PHÂN TÍCH tồn lưu THUỐC TRỪ sâu DICHLORVOS TRONG NGUYÊN LIỆU cá TRA BẰNG hệ THỐNG sắc ký KHÍ

Giới thiệu

Việt Nam đứng trong top bốn quốc gia xuất khẩu thủy sản hàng đầu thế giới, với cá tra là mặt hàng chủ lực mang lại lợi ích kinh tế lớn và tạo việc làm cho nhiều người dân Năm 2010, sản lượng cá tra đạt 1,2 triệu tấn, chủ yếu tập trung tại Đồng Bằng Sông Cửu Long - khu vực nuôi trồng thủy sản lớn nhất cả nước Tuy nhiên, việc nuôi cá với mật độ cao không theo quy hoạch đã gây khó khăn trong việc kiểm soát thức ăn, dẫn đến ô nhiễm môi trường nước và bùng phát dịch bệnh, gây thiệt hại cho người nuôi Do đó, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để phòng và trị bệnh trở nên cần thiết và quan trọng hơn bao giờ hết.

Trichlorfon là một loại thuốc bảo vệ thực vật bị cấm sử dụng theo Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS của Bộ Thủy sản, do những khó khăn trong thị trường tiêu thụ và các rào cản kỹ thuật, an toàn thực phẩm Khi hòa tan trong nước, Trichlorfon chuyển hóa thành Dichlorvos, vì vậy việc xác định tồn lưu Dichlorvos trong sản phẩm thủy sản trở nên cấp thiết để đảm bảo chất lượng xuất khẩu và sức khỏe con người Đề tài “Phân tích tồn lưu Dichlorvos trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký khí” được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn dinh dưỡng và chế biến thủy sản nhằm đáp ứng yêu cầu này.

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm xác định thời gian tồn lưu của Dichlorvos trên cá tra Để thực hiện điều này, phương pháp phân tích được xây dựng sử dụng sắc ký khí trong điều kiện phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến thủy sản.

Nội dung thực hiện

Tối ưu hóa các thông số của hệ thống sắc ký khí

So sánh các phương pháp chiết tách Dichlorvos trên mẫu cá tra, mẫu nước Xác định thời gian tồn lưu của Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước.

Tìm hiểu về Trichlorfon

Trichlorfon là một hóa chất và kháng sinh bị cấm sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thủy sản theo Thông tư số 15/2009/TT-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Theo tiêu chuẩn ngành 28TCN 195:2004, giới hạn phát hiện trichlorfon trên thủy sản được quy định là 0,7 ppb, như được xác nhận bởi Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh theo quyết định số 429/QĐ-BNN-QLCL.

Trichlorfon là một loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ hiệu quả trong việc tiêu diệt nhiều loại côn trùng như gián, dế, rệp, bọ chét, bò bới, ruồi, bọ ve và rầy lá Ngoài ra, sản phẩm này cũng được sử dụng để diệt ký sinh trùng trong ngành thủy sản và áp dụng cho cây trồng, rau quả.

2.1.1.2 Công thức cấu tạo của Trichlorfon

Công thức 2.1: Công thức cấu tạo thuốc trừ sâu Trichlorfon

Tên hóa học: Dimethyl-2,2,2-trichloro-hydroxyethylphosphonate

Công thức phân tử: C 4 H 8 Cl 3 O 4 P

Khối lượng phân tử: 257.436 g/mol

Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật tích tụ trong thủy sản không thể loại bỏ qua các biện pháp chế biến và bảo quản, dẫn đến nguy cơ sức khỏe cho người tiêu dùng qua chuỗi thức ăn Những hóa chất này ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh trung ương, gây ra các triệu chứng như kích thích thần kinh, co thắt khí quản, khó thở, run, co giật, và có thể gây ra chóng mặt, buồn nôn, sưng cơ bắp, thậm chí hôn mê và tử vong.

2.1.1.3 Công thức cấu tạo của Dichlorvos

Công thức 2.2: Công thức cấu tạo thuốc trừ sâu Dichlorvos

Tên hóa học: 2,2-dichlorovinyl dimethyl phosphate

Công thức phân tử: C4H 7 Cl 2 O 4 P

Khối lượng phân tử: 220.98g/mol

Dichlorvos là chất chuyển hóa từ trichlorofon dạng chất lỏng không màu đến hổ phách với một mùi hóa chất nhẹ

Commercial names for this product include Dipterex, Apavap, Benfos, Cekusan, Cypona, Derriban, Derribante, Devikol, Didivane, Duo-Kill, Duravos, Elastrel, Fly-Bate, Fly-Die, Fly-Fighter, Herkol, Marvex, No-dịch hại, Prentox, Vaponite, Vapona, Verdican, Verdipor, and Verdisol It has a water solubility of 10.00 mg/L and is soluble in various solvents including dichloromethane, 2-propanol, toluene, ethanol, chloroform, and acetone Additionally, it exhibits a vapor pressure of 290 mPa at 20°C.

