Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa hệ thống sắc ký khí sử dụ- 123docz.net

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa hệ thống sắc ký khí sử dụng đầu dò bắt giữ điện tử (GC-ECD) và các chu trình nhiệt khác nhau

3.2.1.1 Chu trình 1:

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260oC.

Nhiệt độ cột:

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian giữ ổn định (phút)

100 6

20 230 3

10 260 1

Tổng thời gian chạy: 19.50 phút Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270oC.

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút.

Split ratio: 3.0 3.2.1.2 Chu trình 2:

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260oC.

Nhiệt độ cột:

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian giữ ổn định (phút)

10 260 0 Tổng thời gian: 22 phút

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270oC.

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút.

Split ratio: 2.0 3.2.1.3 Chu trình 3:

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260oC.

Nhiệt độ cột:

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian giữ ổn định (phút)

80 4

10 260 3

Tổng thời gian: 25 phút

Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270oC.

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút.

Split ratio: 3.0 3.2.1.4 Chu trình 4:

Giới hạn phát hiện: 10ppb

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 260oC.

Nhiệt độ cột:

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian giữ ổn định (phút)

80 4

10 150 3

20 200 0

25 260 3

Tổng thời gian: 21.9 phút Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270oC.

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút.

Split ratio: 3.0 3.2.1.5 Chu trình 5:

Nhiệt độ nguồn tiêm mẫu (Spl): 250oC.

Nhiệt độ cột:

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ (oC) Thời gian giữ ổn định (phút)

80 1

10 150 2

10 180 2

25 260 1

Tổng thời gian: 19.20 phút Nhiệt độ đầu dò (ECD): 270oC.

Lưu lượng qua cột (column flow): 0.9 ml/phút.

Split ratio: 5.0

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu suất thu hồi của diện tích peak khi làm khô dung dịch chiết tách bằng hệ thống cô quay và thổi khí Nitơ

3.2.2.1 Mục đích:

Để tìm ra phương pháp làm khô dung dịch ly trích cho hiệu suất thu hồi tốt.

3.2.2.2 Chuẩn bị:

Dung dịch chuẩn được pha loãng trong dung môi tinh khiết.

3.2.2.3 Sơ đồ bố trí:

Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với 1 nhân tố

Nhân tố A là nhân tố phương pháp làm khô dung dịch ly trích gồm các nghiệm thức:

- A1: Phương pháp làm khô bằng thổi khí Nitơ - A2: Phương pháp làm khô bằng hệ thống cô quay 3.2.2.4 Tiến hành:

Hỗn hợp dung dịch chuẩn cho vào ống fancol nếu thổi khí nito, bỏ vô bình cầu quả lê nếu cô quay, thêm 5 ml Acetonitrile vào rồi đem làm khô bằng 2 hệ

Dung dịch chuẩn

Thêm 5ml Acetonitrile

A1 A2

Hoàn nguyên 1ml Hexan Hoàn nguyên 1ml Hexan

Loc-GC/ECD Loc-GC/ECD

thống. Hoàn lưu lại bằng n-hexan, lọc qua đầu col 0,2 m cho vào vial, hút 1

l phân tích GC/ECD.

3.2.2.5 Đánh giá:

Đánh giá diện tích peak và hiệu suất thu hồi.

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát các quy trình chiết tách Dichlorvos trong cá tra và mẫu nước bằng sắc ký khí sử dụng đầu dò bắt giữ điện tử

3.2.3.1 Trên mẫu cá:

a. Quy trình chiết tách 1:

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách.

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch acetonitrile (ACN). Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng với chloroform. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45C.

Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất 15 g mẫu cá. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng, mẫu cá đã được rã đông hoàn toàn.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống falcon 15 ml. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống falcon 15 ml. Thêm 50 l dung dịch chuẩn Dichlorvos nồng độ 1 ppm. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Ly trích Dichlorvos

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml.

- Thêm vào ống nghiệm 5 ml acetonitril. Khuấy mạnh bằng máy lắc, vortex khoảng 1 phút, rồi lắc bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch trong, cho vào ống nghiệm ly tâm nhựa 50 ml khác thật sạch.

- Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitrile, Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch

trong cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ.

- Thêm vào ống falcon 50 ml trên 5ml chloroform và 5ml nước cất, sao đó vortex khoảng 1 phút, để yên khoảng 5 phút.

