/2010)

Các Tetracycline đều là hợp chất lưỡng tính: Tác dụng với acid tạo thành muối dễ tan trong nước, tác dụng với kiềm (NaOH, KOH) tạo thành muối tan trong nước nhưng không bền, dạng muối hydroclorid tan trong nước

(Nguồn từ: http://www.Drugs.com, cập nhật ngày 11/12/2010)

Là nhóm kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do có khả năng gắn trên tiểu phần 30S của ribosome vi khuẩn, ngăn cản sự gắn kết tRNA và phức hợp mRNA ribosome (Suzuki, 2010)

2.1.1.2 Công thức cấu tạo của các Tetracycline

Công thức cấu tạo:

Tên quốc tế: dioxo-1,2,3,4,4a,5,5a,6,12,12a-decahydrotetracene-2-carboxamide

4-(dimethylamino)-3,5,6,10,11,12a-hexahydroxy-6methyl-1,12-c Chlortetracycline

MF (Chemical Formula): C22H23ClN2O8

MW (Molecular Weight): 478

Công thức cấu tạo:

Tên quốc tế: 2-[amino(hydroxy)methylene]-7-chloro-4 6,10,11,12a-tetrahydroxy-6-methyl-4a,5,5a,6 tetrahydrotetracene -

(dimethylamino)-1,3,12(2H,4H,12aH)-trione

d Doxycycline

MF (Chemical Formula): C22H24N2O8

MW (Molecular Weight): 444

Công thức cấu tạo:

Tên quốc tế: tetrahydroxy-6-methyl- 4a,5,5a,6-tetrahydro-4H-tetracene-1,3,12-trione

2-(amino-hydroxy-methylidene)-4-dimethylamino-5,10,11,12a-2.1.2 Tình hình sử dụng kháng sinh nhóm Tetracycline

2.1.2.1 Tình hình sử dụng nhóm Tetracycline trên thế giới

Nhằm tăng nhanh sản lượng thuỷ sản và kim ngạch xuất khẩu, các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam đang rất chú trọng tới công tác nuôi trồng thuỷ sản Ðể đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, nhiều doanh

nghiệp nuôi trồng thủy sản hiện đang áp dụng các phương thức nuôi thâm canh Do đó các động vật thủy sản bị ảnh hưởng rất nhiều bởi áp lực và bệnh tật lan tràn gây ra những thiệt hại to lớn về mặt kinh tế lẫn sức khỏe của người nuôi và người tiêu dùng Bệnh của động vật thuỷ sản thì có rất nhiều nguyên nhân nhưng chủ yếu là do vi khuẩn gây ra Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc (antibiotic resistence) và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh

trong thịt thuỷ sản (Nguồn từ: http://hoinongdan.hochiminhcity.gov.vn/, cập nhật ngày 07/12/2010)

Kháng sinh TCs được sử dụng rộng rãi trên toàn cầu trong lĩnh vực thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản Tại Nhật Bản, TCs chiếm hơn 60% về tổng lượng thuốc kháng sinh dùng trong thú y Tại Mỹ thì OTC và CTC đã được phê duyệt để sử dụng trong chăn nuôi bò thịt, lợn, cừu, gà, và gà tây Ngoài ra, OTC đã được cụ thể chấp thuận cho sử dụng trong nuôi bò sữa và nuôi cá da trơn, cá hồi, và tôm hùm Tuy nhiên, tại Mỹ thì OTC không được chấp nhận

sử dụng trong nuôi tôm mặc dù kháng sinh này vẫn được sử dụng rộng rãi trong việc nuôi tôm ở các quốc gia khác trên thế giới (Andersen et al., 2004)

Sự phổ biến của nhóm kháng sinh Tetracyclin đang gây ra sự lo ngại về

dư lượng tồn lưu của nhóm kháng sinh này trong các sản phẩm tiêu thụ thường xuyên như tôm và sữa Do đó hiện nay thì ở các quốc gia phát triển như Mỹ và các nước EU thì dư lượng nhóm kháng sinh Tetracyclin được qui định như sau: tại Mỹ thì lượng TC, OTC, và CTC không được vượt quá 2 µg/g trong cơ thịt động vật và không vượt quá 300 ng/g trong sữa, tại EU lượng dùng cho phép đối với OTC, TC, và CTC 100 ng/g cho sữa và cơ thịt động vật (Andersen et al., 2004)

Theo số liệu của viện Thú y Hoa Kì (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pound (9270 tấn) trong đó nhóm kháng sinh Tetracyclin chiếm 15,67% (Trần Quốc Việt, 2007)

Trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi

ở các nước châu Âu là 10500 tấn Trong số lượng kháng sinh dùng trong chăn nuôi thì nhóm Tetracyclin chiếm khoảng 66% (Ghislain Follet, 2000)

Tại Sri Lanka thì TCs cũng được sử dụng trong công tác điều trị một số loại bệnh trên tôm Ngoài ra TCs cũng được sử dụng để xử lí nước trong môi trường ao nuôi tôm tại nước này (Panawala et al., 2004)

2.1.2.2 Tình hình sử dụng nhóm Tetracyclin ở Việt Nam

Tại Việt Nam thì TCs được xếp vào danh mục hóa chất hạn chế sử dụng và cần được kiểm soát chặt chẽ trong hoạt động sản xuất kinh doanh thủy sản (Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 03 năm 2009) Tuy nhiên, tại nước ta thì TCs vẫn là một trong những loại kháng được dùng rất phổ biến nhất trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản với mục đích điều trị bệnh và thúc đẩy tăng trưởng nhanh trên các loài động vật thủy sản

Hiện nay tại Việt Nam thì kháng sinh TCs là nhóm kháng sinh được lựa chọn để thay thế các loại kháng sinh Chloramphenicol và Nitrofurans trong ương ấu trùng tôm sú, cá tra và cá basa (Lý Thị Thanh Loan, 2004)

Tại Vĩnh Long để điều trị các bệnh trên cá tra như bệnh đốm đỏ trên thân, mắt và hậu môn sưng đỏ, các vây bị rách, xuất huyết, hoại tử thì nông dân thường sử dụng OTC và TC liều lượng từ 55 – 75 mg/kg thể trọng/ngày hoặc Chlotetracyclin: 12 – 25 mg/kg thể trọng/ngày và dùng liên tục từ 5 -7

ngày (Bản tin Nông nghiệp và Nông thôn Vĩnh Long – số 09/2007, cập nhật ngày 9/12/2010)

Tại An Giang đối bệnh đốm đỏ trên cá tra, cá trê thì chủ ao nuôi thường

sử dụng kháng sinh OTC 20-25 g/m3, tắm trong vòng 60 phút hoặc trộn 25g/100 kg thức ăn Có thể dùng TC 20-25 g/m3, tắm trong 60 phút hoặc trộn

20-100 mg thuốc/1 kg thức ăn (Sở Nông nghiệp phát triển nông thôn An Giang, 2005) Ngoài ra thì kháng sinh TC còn dùng để dưới dạng mỡ tetracyclin 1%

để trị bệnh đốm trắng, đỏ cổ, ghẻ lỡ ở cổ baba (Nguồn từ: http://www.vietlinh.com.vn, cập nhật ngày 9/12/2011)

Kháng sinh TCs không chỉ được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản Tại nước ta thì kháng sinh TCs cũng được sử dụng rộng rãi trong việc diệt khuẩn chuồng trại chăn nuôi gia súc và làm vật liệu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để kích thích sự tăng trưởng Theo kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh

ở 55 trại nuôi lợn tại 2 tỉnh Đồng Nai và Bình Dương trong 13 loại kháng sinh

sử dụng nhiều nhất thì TCs chiếm 4,1% Khảo sát trên 60 mẫu thức ăn chăn nuôi thì kháng sinh TC chiếm khoảng 25/60 mẫu (41,16%), OTC chiếm 4/60 mẫu (6,6%), CTC chiếm 15/60 mẫu (25%) và theo kết quả khảo sát này thì hàm lượng TC vượt quá 2/60 mẫu (3,3%), OTC vượt quá 1/60 mẫu (1,66%), CTC vượt quá 9/60 mẫu (15%) mẫu qui định theo 10 TCN 861-2006 (Nguyễn Quốc Ân, 2009)

2.1.3 Các ứng dụng của nhóm Tetracyclin

2.1.3.1 Trong công nghiệp

Trong công nghiệp thì TCs được sử dụng làm dược liệu bào chế thuốc chữa bệnh:

TC, CTC và OTC được dùng để trị bệnh đau mắt hột, viêm kết mạc

nặng, loét giác mạc (Nguồn từ: http://www.dopharma.vn, cập nhật ngày 13/12/2010)

Tetracycline dạng viên nén 250 mg được sử dụng cho những người bị bệnh như viêm phổi, viêm phế quản, viêm xoang Tham gia trong một số phác

đồ điều trị H.pylori trong bệnh loét dạ dày, tá tràng Phối hợp với thuốc chống sốt rét như quinin để điều trị sốt rét do P.Falciparum đã kháng thuốc (Nguồn từ: http:www.dopharma.vn, cập nhật ngày 13/12/2010)