EPA đã phân loại Dichlorvos thuộc lớp độc tính I - có độc tính cao, bởi vì nó có thể gây ung thư với nồng độ rất nhỏ

(Nguồn http://www.alanwood.net/pesticides/phorate.htm)

2.1.1.4 Sự chuyển hóa từ Trichlorfon thành dichlorvos

Trichlorfon trong môi trường sẽ được chuyển hóa thành Dichlorvos (O, O-dimethyl-2,2-dichlorovinyl phosphate), quá trình này giải phóng HCl, dẫn đến sự thay đổi pH của môi trường Nghiên cứu chỉ ra rằng ở nhiệt độ 13,5 oC, trong khoảng thời gian từ 1-4 giờ, 90% sản phẩm tạo ra từ Trichlorfon là Dichlorvos (Hofer, 1981).

2.1.2 Tình hình sử dụng Trichlorfon

2.1.2.1 Tình hình sử dụng Trichlorfon trên thế giới

Trichlorfon (TRC) là một loại thuốc trừ sâu lân hữu cơ phổ biến trong nuôi trồng thủy sản tại Đông Nam Á Việc sử dụng Trichlorfon một cách không kiểm soát có thể gây ra những biến đổi trong hoạt động nội tiết enzyme của các sinh vật sống.

Trichlorfon (2,2,2-trichloro-1-hydroxyethyl phosphonate) là một hợp chất lân hữu cơ phổ biến ở Đông Nam Á, được sử dụng rộng rãi để kiểm soát ký sinh trùng cá Liều lượng khuyến cáo của trichlorfon để tiêu diệt ký sinh trùng trên cá dao động từ 0,1-1,0 mg/L Tuy nhiên, nhiều nông dân thường vượt quá liều khuyến cáo trong hệ thống nuôi trồng thủy sản, dẫn đến việc sử dụng thuốc trừ sâu này lặp đi lặp lại trong nuôi trồng thủy sản thâm canh quy mô lớn ở châu Á, từ đó tạo ra tiềm năng đe dọa đến các loài cá, cua và tôm.

Trichlorfon (TRC) gây ra sự thay đổi chức năng thần kinh thông qua việc ức chế hoạt động của acetylcholinesterase (AChE), mặc dù không phải là một tác nhân ức chế mạnh Độc tính của TRC chủ yếu đến từ chất chuyển hóa dichlorvos, một chất độc hại hơn và là một chất ức chế mạnh AChE Khi tiếp xúc với TRC, cá có thể bị ức chế và ở mức độ cao, độc tính của nó có thể dẫn đến tử vong Người nuôi thủy sản tại Nauy sử dụng trichlorfon để tiêu diệt rận trên cá hồi, minh chứng cho tính ứng dụng của hóa chất này trong ngành thủy sản.

Pakistan sử dụng trichlorfon để kiểm soát ruồi giấm (Tephritidae) trên cây ổi, một loại côn trùng gây thiệt hại nghiêm trọng cho trái cây và rau quả, có thể dẫn đến mất mùa Ở nhiều nước đang phát triển, việc sử dụng thuốc trừ sâu không đúng quy định gây ra dư lượng trong thực phẩm, tạo ra nguy cơ sức khỏe cho người tiêu dùng (FAO/WHO, 1989).

Brazil sử dụng trichlorfon để tiêu diệt ký sinh trùng trên cá mà không có sự hướng dẫn của cán bộ kỹ thuật, điều này có thể dẫn đến nguy cơ ngộ độc cho người sử dụng (Richmonds và Dutta, 1989; Hinton và Lauren, 1990; Veiga et al., 2002; Varo et al., 2003).

2.1.2.2 Tình hình sử dụng Trichlorfon ở Việt Nam

Vào năm 2007, huyện Thốt Nốt, Cần Thơ đã chứng kiến sự kiện 100 tấn cá tra nuôi chết hàng loạt do sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Dipterex, một loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm phosphat hữu cơ (Trichlorfon), rất độc hại cho con người, động vật và cá, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thần kinh Hiện nay, hóa chất này đã bị cấm sử dụng trong nông nghiệp và nuôi trồng thủy sản không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia khác trên thế giới.

Thuốc Dipterex đã bị cấm sử dụng do ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng cá và sức khỏe người tiêu dùng Tuy nhiên, với thói quen sử dụng và giá rẻ khoảng 65.000 đồng/kg, nông dân vẫn tiếp tục mua và sử dụng thuốc này Dipterex dễ dàng tìm thấy tại các cửa hàng thuốc bảo vệ thực vật, đặc biệt là ở các vùng nông thôn, không chỉ riêng Cần Thơ Mặc dù là thuốc cấm, nhiều người vẫn tin rằng nếu sử dụng với liều lượng nhỏ, thuốc sẽ không gây hại, dẫn đến việc tiếp tục sử dụng để diệt khuẩn cho cá.

2.1.3 Ứng dụng và tác hại

2.1.3.1 Ứng dụng của Trichlorfon Trong thủy sản

Dùng để diệt các loại ký sinh trùng (bọ, rận…) có hại trong thủy sản

Trichlorfon là một hóa chất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản, được sử dụng để diệt ký sinh trùng gây hại Đến nay, nó vẫn là một trong những hóa chất hiệu quả nhất cho mục đích này và được áp dụng rộng rãi trên toàn cầu.