- Dung dịch tách 2 lớp, hút lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml, sau đó đem cô quay đến khô.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.3:Quy trình chiết tách mẫu cá 1 Thêm 5ml Acetonitril

Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, 25oC)

Dịch chiết cho vào ống Falcon 50 ml Xác thịt

Dịch chiết (lần 2)

Hoàn nguyên bằng 1ml n-Hexan Lọc qua đầu col 0.2àm cho vào Vial

Hỳt 1àl phõn tớch GC Vortex 1 phút Cô quay chân không đến khô

Thêm vào ống Falcon 5 ml Chloroform và 5 ml H2O

Vortex 1 phút Để yên tách lớp Hút lấy lớp dưới cho

vào bình quả cầu 100ml Thêm 5 ml acetonitril

Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút,

Cân 2 g mẫu cá đã nghiền đồng nhất

Xác thịt Bỏ

Hỗn hợp tách 2 lớp

b. Quy trình chiết tách 2

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách.

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch đệm acetone – acetonitrile (1:1). Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45 C. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Chuẫn bị mẫu: Nghiền đồng nhất ít nhất 15 g mẫu. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng mẫu cá phải được rã đông hoàn toàn.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: Cân 3 g mẫu trắng đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Thêm 50 l dung dịch chuẩn Dichlorvos nồng độ 1 ppm. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Ly trích Dichlorvos

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml.

- Thêm vào ống nghiệm 5 ml acetonitril : acetone (1:1). Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc ngang bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu quả lê 100ml thật sạch.

- Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitril : acetone (1:1), Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc ngang bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch trong cho vào bình cầu chứa dịch chiết ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ.

- Sau đó đem bình cầu cô quay đến khô ở 45oC.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.4:Quy trình chiết tách mẫu cá 2 c. Quy trình chiết tách 3

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch Ethyl acetate. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45 C.

Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 3 g mẫu đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm nhựa 15 ml. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Thêm 5ml Acetoitril : Acetone (1:1) Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, 25oC)

Dịch chiết cho vào bình cầu 100 ml Xác thịt

Dịch chiết (lần 2)

Hoàn nguyên bằng 1ml n-Hexan Lọc qua đầu col 0.2àm cho vào Vial

Hỳt 1àl phõn tớch GC Vortex 1 phút Cô quay chân không đến khô Thêm 5 ml Acetonitril : Acetone

Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút,

Cân 2 g cá đã nghiến đồng nhất

Xác thịt Bỏ

Hỗn hợp tách 2 lớp

Ly trích Dichlorvos

- Cân thật chính xác 3 g mẫu cá đã được nghiền đồng nhất vào ống nghiệm ly tâm bằng nhựa có nấp đậy 15 ml.

- Thêm vào ống nghiệm 5 ml ethyl acetate. Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc ngang bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu quả lê 100ml thật sạch.

- Phần cặn còn lại được thêm tiếp 5 ml ethyl acetate, Khuấy mạnh bằng máy lắc vortex khoảng 1 phút, rồi lắc ngang bằng máy với vận tốc 300 lần/phút khoảng 20 phút. Tiếp theo đem ly tâm 5000 rpm trong 20 phút. Thu lấy dịch trong cho vào bình cầu chứa dịch chiết ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ.

- Sau đó đem cô quay đến khô ở 45oC.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.5:Quy trình chiết tách mẫu cá 3 3.2.3.2 Trên mẫu nước:

a. Quy trình chiết tách 1

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi nước bằng Ethyl acetate.

Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45C. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Chuẫn bị mẫu: Mẫu nước được lọc qua giấy lọc. Bảo quản mẫu trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng, mẫu nước đã được rã đông hoàn toàn.

Chuẩn bị mẫu chiết tách: hút 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào bình có van xả. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Thêm 5ml Ethyl acetate Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút, 25oC)

Dịch chiết cho vào bình cầu 100 ml Xác thịt

Dịch chiết (lần 2)

Hoàn nguyên bằng 1ml Hexan Lọc qua đầu col 0.2àm cho vào Vial

Hỳt 1àl phõn tớch GC Vortex 1 phút Cô quay chân không đến khô Thêm 5 ml Ethyl acetate

Vortex 1 phút

Lắc ngang 20 phút (300 lần/phút) Ly tâm 20 phút (5000 vòng/phút,

Cân 2 g cá đã nghiến đồng nhất

Xác thịt Bỏ

Hỗn hợp tách 2 lớp

Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: hút 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào bình có van xả. Thêm 50 l dung dịch chuẩn Dichlorvos nồng độ 1 ppm. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Ly trích Dichlorvos

- Hút chính xác 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào bình có van xả 250 ml.

- Thêm vào bình 2 ml diethylen glycol. Lắc mạnh, sao đó thêm 5 ml ethyl acetate, lắc mạnh. Tiếp tục thêm 5 ml Chloroform lắc mạnh, để yên.

Dung dịch tách thành 2 lớp. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu 100 ml thật sạch.