Tetracycline dạng 500 mg được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Chlamydia, Rickettsia, lậu cầu, xoắn khuẩn, tả, nhất là các nhiễm khuẩn

đường hô hấp, sinh dục, tiết niệu, mắt, tiêu hóa và mụn trứng cá (Nguồn từ: http:www.dopharma.vn, cập nhật ngày 13/12/2010)

Doxycycline trong công nghiệp (Tên thương hiệu là Vibramycin, được FDA chấp nhận 1967) cũng được dùng để điều chế dược phẩm trị các bệnh nhiễm trùng như viêm tuyến tiền liệt mạn tính, viêm xoang, bệnh giang mai,

chlamydia, bệnh viêm vùng chậu, mụn trứng cá và bệnh rosacea Ngoài ra, nó được sử dụng trong điều trị và dự phòng của Bacillus anthracis (bệnh than),

trong điều trị dự phòng chống bệnh sốt rét (FDA, 2008)

2.1.3.2 Trong thủy sản

Như đã đề cập TCs là một loại kháng sinh có phổ rất rộng, là kháng sinh ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao, TCs có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn nên được sử dụng nhiều trong việc điều trị một số bệnh trên động vật thủy sản (Từ Thanh Dung, 2009)

Các kháng sinh TCs được sử dụng rất nhiều trong công tác diệt khuẩn môi trường ao nuôi thủy sản (Andersen et al., 2004)

Do khả năng kháng khuẩn cao, không để lại dư lượng lớn và rẻ tiền nên thời gian gần đây TCs còn được nghiên cứu để trị bệnh trứng đỏ trên cá (Dermatol et al., 2010)

2.1.4 Tác hại của nhóm TCs

TCs được sử dụng nhiều với mục đích diệt khuẩn Tuy nhiên, nếu sử dụng một cách bừa bãi và không đúng theo qui định thì sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn

Theo số liệu của ASTS (American Society of Transplant Surgeons)

năm 1997 ở Việt Nam: 92,9% Salmonella typhi kháng kháng sinh TC; 41,4% H.influenzae; 87,9% Kpneumoniae; 82,9% E.aerogenes; 86,7% Shigella flexneri; 57,1% Staphylococcus aureus; 82,3% E.coli; 50% Streptococcus pyogenes; 79,2% Streptococcus nhóm D đã kháng DC Nếu dư lượng vượt quá

mức cho phép sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng (Dược thư quốc gia Việt Nam, 2006)

Theo kết quả khảo sát sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá tra nuôi thâm canh ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thì đối với chủng vi

khuẩn Aeromonas spp (Nhóm vi khuẩn gây bệnh được xem là quan trọng nhất

trên cá nước ngọt) thì TC đã giảm tác dụng chỉ còn 58% số chủng vi khuẩn nhạy so với 81% của DC Nhiều nghiên cứu cho rằng sự kháng thuốc của kháng sinh TCs có liên quan đến việc sử dụng kháng sinh này quá rộng rãi và phổ biến để phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản Vì vậy chỉ nên sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản khi thực sự cần thiết (Từ Thanh Dung, 2009)

2.1.4.1 Tác hại đối với con người

TCs hấp thụ qua đường tiêu hóa và sẽ đạt nồng độ tối đa trong máu sau

từ 1- 4 giờ sử dụng, thuốc phân bổ nhanh vào các mô và dịch cơ thể, có thể qua được nhau thai và sữa mẹ ở nồng độ cao Do đó không nên sử dụng kháng sinh TCs đối với phụ nữ mang thai và cho con bú vì nó có thể làm giảm sự phát triển của xương thai nhi Ngoài ra, TCs còn có khả năng làm thay đổi màu sắc của răng nếu sử dụng quá lều lượng Ngoài ra nên hạn chế sử dụng TCs đối với trẻ em dưới 12 tuổi (Đối với TC) và trẻ em dưới 8 tuổi (Đối với DC) (FDA, 2008) (Đăng tải tại: http//:www.medicineNet.com, cập nhật ngày 13/12/2010)

Tuyệt đối không sử dụng TCs cho người bị bệnh gan hoặc suy thận nặng (trừ trường hợp DC) Đối với người bình thường nếu kháng sinh TCs trong cơ thể vượt quá lượng cho phép thì có thể gây ra các bệnh như rối loạn tiêu hóa, bội nhiễm nấm ở miệng, thực quản và nấm cadida âm đạo Bên cạnh