Dipterex là một chất diệt trùng hiệu quả với khả năng tiêu diệt lên đến 90% Trong nuôi trồng thủy sản, Dipterex có nhiều dạng nồng độ khác nhau như 2,5%; 25%; và 50%, trong đó nồng độ thường được sử dụng là 25% và 50% Chất này có tác dụng tiêu diệt hiệu quả các loại côn trùng, giáp xác, giun sán, và động vật nguyên sinh bằng cách tác động lên hệ thần kinh của chúng Dipterex thường được dùng để tẩy ao và điều trị các bệnh do giáp xác gây ra, như bệnh trùng mỏ neo, với nồng độ phun xuống ao từ 0,2-0,25 ppm đối với Dipterex 25%, mang lại hiệu quả cao mà ít ảnh hưởng đến sức khỏe của cá.

Để trị bệnh sán lá đơn chủ, có thể tắm cá trong nước muối 3% trong 3-5 phút hoặc sử dụng Dipterex Dipterex, một loại thuốc thú y thủy sản, đã bị Bộ thủy sản cấm sử dụng trong sản xuất kinh doanh theo quyết định 07/2005/QD-BTS ngày 24/02/2005 Khi phun Dipterex xuống ao, cần sử dụng nồng độ 0,2 - 0,5 g/m3 với loại Dipterex tinh thể 90% Nếu sử dụng loại Dipterex thương mại 25%, cần dùng 5-10 g/m3 để đạt hiệu quả trị bệnh tốt (Phạm Thị Thu, 2005).

Mức độ tồn lưu của Trichlorfon

Hameed et al (1980) báo cáo rằng dư lượng trichlorfon trên ổi kéo dài trong 7 ngày, trong khi Barkat Ali Khan et al (2009) cho thấy dư lượng này tồn tại từ 14-21 ngày và sau 10 ngày thì mất 90% dư lượng trichlorfon trong sản phẩm Sự khác biệt về thời gian tồn tại của trichlorfon có thể do điều kiện và cách bố trí trong khu vườn thí nghiệm khác nhau.

Bảng 2.2 Thời gian tồn lưu của trichlorfon trên quả ổi (2001)

Thời gian sau khi phun thuốc (ngày)

Các phương pháp xác định dư lượng Trichlorfon và Dichlorvos

2.3.1 Sử dụng phương pháp HPLC phân tích trichlorfon trong nước biển ở Nauy (Samuelsen, 1987)

Dung dịch đệm được chuẩn bị từ acetonitril và phosphate 0,01 M với pH 5,5 bằng cách hòa tan 1,38 g NaH2PO4 trong 1 lít nước cất và điều chỉnh pH bằng dung dịch KOH 1N Sau đó, dung dịch đệm phosphate và acetonitril được phối trộn và lọc qua màng lọc HA 0,45 µm Dung dịch pha động được khử khí bằng dòng khí heli trong 2 phút, với đầu dò cài đặt ở bước sóng 205 nm, tốc độ bơm 1 ml/phút, áp lực 2000 psi và thể tích tiêm 100 µL Chất nội chuẩn sử dụng là phosdrin, có nồng độ 10 µg/mL, tan và ổn định trong nước Mẫu được chuẩn bị trong bể chứa 15 lít nước biển, có máy sục khí và hệ thống điều chỉnh nhiệt độ, với 4,5 g Neguvon có nồng độ ban đầu 300 ppm.

Để tiến hành phân tích, cần pha trộn 900 àL mẫu từ bể nước với 100 àL dung dịch nội chuẩn, sau đó phân tích 100 àL của hỗn hợp này Giới hạn phát hiện đối với Trichlorfon là 1 ppm, trong khi đối với dichlorvos là 0,02 ppm.

2.3.2 Nghiên cứu xác định trichlorfon trên bắp cải, sử dụng HPLC-UV xúc tác oxy hóa bằng benzidine (Hai-zhen Zhu et al, 2008)

Cân 2 g bắp cải bị nhiễm Trichlorfon được cắt nhỏ và đồng nhất Chất đồng nhất đươc khuấy trộn khoảng 15 phút với 5 mL nước Sau 30 phút hỗn hợp được lọc, phần bã được làm sạch qua 2 lần nước, chất lọc này cho vào trong ống nghiệm, lượng thích hợp bezidine và SPB được thêm vào và giữ ở nhiệt độ 70 o C khoảng 10 phút sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng 1,5 mL dd triton X-100 (30% w/v), 1,5g Na2CO3 được thêm vào, sau đó bình được làm loãng đến 10ml bằng nước, dung dịch được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, nó được tách thành 2 pha riêng biệt Pha nước được rút ra bằng ống tiêm, phần còn lại được giữ trong ống nghiệm và làm loãng đến 0,5 mL bởi pha động Pha động: methanol-nước (75:25, v/v), tốc độ lưu lượng 0,8 mL/phút, pha động và dung dịch mẫu được lọc qua màng 0,45 àm, sau đú tiờm vào hệ thống HPLC, đầu dò có bước bước sóng đặt ở 365 nm Trichlorfon hấp thụ tốt nhất ở bước súng 365 nm Giới hạn phỏt hiện LOD là 2 àg/L

