Do việc sử dụng TCs trong ngành thủy sản có nhiều điều kiện thuận lợi như: khả năng ức chế và tiêu diệt được nhiều vi khuẩn gây bệnh, khả năng đào thải nhanh, giá trên thị trường không quá cao…, nên nó được sử dụng ở rất nhiều trong lĩnh vực nhân giống thủy sản và nuôi trồng thủy sản từ nhiều năm nay. Vì vậy vấn đề lạm dụng TCs trong thủy sản là rất đáng quan tâm.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được phát triển để kiểm soát dư lượng tồn lưu của TCs trong thủy sản và các sản phẩm chế biến từ thủy sản.
Theo Quyết định 10/2002/QĐ-BTS về tiêu chuẩn cấp ngành do Bộ trưởng Bộ Thủy sản ban hành ngày 08 tháng 04 năm 2002 kèm theo tiêu chuẩn 28 TCN 177: 2002: hàm lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao (gọi tắt là HPLC), giới hạn phỏt hiện (LOD) của phương phỏp này là 10 àg/kg. Tiờu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp số 995.09 Chlortetracyclin, Oxytetracyclin và Tetracyclin trong thành phần ăn được của động vật, quyển I, chương 23, trang 19 – 23 (23.1.17), phương pháp chuẩn của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (AOAC) ban hành năm 1997.
Kháng sinh TCs trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng dung dịch đệm tại PH = 4, dung dịch đệm được sử dụng trong phương pháp này là McIlvaine – EDTA.
Cột sắc ký: cột pha đảo C18, LxD: 150x4.6 mm, kớch thước hạt 5 àm, nhiệt độ cột: 350C. Thành phần pha động là hỗn hợp dung dịch ammonium acetate 0.05 M (pH = 3.0) : Acetonitrile theo tỉ lệ thể tích là 80 : 20.
Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo Sep - Pak Cartrige C18. Hàm lượng TC, OTC, CTC có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò UV tại bước sóng 350 nm theo phương pháp ngoại chuẩn, độ lặp lại 2 lần, độ thu hồi được cho mỗi lần chạy mẫu phải lớn hơn 80 %. Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo
11
chiều cao peak sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Ðường chuẩn đối với mỗi kháng sinh phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,995.
Bên cạnh phương pháp qui định trên thì trên thế giới hiện nay cũng phát triển nhiều phương pháp để xác định dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong sản phẩm thủy sản. Sau đây xin giới thiệu một vài phương pháp:
2.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng Tetracyclin trong mẫu tôm và sữa nguyên chất bằng cách sử dụng sắc ký lỏng đầu dò UV và xác nhận lại bằng đầu dò khối phổ (Andersen et al., 2004)
Hai phương pháp đã được phát triển để xác định đồng thời TC, OTC, và CTC ở tôm và trong sữa nguyên chất. Phương pháp này được phát triển để đơn giản hóa việc chiết mẫu và các bước làm sạch mẫu được tiến hành nhanh chóng và thuận tiện cho việc kiểm tra mẫu một cách thường xuyên. Trong phương pháp này thì hai mẫu tôm và sữa nguyên chất được chiết xuất một cách đơn giản bằng acid succinic trên cột pha rắn copolymeric (SPE).
Cột sắc ký được sử dụng là cột MacMod Hydrobond PS C8, 5 àm, 4.6 mm, với một đầu lọc (0,5 àm) được sử dụng phõn tớch cả 2 mẫu. Dung dịch pha động là 75% A + 18% acetonitrile + 7% methanol, trong đó A gồm acid oxalic 0.01 M trong mẫu sữa và acid formic 0.1% trong mẫu tôm.
Tất cả cỏc dung mụi pha động được lọc qua lớp màng PVDF 0.45 àm.
Tốc độ dòng chảy là 1mL/phút, ở nhiệt độ là 350C, lượng mẫu được sử dụng là 400 àl. Độ hấp thụ ở bước súng là 370 nm việc định lượng của của ba loại tetracyclin trong mẫu tôm và sữa ở nồng độ là 50, 100, 200, 300, và 400 ng/g.
Hiệu suất thu hồi lớn hơn 75% với RSD nhỏ hơn 10%. Hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải bằng 0,9975. Giới hạn định lượng (LOQ) được ước tính trong khoảng 50 ng/g đối với cả hai mẫu tôm và sữa. Kết quả dư lượng kháng sinh của nhóm tetracyclin bằng hệ thống LC-MS-MS ở mẫu tôm là 25- 400 ng/g và mẫu sữa là 5-30 ng/g.