đó, TCs còn gây ra các tác dụng phụ như ban đỏ, mề đay Ngoài ra, kháng sinh Tetracycline là loại kháng sinh rất nhạy cảm với ánh nắng mặt trời do đó cần

tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng khi đã sử dụng Tetracycline (Nguồn từ: http://www.dopharma.vn, cập nhật ngày 15/12/2010)

2.1.4.2 Thiệt hại về kinh tế

Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa kháng TCs vượt qua giới hạn cho phép thì toàn bộ các lô hàng sẽ bị trả về, không những vậy chúng ta sẽ còn

bị khởi kiện bởi nước nhập khẩu sản phẩm thủy sản của ta, vấn đề này sẽ làm sụt giảm trầm trọng uy tín về chất lượng của các mặt hàng thủy sản nước ta, thiệt hại về kinh tế là vô cùng to lớn

2.2 Phương pháp xác định dư lượng TCs

Do việc sử dụng TCs trong ngành thủy sản có nhiều điều kiện thuận lợi như: khả năng ức chế và tiêu diệt được nhiều vi khuẩn gây bệnh, khả năng đào thải nhanh, giá trên thị trường không quá cao…, nên nó được sử dụng ở rất nhiều trong lĩnh vực nhân giống thủy sản và nuôi trồng thủy sản từ nhiều năm nay Vì vậy vấn đề lạm dụng TCs trong thủy sản là rất đáng quan tâm

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được phát triển để kiểm soát dư lượng tồn lưu của TCs trong thủy sản và các sản phẩm chế biến từ thủy sản Theo Quyết định 10/2002/QĐ-BTS về tiêu chuẩn cấp ngành do Bộ trưởng Bộ Thủy sản ban hành ngày 08 tháng 04 năm 2002 kèm theo tiêu chuẩn 28 TCN 177: 2002: hàm lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (gọi tắt là HPLC), giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp này là 10 µg/kg Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracyclin và Tetracyclin trong thành phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 – 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997

Kháng sinh TCs trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm tại PH = 4, dung dịch đệm được sử dụng trong phương pháp này là McIlvaine – EDTA

Cột sắc ký: cột pha đảo C18, LxD: 150x4.6 mm, kích thước hạt 5 µm, nhiệt độ cột: 350C Thành phần pha động là hỗn hợp dung dịch ammonium acetate 0.05 M (pH = 3.0) : Acetonitrile theo tỉ lệ thể tích là 80 : 20

Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18 Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn, độ lặp lại 2 lần, độ thu hồi được cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 % Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo

chiều cao peak sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5% Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995

Bên cạnh phương pháp qui định trên thì trên thế giới hiện nay cũng phát triển nhiều phương pháp để xác định dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản Sau đây xin giới thiệu một vài phương pháp:

2.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng Tetracyclin trong mẫu tôm và sữa nguyên chất bằng cách sử dụng sắc ký lỏng đầu dò UV và xác nhận lại bằng đầu dò khối phổ (Andersen et al., 2004)

Hai phương pháp đã được phát triển để xác định đồng thời TC, OTC,

và CTC ở tôm và trong sữa nguyên chất Phương pháp này được phát triển để đơn giản hóa việc chiết mẫu và các bước làm sạch mẫu được tiến hành nhanh chóng và thuận tiện cho việc kiểm tra mẫu một cách thường xuyên Trong phương pháp này thì hai mẫu tôm và sữa nguyên chất được chiết xuất một cách đơn giản bằng acid succinic trên cột pha rắn copolymeric (SPE)

Cột sắc ký được sử dụng là cột MacMod Hydrobond PS C8, 5 µm, 4.6

mm, với một đầu lọc (0,5 µm) được sử dụng phân tích cả 2 mẫu Dung dịch pha động là 75% A + 18% acetonitrile + 7% methanol, trong đó A gồm acid oxalic 0.01 M trong mẫu sữa và acid formic 0.1% trong mẫu tôm

Tất cả các dung môi pha động được lọc qua lớp màng PVDF 0.45 µm Tốc độ dòng chảy là 1mL/phút, ở nhiệt độ là 350C, lượng mẫu được sử dụng là

400 µl Độ hấp thụ ở bước sóng là 370 nm việc định lượng của của ba loại tetracyclin trong mẫu tôm và sữa ở nồng độ là 50, 100, 200, 300, và 400 ng/g Hiệu suất thu hồi lớn hơn 75% với RSD nhỏ hơn 10% Hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải bằng 0,9975 Giới hạn định lượng (LOQ) được ước tính trong khoảng 50 ng/g đối với cả hai mẫu tôm và sữa Kết quả dư lượng kháng sinh của nhóm tetracyclin bằng hệ thống LC-MS-MS ở mẫu tôm là 25-