2.3.3 Xác định dư lượng trichlorfon trên quả ổi bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC (Barkat Ali Khan et al., 2009)

Thời gian lấy mẫu được thực hiện vào các ngày 0, 3, 7, 14 và 21 sau khi phun thuốc trichlorfon Mẫu 200 g được cắt nhỏ và xay ở tốc độ 2200 vòng/phút để đồng nhất Sau đó, 50 g mẫu được cho vào bình 250 mL, thêm 75 mL ethyl acetate và 25 g anhydrous sodium sulphate, lắc trong 2 giờ ở tốc độ 80 vòng/phút Ethyl acetate được lọc qua giấy lọc Cột sắc ký có kích thước 15cmx25mm được kích hoạt bằng 15 g Florisil ở 150 oC trong ít nhất 24 giờ, sau đó thêm 3 g than và 5 g anhydrous sodium sulphate Cột được làm sạch bằng ethyl acetate trước khi chạy mẫu với tốc độ 5 mL/phút Sau khi chuẩn bị cột, dung dịch mẫu được cô quay cho khô, hòa tan trong 1 mL acetone và đem phân tích với tốc độ 1 mL/phút, LOD là 0,01 µg/g.

2.3.4 Xác định dư lượng Trichlorfon ở tôm bằng phương pháp Sắc ký khí sử dụng đầu dò nito-phospho (Ngoh and Cullison, 1996)

Cõn 2,5 g mẫu cho vào ống nghiệm ly tõm 50 mL 100àL dung dịch trichlorfon chuẩn chạy trên máy được thêm vào mẫu tôm Cân 15 g Na2SO 4 ,

30 mL ethyl acetate khan được thêm vào mẫu tôm và đồng nhất trong 30 giây, sau đó lắc ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút ở 25°C Chất nổi trên bề mặt được đổ vào bình quả lê dung tích 200 mL có chứa 100 µL n-hexadecane Tiếp theo, 20 mL ethyl acetate khan được thêm vào ống nghiệm ly tâm và ethyl acetate được làm bay hơi hoàn toàn bằng thiết bị cô quay, phần còn lại được cho vào bình quả lê Cuối cùng, phần chiết được hòa tan trong 5 mL petroleum ether.

Cột SPE cyanopropyl được xử lý bằng 3 ml diethyl ether và 5 mL petroleum ether với tốc độ lưu lượng 1-2 giọt/giây Sau khi rửa bình quả lê bằng 1 mL petroleum ether, dung dịch được đổ vào cột SPE Tiếp theo, cột SPE được làm sạch bằng 2 mL hỗn hợp dichloromethane và petroleum ether theo tỷ lệ 10:90 Sử dụng thiết bị chân không, cột SPE được làm khô hoàn toàn trong khoảng 10 giây Chất phân tích được tách ra từ cột SPE bằng 3 mL hỗn hợp methanol và diethyl ether theo tỷ lệ 2:98 Sau khi làm bay hơi hoàn toàn bằng khí nitơ, chất phân tích còn lại được hòa tan trong 200 µL toluene để tiến hành phân tích, với LOD là 8 ng/g và LOQ là 14 ng/g.

Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc và hoá chất

Trước tình trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, Bộ Thủy sản đã ban hành Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24-2-2005, trong đó Trichlorfon (Dipterex) nằm trong danh sách 17 hóa chất kháng sinh bị cấm sử dụng Quyết định này yêu cầu các cơ quan truyền thông địa phương tăng cường tuyên truyền về tác hại của các loại thuốc thú y, hóa chất và kháng sinh nằm trong danh mục hạn chế và cấm sử dụng theo quy định.

Bộ Thủy sản (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 27/9/2006)

Mỹ có quy định nghiêm ngặt về việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, với danh mục các chất cấm sử dụng được thiết lập rõ ràng.

Theo Quyết định số 25/2005/QĐ-BNN ngày 18-5-2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, thuốc Dipterex, còn được biết đến với tên gọi Trichlorphon và Metriphonat, nằm trong danh mục cấm sử dụng.

Sắc ký khí

Sắc ký khí là kỹ thuật tách các chất bay hơi thông qua cột, sử dụng khí trơ làm khí mang để dẫn các chất này đi.

2.5.1 Các bộ phận của hệ thống sắc ký khí

Hình 2.1 Hệ thống sắc ký khí (GC)

- Bộ phận phát hiện hay đầu dò (detector) (4)

- Bộ phận ghi tính hiệu

Sắc kí phân bố giữa pha tĩnh và khí mang, cùng với sắc kí hấp phụ trên pha tĩnh, là cơ chế quan trọng trong quá trình tách chất Việc lựa chọn kiểu cột tách phù hợp phụ thuộc vào các đặc tính lý hóa của chất phân tích và sự khác biệt về áp suất hóa hơi (P).

Phương pháp sắc ký khí hoạt động dựa trên việc sử dụng nhiệt để tách các chất, thường được áp dụng cho các chất dễ bay hơi và bền nhiệt Quá trình bắt đầu khi mẫu được bơm vào thiết bị tiếp nhận mẫu, với một lượng mẫu 1µl được hút bằng dụng cụ tiêm mẫu chuyên dụng Sau đó, mẫu được bơm nhanh vào buồng tiêm mẫu của hệ thống và nhấn “Start” để máy tự động phân tích Thiết bị tiêm mẫu có hệ thống gia nhiệt, giúp mẫu bay hơi ngay lập tức và được đẩy vào cột khí bằng khí mang.