2.2.2 Phương pháp 2: Phân tích dư lượng kháng sinh nhóm Tetracyclin trong cơ thịt lợn bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép phổ khối lượng (Cherlet et al., 2003)
Theo phương pháp này giới thiệu thì nhóm kháng sinh tetracyclin bao gồm 4 loại: Tetracyclin (TC), Chlortetracyclin (CTC), Oxytetracyclin (OTC) và Doxycyclin (DOX) được sử dụng rất nhiều trong thuốc thú y vì khả năng kháng khuẩn phổ rộng và chi phí sử dụng thấp. Do đó nghiên cứu này được
12
phát triển nhằm mục đích xác định dư lượng tồn lưu của nhóm kháng sinh tetracyclin trong cơ thịt lợn.
Trong phương pháp phân tích này thì việc phân tích nhóm kháng sinh tetracyclin có sự có mặt của chất nội chuẩn Demethylchlortetracyclin (DMCTC). Cũng trong phương pháp thì dịch chiết được sử dụng là sodium succinate tại pH = 4.0, tiếp theo thì dịch chiết được làm sạch protein bằng dung dịch Acid trichloroacetic và sau đó được lọc qua màng lọc. Dịch chiết được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột tách chiết pha đảo HLB và sau đó được đưa đi phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS.
Cột sắc ký được sử dụng là pha cột đảo cao phõn tử PLRP-S (8 àm, 250 mm x 4.6 mm i.d.), kết hợp với một cột (5 mm x 3 mm i.d.) từ phòng thí nghiệm (shropshire, UK), nhiệt độ cột được duy trì ở 600C. Pha động A gồm acid oxalic 0,001 M, acid formic 0,5% (v/v) và THF 0,3% (v/v) trong nước, pha động B là THF. Pha động chạy trong hệ thống LC với tốc độ dòng chảy là 1mL/phút trong thời gian 40 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là từ 0,5 – 4,5 ng/g, giới hạn định lượng (LOQ) bằng một nữa MRLs tương ứng đối với mỗi mẫu phân tích là hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) lớn hơn 0,99, RSD nhỏ hơn 10%.
Dư lượng tối đa (MRL) của phương pháp này được xác nhận là phù hợp với yêu cầu của EC và dựa trên quyết định số 93/256/EEC thì các giá trị MRL tương ứng như sau: 100 ng/g đối với cơ thịt; 300 ng/g đối với da, mỡ và gan; 600 ng/g đối với thận.
2.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ kết hợp với ion hóa bằng áp suất khí quyển (APCI LC-MS/MS) (Nakazawa et al., 1999)
Phương pháp này được xây dựng nhằm mục đích xác định một cách chính xác nhất dư lượng kháng sinh TCs bằng hệ thống APCI LC-MS/MS (Atmospheric pressure chemical ionization liquid chromatography mass spectrometry). Bằng cách thiết lập nhiệt độ đầu dò ống phun đến 4750C. Pha động là acid oxalic được sử dụng mà không gây ảnh hưởng cản trở đến hệ thống APCI. Ở nhiệt độ cao thì acid oxalic bị phân hủy thành Cacbon dioxit và nước.
Chất nội chuẩn được sử dụng là Demethylchlortetracyclin (DMCTC) và nó được xem như là chất nội chuẩn hiệu quả nhất trong việc xác định dư lượng kháng sinh tetracyclin trong các loại thực phẩm khác nhau.
13
Cột sắc ký được sử dụng là cột Bakerbond C8 (5 àm, 250x4,6 mm I.D., J.T. Baker chemical, Phillipsburg) ở nhiệt độ 300C. Thành phần pha động gồm Methanol – Acetonitrile – dung dịch acid oxalic 5mM (18:27:55, v/v/v). Tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút và bước sóng sử dụng là 350 nm.
Độ thu hồi của kháng sinh tetracyclin trong các sản phẩm khác nhau như thịt động vật, mật ong, trứng, cá ở các nồng độ là 0,05; 0,1; 0,5 ppm trung bình từ 60,1 – 88,9 % và RSD trong khoảng từ 1,2 – 8,7 %. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 0,001 ppm cho OTC và TC; 0,004 ppm cho CTC;
0,002 ppm cho DOX.