400 ng/g và mẫu sữa là 5-30 ng/g

2.2.2 Phương pháp 2: Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong cơ thịt lợn bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép phổ khối lượng (Cherlet et al., 2003)

Theo phương pháp này giới thiệu thì nhóm kháng sinh tetracyclin bao gồm 4 loại: Tetracyclin (TC), Chlortetracyclin (CTC), Oxytetracyclin (OTC)

và Doxycyclin (DOX) được sử dụng rất nhiều trong thuốc thú y vì khả năng kháng khuẩn phổ rộng và chi phí sử dụng thấp Do đó nghiên cứu này được

phát triển nhằm mục đích xác định dư lượng tồn lưu của nhóm kháng sinh tetracyclin trong cơ thịt lợn

Trong phương pháp phân tích này thì việc phân tích nhóm kháng sinh tetracyclin có sự có mặt của chất nội chuẩn Demethylchlortetracyclin (DMCTC) Cũng trong phương pháp thì dịch chiết được sử dụng là sodium succinate tại pH = 4.0, tiếp theo thì dịch chiết được làm sạch protein bằng dung dịch Acid trichloroacetic và sau đó được lọc qua màng lọc Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo HLB và sau đó được đưa đi phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS

Cột sắc ký được sử dụng là pha cột đảo cao phân tử PLRP-S (8 µm,

250 mm x 4.6 mm i.d.), kết hợp với một cột (5 mm x 3 mm i.d.) từ phòng thí nghiệm (shropshire, UK), nhiệt độ cột được duy trì ở 600C Pha động A gồm acid oxalic 0,001 M, acid formic 0,5% (v/v) và THF 0,3% (v/v) trong nước, pha động B là THF Pha động chạy trong hệ thống LC với tốc độ dòng chảy là 1mL/phút trong thời gian 40 phút Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp

là từ 0,5 – 4,5 ng/g, giới hạn định lượng (LOQ) bằng một nữa MRLs tương ứng đối với mỗi mẫu phân tích là hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn hơn 0,99, RSD nhỏ hơn 10%

Dư lượng tối đa (MRL) của phương pháp này được xác nhận là phù hợp với yêu cầu của EC và dựa trên quyết định số 93/256/EEC thì các giá trị MRL tương ứng như sau: 100 ng/g đối với cơ thịt; 300 ng/g đối với da, mỡ và gan; 600 ng/g đối với thận

2.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kết hợp với ion hóa bằng

áp suất khí quyển (APCI LC-MS/MS) (Nakazawa et al., 1999)

Phương pháp này được xây dựng nhằm mục đích xác định một cách chính xác nhất dư lượng kháng sinh TCs bằng hệ thống APCI LC-MS/MS (Atmospheric pressure chemical ionization liquid chromatography mass spectrometry) Bằng cách thiết lập nhiệt độ đầu dò ống phun đến 4750C Pha động là acid oxalic được sử dụng mà không gây ảnh hưởng cản trở đến hệ thống APCI Ở nhiệt độ cao thì acid oxalic bị phân hủy thành Cacbon dioxit và nước

Chất nội chuẩn được sử dụng là Demethylchlortetracyclin (DMCTC) và

nó được xem như là chất nội chuẩn hiệu quả nhất trong việc xác định dư lượng kháng sinh tetracyclin trong các loại thực phẩm khác nhau

Cột sắc ký được sử dụng là cột Bakerbond C8 (5 µm, 250x4,6 mm I.D., J.T Baker chemical, Phillipsburg) ở nhiệt độ 300C Thành phần pha động gồm Methanol – Acetonitrile – dung dịch acid oxalic 5mM (18:27:55, v/v/v) Tốc

độ dòng chảy là 1 mL/phút và bước sóng sử dụng là 350 nm

Độ thu hồi của kháng sinh tetracyclin trong các sản phẩm khác nhau như thịt động vật, mật ong, trứng, cá ở các nồng độ là 0,05; 0,1; 0,5 ppm trung bình từ 60,1 – 88,9 % và RSD trong khoảng từ 1,2 – 8,7 % Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 0,001 ppm cho OTC và TC; 0,004 ppm cho CTC; 0,002 ppm cho DOX

2.3 Mức độ tồn lưu của nhóm kháng sinh TCs

Theo quá trình khảo thời gian tồn lưu kháng sinh Oxytetracyclin của Cháfer-Pericás et al., (2010), trong các mẫu cá được nuôi ở khu vực bờ biển Địa Trung Hải cho kết quả như sau:

Hình 2.1 So sánh các phương pháp phân tích dư lượng OTC trong các mẫu cá Trong kết quả nghiên cứu này sau thời gian 37 ngày kể từ ngày sử dụng kháng sinh OTC thì dư lượng kháng sinh OTC sẽ giảm xuống dưới giới hạn MRL (MRL = 100 ng/g) Trong nghiên cứu này thì các tác giả không thể đưa ra một khoảng thời gian chính xác về khả năng đào thải hoàn toàn của OTC trong các mẫu cá Theo tác giả thì để xác định được thời gian đào thải chính xác của kháng sinh OTC thì cần phải có một nghiên cứu thật hoàn chỉnh

về dược động học của loại kháng sinh này

2.4 Qui định của một số quốc gia về việc sử dụng thuốc và hóa chất trong sản xuất kinh doanh thủy sản

Hiện nay thì các loại hóa chất và kháng sinh được sử dụng rất phổ biến trong hoạt động sản xuất và kinh doanh thủy sản, việc lạm dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản đang gây ra những mối lo ngại lớn trong việc đảm bảo chất lượng sản phẩm thủy sản, sức khỏe người tiêu dùng và vấn đề xuất khẩu thủy sản ra nước ngoài Trước tình hình đó thì Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành Thông tư số 20/2010/TT-BNNPTNT ngày 02 tháng

04 năm 2010 bổ sung và sữa đổi Thông tư 15/2009/TT-BNN ngày 17 tháng 03 năm 2009 thay thế cho Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005 của

Bộ trưởng Bộ Thủy sản về việc ban hành danh mục hóa chất, kháng sinh cấm

sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản Theo Thông tư này thì có 20 loại hóa chất và kháng sinh bị cấm sử dụng và 33 loại hóa chất, kháng sinh hạn chế

sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thủy sản Trong thông tư này thì Chlortetracyclin, Oxytetracyclin và Tetracyclin nằm trong danh mục các loại hóa chất và kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thủy sản với dư lượng tối đa (MRL) là 100ppb cho từng loại

Theo Quyết định số 2377/90/EC cập nhật ngày 19/08/2005 qui định về danh mục hóa chất và kháng sinh gồm có 10 loại kháng sinh cấm sử dụng và

31 loại kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thủy sản, trong đó các kháng sinh CTC; OTC và TC (Tính theo tổng hoạt chất và các đồng phân lập thể của nó) được sử dụng với dư lượng tối đa (MRL) là 100ppb cho từng loại (Được trích dẫn bởi Bùi Thị Thu Cúc, 2009)

Theo Quyết định số 21 CFR 530.41 của FDA thì tại Mỹ có 12 loại hóa chất, kháng sinh bị cấm sử dụng và 5 loại hóa, kháng sinh nằm trong danh mục giới hạn dư lượng thuốc, hóa chất trong thực phẩm thủy sản Trong đó kháng sinh OTC được sử dụng với giới hạn dư lượng là 2 ppm (Được trích dẫn bởi Bùi Thị Thu Cúc, 2009)

Tại Canada thì có 5 loại hóa chất, kháng sinh bị cấm sử dụng cho động vật và 6 loại thuốc, hóa chất nằm trong danh mục quy định giới hạ dư lượng thuốc và hóa chất tại Canada, trong đó kháng sinh OTC được sử dụng trong họ

cá hồi và tôm hùm với giới hạn dư lượng là 200ppb (Được trích dẫn bởi Bùi Thị Thu Cúc, 2009)

Theo qui định của Bộ Thủy sản Việt Nam (2001) thì phải ngưng sử dụng chất kháng sinh từ 28 ngày trở lên trước khi tiến hành thu hoạch

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường

UV- Cấu tạo một số bộ phận cơ bản

Bình chứa dung môi: Có thể tích khoảng 500mL đến 2L, thường làm

bằng thủy tinh màu để chứa chất nhạy với ánh sáng, bình chứa thường phải đậy thật kính nếu pha động phải là những chất dễ bay hơi (Methanol,

Acetone…)

Nếu hệ thống chạy ở chương trình cố định tỉ lệ dung môi pha động (Isopratic) thì thông thường chỉ sử dụng một bình chứa dung môi, nếu hệ thống chạy ở chương trình thay đổi tỉ lệ dung môi pha động (Gradian) thì sẽ có

từ 2 bình chứa dung môi trở lên

Bơm: Để bơm pha động vào cột để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột,

thông thường thì tùy theo cột sắc ký sử dụng mà ta sẽ chọn tốc độ dòng phù hợp và phù hợp với chất cần phân tích, thông thường tốc độ dòng vào khoảng 0.5 – 3 mL/phút