Trong quá trình sắc ký, các chất được tách ra khi di chuyển qua cột với thời gian lưu khác nhau, phụ thuộc vào ái lực của chúng với chất áo trên cột Chất có ái lực mạnh sẽ lưu lại lâu hơn, trong khi chất có ái lực yếu sẽ được khí mang ra ngoài trước Quá trình tách chất cũng chịu ảnh hưởng lớn từ việc lập trình nhiệt; nếu không hợp lý, các peak sẽ gần nhau, gây khó khăn trong việc phân tích.

Các chất tách ra từ cột được chuyển đến đầu dò (Detector), một thiết bị chuyển đổi bức xạ điện tử thành tín hiệu điện.

Dòng tín hiệu từ đầu dò đi ra được khuếch đại đưa vào hệ thống ghi nhận kết quả và hiển thị trên màng hình máy vi tính

2.5.3 Đầu dò bắt điện tử (ECD - electron capture detector)

Đầu dò ECD là một trong những thiết bị phổ biến nhất trong sắc ký khí (GC), chỉ sau đầu dò FID Thiết bị này thường được sử dụng trong các phân tích liên quan đến môi trường và dược phẩm.

Thiết kế ECD bao gồm một buồng kín với hai điện cực và một nguồn phát bức xạ electron để ion hóa Cấu trúc đầu tiên (a) có anode và cathode được bố trí đồng trục, trong khi cấu trúc thứ hai (b) sử dụng một tấm mỏng làm nguồn bức xạ, với anode và cathode được thiết kế thành hai mặt phẳng song song.

Khi dòng khí mang, thường là N2, đi qua, các electron bức xạ từ 63Ni sẽ ion hóa nó, tạo ra các ion dương Các ion và electron này di chuyển giữa hai điện cực, tạo thành dòng điện nền cân bằng Io Khi trong dòng khí xuất hiện hợp chất có nguyên tử độ âm điện cao, chúng sẽ bắt electron và phản ứng với các ion theo một phương trình nhất định.

Cường độ dòng điện sẽ giảm và được ghi nhận bởi đầu dò Đầu dò bắt điện tử có ưu điểm là rất nhạy, có khả năng phát hiện các hợp chất ở nồng độ cực nhỏ.

Mẫu không bị hư hại khi đi qua bộ phận đầu dò, điều này làm cho phương pháp sắc ký khí trở nên phù hợp cho việc sử dụng cột điều chế Sự đơn giản của quy trình này cũng là một ưu điểm nổi bật.

Chỉ nhạy với một số ít hợp chất còn các loại hợp chất khác sẽ không cho tín hiệu mũi trên sắc ký đồ

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách chất trong sắc ký khí: Áp suất hơi của một hợp chất:

Áp suất hơi đo lường khả năng chuyển đổi của các phân tử chất lỏng từ thể lỏng sang thể khí Các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ và tính phân cực yếu thường có áp suất hơi cao, trong khi các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn và tính phân cực mạnh lại có áp suất hơi thấp.

Các hợp chất có áp suất hơi lớn và chịu tác động mạnh mẽ của dòng khí pha động sẽ nhanh chóng thoát ra khỏi cột, đặc biệt là khi chúng hòa tan kém vào pha tĩnh Những hợp chất này thường có thời gian lưu nhỏ.

Các hợp chất có áp suất hơi lớn và khả năng hòa tan cao trong pha tĩnh sẽ có thời gian lưu trung bình lâu hơn khi ra khỏi cột.

Các hợp chất có áp suất hơi thấp và khả năng hòa tan cao trong pha tĩnh sẽ thoát ra khỏi cột sắc ký một cách chậm rãi, dẫn đến thời gian lưu lớn Điều này là đặc trưng của các loại cột sắc ký.

Việc tách riêng từng cấu tử trong hỗn hợp phụ thuộc vào sự tương tác của các thành phần với pha tĩnh, dẫn đến thời gian lưu của mỗi cấu phần không giống nhau Độ phân giải Rs là yếu tố quan trọng trong quá trình này.

Phương tiện nghiên cứu

Thực hiện trong phòng thí nghiệm bộ môn Dinh Dưỡng Và Chế Biến Thủy Sản-khoa Thủy sản- Đại học Cần Thơ

Hệ thống sắc ký khí (GC-2010)

Các loại Pipette, đầu cone pipette

Bình định mức 10 mL, 20 mL, 100 mL

Các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm

Sodium dihydrogen phosphate 1-hydrate (NaH 2 PO 4 )

Các hóa chất dùng trong sắc ký và các hóa chất khác dùng trong phòng thí nghiệm

1 Chuẩn Dichlorvos tinh khiết, loại có giấy chứng nhận hàm lượng

2 Dung dịch chuẩn Dichlorvos gốc 1000 ppm: Hòa tan 100 mg Dichlorvos bằng acetone trong bình định mức 100 ml Định mức đến vạch bằng acetone Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 o C) Dung dịch bền 6 tháng