- Phần còn lại được thêm tiếp 5 ml ethyl acetate, lắc mạnh, sao đó thêm tiếp 5 ml chloroform lắc mạnh, để yên. Dung dịch tách thành 2 lớp. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu 100 ml ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ.

-Sau đó đem cô quay đến khô.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hình 3.6:Quy trình chiết tách mẫu nước 1 b. Quy trình chiết tách 2

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi nước bằng Acetonitril. Dịch trích được làm sạch bằng qui trình chiết lỏng - lỏng. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45C. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0.2 m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Chuẫn bị mẫu: Mẫu nước được lọc qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch trong tủ đông (-20 oC) đến khi sử dụng. Khi sử dụng, mẫu nước đã được rã đông hoàn toàn.

Lấy 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc

Thêm vào 2 ml DEG Thêm 5 ml ethyl acetate Thêm 5 ml chloroform

Lắc đều để yên tách lớp

Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml Thêm tiếp vào bình (250 ml)

5 ml ethyl acetate và 5 ml chloroform Lắc điều để yên tách lớp

Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml ban đầu Cô quay chân không ở 45oC

Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Lọc

Hỳt 1 àl phõn tớch GC-ECD Vortex

250 ml

100 ml

Chuẩn bị mẫu phân tích: hút 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào bình có van xả. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Ly trích Dichlorvos

- Hút chính xác 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào bình có van xả 250 ml.

- Thêm vào bình 2 ml diethylen glycol. Lắc mạnh, sao đó thêm 5 ml Acetonitril, lắc mạnh. Tiếp tục thêm 5 ml Chloroform lắc mạnh, để yên. Dung dịch tách thành 2 lớp. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu 100 ml thật sạch.

- Phần còn lại được thêm tiếp 5 ml acetonitril, lắc mạnh, sao đó thêm tiếp 5 ml chloroform lắc mạnh để yên. Dung dịch tách thành 2 lớp. Thu lấy dịch trong, cho vào bình cầu 100 ml ban đầu. Phần cặn sau cùng được bỏ.

-Sau đó đem cô quay đến khô.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos trong nước

Hình 3.7: Quy trình chiết tách mẫu nước 2 c. Quy trình chiết tách 3

Nguyên tắc và các thao tác thực hiện chiết tách

Nguyên tắc: Dichlorvos được ly trích khỏi sản phẩm thủy sản bằng dung dịch Ethyl acetate. Dịch chiết được làm sạch bằng cột SPE. Dịch chiết sau đó được cô quay đến khô ở 45 C. Dịch chiết thu được cho qua đầu lọc 0,2

m rồi đem phân tích bằng GC-ECD.

Lấy 50 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc

Thêm vào 2 ml DEG Thêm 5 ml Acetonitril Thêm 5 ml chloroform

Lắc đều để yên tách lớp

Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml Thêm tiếp vào bình (250 ml)

5 ml Acetonitril và 5 ml chloroform Lắc điều để yên tách lớp

Lấy lớp dưới cho vào bình cầu 100 ml ban đầu Cô quay chân không ở 45oC

Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Lọc

Hỳt 1 àl phõn tớch GC-ECD Vortex

250 ml

100 ml

Chuẩn bị mẫu phân tích: hút 20 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào ống falcon 15 ml. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Chuẩn bị mẫu kiểm soát có thêm chuẩn: hút 20 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho vào ống falcon 15 ml. Thêm 50 l dung dịch chuẩn Dichlorvos 1 ppm. Tiến hành ly trích Dichlorvos.

Ly trích Dichlorvos

- Hút chính xác 20 ml mẫu nước đã được lọc qua giấy lọc cho qua cột SPE.

Trước khi cho mẫu nước qua cột SPE, cột SPE được hoạt hóa bằng 2 ml MeOH và 2 ml nước cất.

Sao khi cho mẫu nước qua cột SPE cho tiếp 2 ml nước cất.

Cuối cùng cho qua Cột SPE 7 ml Ethyl acetate để rửa giải chất phân tích, dịch trích cho vào bình cầu 100 ml

-Sau đó đem cô quay đến khô.

- Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan. Chú ý lắc đều bình cầu quả lê để hòa tan hết cặn trong bình.

- Lọc dịch thu được qua lọc 0,2 m vào vial GC và đem phân tích.

Tóm tắt quá trình ly trích Dichlorvos

Hút 20 ml nước

Qua cột SPE (C18)

(trước đó, cột SPE được hoạt hóa bằng 2 ml MeOH và 2 ml H2O) Cho qua cột SPE 2 ml H2O

Rửa giải Dichlovos từ SPE bằng 7 ml Ethyl acetate Cô quay chân không ở 45oC

Hoàn nguyên bằng 1 ml n-hexan Lọc qua đầu col 0.2 àm

Đo GC-ECD