Bộ phận tiêm mẫu: Bơm mẫu theo kiểu van loop: Được sử dụng nhiều

do mẫu được bơm vào một hệ thống ống dẫn dạng vòng có van chặn và sau đó được đưa vào hệ thống bằng cách xả van Kiểu bơm này tốt khi dùng dưới áp

suất cao và độ lặp lại cao và có thể tự động hóa chúng được

Cột phân tích: Dài từ 5 - 30 cm, đường kính thường từ 1 - 5 mm, kích thước chất nhồi cột thường là 3 - 5 m

Đầu dò quang phổ kế khả kiến tử ngoại: Loại đầu dò này dùng cho

chất tan có thể hấp thu được tử ngoại và tia sóng thấy được (UV-vis) Trên thị trường có những loại đầu dò có độ dài sóng ổn định từ 254nm - 380nm và gần đây phát triển thêm đầu dò có độ dài sóng từ 190nm - 700nm nhằm mở rộng

lĩnh vực áp dụng

Bộ phận thu nhận tín hiệu: Bộ phận nhận tín hiệu ở đây thường là

máy vi tính được kết nối với hệ thống thông qua phần mềm chuyên dụng (hệ thống đang khảo sát sử dụng phần mềm Shimazu LC Solution), bộ phần đầu

dò sẽ phát hiện chất cần phân tích và chuyển vào hệ thống ghi nhận tín hiệu

thông qua dạng peak

Một số loại thiết bị và dụng cụ khác

Máy ly tâm, máy vortex, máy lắc ngang

Các loại Pipette, đầu cone pipette, bình định mức 10 mL, 20 mL, 100

mL, 250mL

Cột sắc kí Gemini C18 (5µm, 3.00 x 150mm)

SPE Strata C18-E (55µm, 70A) 500mg/6ml

Các phụ kiện và dụng cụ cần thiết trong phân tích sắc kí

Dung dịch chuẩn của các chất TC, OTC, CTC, DC, loại có giấy chứng nhận về hàm lượng

Dung dịch chuẩn trung gian DC 100ppm: Sử dụng pipet hút chính xác 100µL dung dịch chuẩn DC 1000ppm và sau đó định mức dung dịch đến thể tích bằng 1mL bằng methanol

Dung dịch chuẩn trung gian DC 10ppm: Sử dụng pipet hút chính xác 100µL dịch chuẩn DC 100ppm cho vào 900µL methanol để đạt thể tích là 1

Dung dịch acetonitrile - acid oxalic 0,01 M: Hòa tan 189g acid oxalic 0,01 M trong bình định mức 1000 mL rồi định mức tới vạch Hòa tan 1000 mL dung dịch trên với 250 mL acetonitrile

3.2.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa các thông số hệ thống sắc ký hiệu năng cao cho phân tích nhóm kháng sinh Tetracycline; Doxycycline và khảo sát qui trình chiết tách

a Chạy chuẩn trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Các dịch chuẩn đã được chuẩn bị (ở mục 3.2.1.2) được pha loãng đạt nồng độ lần lượt là 100ppb; 200ppb; 500ppb; 1ppm (Pha loãng chất chuẩn bằng methanol) sẽ được tiến hành chạy trên hệ thống HPLC với nồng độ từ thấp đến cao Mỗi dung dịch chuẩn được tiêm lặp lại 2 lần nhằm xác định thời gian lưu, diện tích và chiều cao peak

Tiến hành phân tích nhóm kháng sinh TCs trong cùng một điều kiện: bước sóng, pha động, cột phân tích, thời gian phân tích

b Tìm bước sóng thích hợp và điều kiện dung môi thích hợp của pha động (Tỉ lệ dung môi A& B, sự thay đổi tỉ lệ dung môi A& B, lưu lượng của dung môi) của quá trình phân tích

 Tìm điều kiện dung môi

Cố định bước sóng, cố định tỉ lệ dung môi A và B và thay đổi độ dòng của pha động

Cố định bước sóng, thay đổi tỉ lệ dung môi A và B và thay đổi độ dòng của pha động

c Tìm điều kiện cột phân tích

Thí nghiệm được thực hiện với 2 cột sắc ký:

Qui trình chiết tách được tham khảo từ Tiêu chuẩn ngành số 28 TCN

177 : 2002 : Hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong sản phẩm thuỷ sản

- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao theo quyết định số 10/2002/QÐ- BTS của bộ Thủy Sản

 Mục đích

Tối ưu hóa các điều kiện phân tích kháng sinh tetracycline trong sản phẩm thủy sản ở điều kiện phòng thí nghiệm dinh dưỡng và chế biến thủy sản

 Phương pháp gây nhiễm

Tiến hành gây nhiễm bằng cách cho trực tiếp chất kháng sinh Doxycycline với nồng độ 500 ppb vào mẫu cá, sau khi chuẩn bị mẫu xong tiến hành phân tích mẫu trên HPLC

 Hiệu suất thu hồi

Công thức tính hiệu suất thu hồi:

1001

H: Hiệu suất thu hồi (%)

N1: Nồng độ ban đầu của chất phân tích (µg/mL)

N2: Nồng độ lúc sau của chất phân tích (µg/mL)

 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí với 1 nhân tố lặp lại 2 lần

 Sơ đồ bố trí thí ngiệm

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Mẫu cá tra nguyên liệu (Cá tra fillet) được mua từ siêu thị Metro Cần Thơ (Địa chỉ: Lộ 91B nối dài – Phường Hưng Lợi – Quận Ninh Kiều – TP Cần Thơ) được xay nhuyễn và bảo quản ở nhiệt độ -200C

 Tiến hành thí nghiệm

Mẫu sau khi chuẩn bị xong sẽ được gây nhiễm với Doxycycline ở nồng

độ biết trước (250ppb), để yên trong 5 phút và sau đó sẽ được tiến hành khảo sát 2 qui trình để xác định hiệu suất thu hồi

Qui trình chiết tách

 Chuẩn bị hóa chất

 Chuẩn bị dung dịch đệm McIlvaine (pH = 4.0 ± 0.05)

Dung dịch A: hòa tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước cất trong bình định mức có dung tích la 1000 mL Định mức tới vạch

Dung dịch B: hòa tan 21,0 g acid xitric bằng nước cất trong bình định mức Định mức tới vạch

Cho từ từ 625 mL dung dịch A vào 1000 mL B Điều chỉnh pH = 4.0 (± 0.05) bằng cách cho từng giọt NaOH 0,1 M (Sử dụng pH kế để xác định pH)

Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng

 Chuẩn bị dung dịch McIlvaine – EDTA buffer

Hòa tan 60,5 g EDTA vào 1625 mL dung dịch McIlvaine

Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng

 Chuẩn bị dung môi rửa giải trong chiết tách pha rắn SPE

Hòa tan 1,26 g acid oxalic bằng methanol trong bình định mức 1000

mL Định mức tới vạch

 Tách chiết mẫu

 Qui trình chiết tách

1 Cân 2,00 g (±0,05) mẫu cá đã được xay nhuyễn cho vào ống ly tâm

15mL thứ 1 Thêm 7 mL dung dịch đệm McIlvaine – EDTA vào ống ly tâm Sau đó ta đem mẫu đi vortex trong 1 phút; lắc ngang trong 15 phút, tốc độ 300 vòng/phút; ly tâm 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C

2 Gạn dịch trong ống thứ 1 cho vào ống ly tâm thứ 2 Cho thêm 7 mL

dung dịch đệm McIlvaine – EDTA ống thứ 1 Tiếp tục đem mẫu đi vortex trong 1 phút; lắc ngang trong 15 phút, tốc độ 300 vòng/phút; ly tâm 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C rồi lại gạn dịch chiết cho vào ống ly tâm thứ 2

3 Đem ống ly tâm thứ 2 (Chứa dịch chiết 2 lần) đi ly tâm 15 phút ở tốc

độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 50C

 Làm sạch mẫu

4 Hoạt hóa cột Sep – Pak C18 bằng 6 mL methanol và 6 mL nước cất

loại bỏ dung dịch chảy qua cột

5 Cho dịch chiết trong ống ly tâm thứ 2 vào cột, loại bỏ dịch chiết chảy

qua cột

Chú ý: Không được để cho cột bị khô giữa 2 giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết, điều chỉnh cho dịch ra khỏi cột thành từng giọt

6 Cho 5 mL nước cất chảy qua cột, loại bỏ dung dịch chảy qua cột

Làm khô cột bằng không khí sạch trong vòng 2 phút

7 Rửa giải các chất kháng sinh nhóm Tetracyclin bằng cách cho 5mL

Acid oxalic – Methanol chảy qua cột, thu dịch ra khỏi cột vào ống nghiệm thủy tinh 10 mL

8 Tiến hành phân tích dịch thu được bằng hệ thống HPLC