3 Dung dịch chuẩn trung gian Dichlorvos 10 ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn Dichlorvos gốc 1000 ppm với acetone trong bình định mức

100 ml Định mức đến vạch bằng acetone Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 o C) Dung dịch bền 6 tháng

4 Dung dịch chuẩn trung gian Dichlorvos 1ppm: Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn Dichlorvos gốc 10 ppm trong bình định mức 10 ml Định mức đến vạch bằng acetone Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 o C) Dung dịch bền

5 Mẫu cá phân tích là các mẫu cá tra fillet

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa hệ thống sắc ký khí sử dụng đầu dò bắt giữ điện tử (GC-ECD) và các chu trình nhiệt khác nhau

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260 o C

Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ ( o C) Thời gian giữ ổn định (phút)

Tổng thời gian chạy: 19.50 phút

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270 o C

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260 o C

Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ ( o C) Thời gian giữ ổn định (phút)

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270 o C

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260 o C

Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ ( o C) Thời gian giữ ổn định (phút)

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270 o C

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút

Giới hạn phát hiện: 10ppb

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260 o C

Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ ( o C) Thời gian giữ ổn định (phút)

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270 o C

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 250 o C

Tốc độ ( o C/phút) Nhiệt độ ( o C) Thời gian giữ ổn định (phút)

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270 o C

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu suất thu hồi của diện tích peak khi làm khô dung dịch chiết tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitơ

3.2.2.1 Mục đích: Để tìm ra phương pháp làm khô dung dịch ly trích cho hiệu suất thu hồi tốt

Dung dịch chuẩn được pha loãng trong dung môi tinh khiết

Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố A là nhân tố phương pháp làm khô dung dịch ly trích gồm các nghiệm thức:

- A1: Phương pháp làm khô bằng thổi khí Nitơ

- A2: Phương pháp làm khô bằng hệ thống cô quay

Để chuẩn bị dung dịch, cho hỗn hợp dung dịch chuẩn vào ống fancol, sau đó thổi khí nito vào Tiếp theo, chuyển dung dịch vào bình cầu quả lê để cô quay Cuối cùng, thêm 5 ml Acetonitrile và tiến hành làm khô bằng hai hệ thống khác nhau.

Hoàn nguyên 1ml Hexan Hoàn nguyên 1ml Hexan

Loc-GC/ECD Loc-GC/ECD thống Hoàn lưu lại bằng n-hexan, lọc qua đầu col 0,2 m cho vào vial, hút 1

3.2.2.5 Đánh giá: Đánh giá diện tích peak và hiệu suất thu hồi.

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát các quy trình chiết tách Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước bằng sắc ký khí sử dụng đầu dò bắt giữ điện tử

3.2.3.1 Trên mẫu cá: a Quy trình chiết tách 1:

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Dichlorvos được chiết xuất từ sản phẩm thủy sản bằng dung dịch acetonitrile (ACN) và sau đó được làm sạch qua quy trình chiết lỏng - lỏng với chloroform Dịch chiết này được cô quay đến khô ở nhiệt độ 45C Cuối cùng, dịch chiết thu được được lọc qua đầu lọc 0,2 m và phân tích bằng phương pháp GC-ECD.

Chuẩn bị mẫu bằng cách nghiền đồng nhất 15 g mẫu cá và bảo quản dung dịch trong tủ đông ở nhiệt độ -20 °C cho đến khi sử dụng Trước khi sử dụng, cần đảm bảo mẫu cá đã được rã đông hoàn toàn.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống falcon 15 ml Tiến hành ly trích Dichlorvos

Để chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn, cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống falcon 15 ml, sau đó thêm 50 l dung dịch chuẩn Dichlorvos với nồng độ 1 ppm và tiến hành ly trích Dichlorvos.

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml

Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên thêm 5 ml acetonitril vào ống nghiệm và khuấy mạnh bằng máy lắc vortex trong khoảng 1 phút Sau đó, lắc bằng máy với tốc độ 300 lần/phút trong 20 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 20 phút và thu lấy dịch trong, sau đó chuyển vào ống nghiệm ly tâm nhựa 50 ml đã được làm sạch.

Sau khi thêm 5 ml acetonitrile vào phần cặn còn lại, khuấy mạnh bằng máy lắc vortex trong khoảng 1 phút, tiếp tục lắc với tốc độ 300 lần/phút trong 20 phút Sau đó, ly tâm ở 5000 rpm trong 20 phút để thu lấy dịch trong, cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết ban đầu, và loại bỏ phần cặn cuối cùng.

- Thêm vào ống falcon 50 ml trên 5ml chloroform và 5ml nước cất, sao đó vortex khoảng 1 phút, để yên khoảng 5 phút

- Dung dịch tách 2 lớp, hút lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml, sau đó đem cô quay đến khô

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.3:Quy trình chiết tách mẫu cá 1

Vortex 1 phút Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút)

Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút,

Dịch chiết cho vào ống Falcon 50 ml Xác thịt

Hoàn nguyên bằng 1ml n-Hexan

Lọc qua đầu col 0.2àm cho vào Vial Hỳt 1àl phõn tớch GC

Cô quay chân không đến khô

Vortex 1 phút Để yên tách lớp Hút lấy lớp dưới cho vào bình quả cầu 100ml

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút)

Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, o

Cân 2 g mẫu cá đã nghiền đồng nhất

Bỏ Hỗn hợp tách 2 lớp

Hỗn hợp tách 2 lớp b Quy trình chiết tách 2

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc chiết xuất dichlorvos từ sản phẩm thủy sản sử dụng dung dịch đệm acetone – acetonitrile với tỷ lệ 1:1 Sau khi chiết xuất, dịch chiết được cô quay đến khô ở nhiệt độ 45 C Cuối cùng, dịch chiết được lọc qua đầu lọc 0,2 m và phân tích bằng phương pháp GC-ECD.

Để chuẩn bị mẫu, cần nghiền đồng nhất ít nhất 15 g mẫu và bảo quản dung dịch trong tủ đông ở nhiệt độ -20°C cho đến khi sử dụng Trước khi sử dụng, mẫu cá phải được rã đông hoàn toàn.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml Tiến hành ly trích Dichlorvos

Để chuẩn bị mẫu kiểm soát, cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền nhuyễn vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml Tiếp theo, thêm 50 µl dung dịch chuẩn Dichlorvos với nồng độ 1 ppm và tiến hành ly trích Dichlorvos.

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml

Thêm 5 ml acetonitril và acetone theo tỷ lệ 1:1 vào ống nghiệm Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex trong 1 phút, sau đó lắc ngang với tốc độ 300 lần/phút trong 20 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 20 phút, sau đó thu lấy dịch trong và cho vào bình cầu quả lê 100ml đã được làm sạch.

- Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitril : acetone (1:1),

Để thực hiện quy trình chiết xuất, đầu tiên khuấy mạnh mẫu bằng máy lắc vortex trong khoảng 1 phút Sau đó, lắc ngang bằng máy với tốc độ 300 lần/phút trong 20 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 5000 rpm trong 20 phút để tách dịch Cuối cùng, thu lấy dịch trong và cho vào bình cầu chứa dịch chiết ban đầu, phần cặn còn lại sẽ được loại bỏ.

- Sau đó đem bình cầu cô quay đến khô ở 45 o C

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.4:Quy trình chiết tách mẫu cá 2 c Quy trình chiết tách 3

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch Ethyl acetate Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45 C

Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD

Chuẩn bị mẫu bằng cách nghiền đồng nhất ít nhất 15 g mẫu Bảo quản dung dịch trong tủ đông ở nhiệt độ -20°C cho đến khi sử dụng Đảm bảo mẫu cá được rã đông hoàn toàn trước khi sử dụng.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml Tiến hành ly trích Dichlorvos

Vortex 1 phút Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút)

Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút,

Dịch chiết cho vào bình cầu 100 ml Xác thịt

Hoàn nguyên bằng 1ml n-Hexan

Lọc qua đầu col 0.2àm cho vào Vial Hỳt 1àl phõn tớch GC

Cô quay chân không đến khô

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút)

Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, o

Cân 2 g cá đã nghiến đồng nhất

Bỏ Hỗn hợp tách 2 lớp

Để chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn, bạn cần cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất và cho vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml Sau đó, thêm 50 µl dung dịch chuẩn Dichlorvos với nồng độ 1 ppm và tiến hành ly trích Dichlorvos.

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml

- Thêm vào ống nghiệm 5 ml ethyl acetate Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc ngang bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng

20 phút Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu quả lê 100ml thật sạch

Để xử lý phần cặn còn lại, thêm 5 ml ethyl acetate và khuấy mạnh bằng máy lắc vortex trong khoảng 1 phút Sau đó, lắc ngang với tốc độ 300 lần/phút trong 20 phút Tiến hành ly tâm ở 5000 rpm trong 20 phút, thu lấy dịch trong và cho vào bình cầu chứa dịch chiết ban đầu, sau đó bỏ phần cặn còn lại.

- Sau đó đem cô quay đến khô ở 45 o C

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.5:Quy trình chiết tách mẫu cá 3

3.2.3.2 Trên mẫu nước: a Quy trình chiết tách 1 Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Dichlorvos được chiết xuất từ nước bằng Ethyl acetate và sau đó được làm sạch qua quy trình chiết lỏng - lỏng Dịch chiết này được cô quay khô ở nhiệt độ 45C Cuối cùng, dịch chiết thu được được lọc qua đầu lọc 0,2 m trước khi phân tích bằng phương pháp GC-ECD.

Xử lý số liệu

Tất cả số liệu được xử lý bằng Microsoft Excel 2003.

Tối ưu hóa hệ thống sắc ký khí

Bảng 4.3 Diện tích peak của Dichlorvos khi chạy sắc ký khí với dung dịch chuẩn ở nồng độ 50 ppb theo các chu trình nhiệt độ

Hình 4.10 Đồ thị diện tích peak ở các chu trình nhiệt độ khác nhau

Kết luận: Các chu trình nhiệt độ khác nhau tạo ra diện tích peak khác nhau Chu trình 2 có diện tích peak lớn nhất, nhưng độ trôi quá lớn khiến peak khó nhận diện Ngược lại, chu trình 1 có diện tích peak nhỏ hơn chu trình 2, nhưng với độ trôi nền thấp, khả năng nhận diện peak cao hơn.

Chu trình nhiệt độ (CT)

Nồng độ dung dịch chuẩn 4 chất (ppb) Dichorvos

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 còn lại diện tích peak không lớn Kết quả chọn chu trình 2 cho chạy sắc ký khí trong phân tích Dichlorvos.

Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi khi làm khô dung dịch chiết tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitơ

Cách tính hiệu suất thu hồi

Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi giữa 2 hệ thống làm khô dung dịch chuẩn

Hình 4.11 Đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi giữa thổi khô khí nitơ và cô quay

Kết quả từ hình 4.11 chỉ ra rằng hiệu suất thu hồi của hệ thống thổi khí nitơ vượt trội hơn so với hệ thống cô quay Tuy nhiên, do hạn chế về lượng khí trong quá trình thí nghiệm, hệ thống thổi khô bằng khí nitơ không thể sử dụng liên tục, buộc phải chuyển sang hệ thống cô quay để làm khô mẫu.

Chất phân tích Nồng độ

(50 ppb) Thổi khô Cô quay

Diện tích peak spike chuẩn trước Diện tích peak spike chuẩn sau

0 10 20 30 40 50 60 70 cô quay thổi khô h iệ u s u ấ t (% )

Khảo sát các các quy trình chiết tách Dichlorvos trong cá tra và trong nước bằng sắc kí khí ghép với đầu dò bắt giữ điện tử (GC-ECD)

nước bằng sắc kí khí ghép với đầu dò bắt giữ điện tử (GC-ECD)

Kết quả phân tích Hiệu suất thu hồi (%) Thêm chuẩn trước 62250

ACN:Acetone (1:1) Thêm chuẩn sau 63349 46,9

Ethyl acetate Thêm chuẩn sau 36512 81,6

Bảng 4.5 Hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu cá

Hình 4.12 đồ thị thể hiện hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu cá

Kết quả từ hình 4.2 chỉ ra rằng quy trình 1 sử dụng Acetonitril có hiệu suất thu hồi cao nhất so với hai quy trình còn lại, là Ethyl acetate và dung dịch Acetonitril-acetone (1:1) Do đó, quy trình 1 được lựa chọn để phân tích Dichlorvos trong mẫu cá.

Số lần lặp lại Kết quả phân tích (Area) Hiệu suất thu hồi TB

128200 Bảng 4.6 hiệu suất thu hồi của 3 quy trình chiết tách mẫu nước

Hình 4.13 minh họa hiệu suất thu hồi của ba quy trình chiết tách mẫu nước Kết quả cho thấy quy trình 1 đạt hiệu suất thu hồi cao nhất, điều này chứng tỏ tính hiệu quả của phương pháp này trong việc xử lý mẫu nước.

Ethyl acetate rửa giải qua cột SPE nên quy trình 1 được chọn làm quy trình phân tích Dichlorvos trên mẫu cá.

Xây dựng phương trình đường chuẩn

Hình 4.14: Đồ thị đường chuẩn cho mẫu cá

Diện tích peak đo được

11 0 nồng độ (ppb) tí n h h iệ u p e a k

Nồng độ dichlorvos chuẩn (ppb) Diện tích peak đo được

Hình 4.15: Đồ thị đường chuẩn cho mẫu nước y = 703.13x + 31617

0 50 100 150 200 nồng độ (ppb) d iệ n t íc h p e a k

Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước

Hình 4.16 đồ thị thể hiện sự tồn lưu của Dichlorvos trên mẫu cá theo thời gian thí nghiệm

Kết quả phân tích cho thấy sau khi gây nhiễm Dichlorvos với nồng độ 0,25 ppm và 0,5 ppm, mức tồn lưu của Dichlorvos trong mẫu cá rất cao Tuy nhiên, hàm lượng Dichlorvos giảm dần theo thời gian và đến ngày thứ 30 sau khi gây nhiễm, lượng Dichlorvos còn lại trên cá đã giảm đáng kể.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 n ồ n g đ ộ ( p p b ) bể 1 (0,25 ppm) bể 2 (0,25 ppm) bể 3 (0,25 ppm) bể 1 (0,5 ppm) bể 2 (0,5 ppm) bể 3 (0,5 ppm)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 n ồ n g đ ộ bể 1 (0,25 ppm) bể 2 (0,25 ppm) bể 3 (0,25 ppm) bể 1 (0,5 ppm) bể 2 (0,5 ppm) bể 3 (0,5 ppm)

Hình 4.17 đồ thị thể hiện sự tồn lưu của Dichlorvos trong mẫu nước theo thời gian thí nghiệm

Sau khi kết thúc quá trình gây nhiễm với nồng độ 0,25 ppm và 0,5 ppm, hình 17 cho thấy sự tồn lưu của Dichlorvos trong nước rất cao Tuy nhiên, nồng độ này giảm dần theo thời gian do quá trình thay nước, và đến ngày thứ 30 sau khi gây nhiễm, hàm lượng Dichlorvos còn lại trong nước đã dưới giới hạn phát hiện (