3.2 Vật liệu và phương pháp
3.2.2 Phương pháp thí nghiệm
3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Tối ưu hóa các thông số hệ thống sắc ký hiệu năng cao cho phân tích nhóm kháng sinh Tetracycline; Doxycycline và khảo sát qui trình chiết tách
a. Chạy chuẩn trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Các dịch chuẩn đã được chuẩn bị (ở mục 3.2.1.2) được pha loãng đạt nồng độ lần lượt là 100ppb; 200ppb; 500ppb; 1ppm (Pha loãng chất chuẩn bằng methanol) sẽ được tiến hành chạy trên hệ thống HPLC với nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch chuẩn được tiêm lặp lại 2 lần nhằm xác định thời gian lưu, diện tích và chiều cao peak.
Tiến hành phân tích nhóm kháng sinh TCs trong cùng một điều kiện:
bước sóng, pha động, cột phân tích, thời gian phân tích.
18
b. Tìm bước sóng thích hợp và điều kiện dung môi thích hợp của pha động (Tỉ lệ dung môi A& B, sự thay đổi tỉ lệ dung môi A& B, lưu lượng của dung môi) của quá trình phân tích
Tìm bước sóng phân tích
Cố định tốc độ dòng và tỉ lệ dung môi của pha động (Isopratic). Tiến hành thay đổi bước sóng đến khi nhận được tín hiệu của peak tốt nhất.
Tiếp theo, cố định tốc độ dòng nhưng thay đổi tỉ lệ dung môi pha động (Gradien) và cũng tiến hành thay đổi bước sóng đến khi nhận được tín hiệu peak tốt nhất.
Tìm điều kiện dung môi
Cố định bước sóng, cố định tỉ lệ dung môi A và B và thay đổi độ dòng của pha động.
Cố định bước sóng, thay đổi tỉ lệ dung môi A và B và thay đổi độ dòng của pha động
c. Tìm điều kiện cột phân tích
Thí nghiệm được thực hiện với 2 cột sắc ký:
Synersi C18 (4àm, 2.00 x 50 mm)
Gemini C18 (5àm, 3.00 x 150mm)
Trong thí nghiệm này thì các chất chuẩn được sử dụng tại các nồng độ tăng dần từ thấp đến cao. Các điều kiện phân tích đều được cố định.
d. Khảo sát qui trình chiết tách kháng sinh nhóm Tetracycline trong nguyên liệu cá tra ở điều kiện phòng thí nghiệm Dinh dưỡng và Chế biến thủy sản
Qui trình chiết tách được tham khảo từ Tiêu chuẩn ngành số 28 TCN 177 : 2002 : Hàm lượng kháng sinh nhóm tetracyclin trong sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao theo quyết định số 10/2002/QÐ- BTS của bộ Thủy Sản
Mục đích
Tối ưu hóa các điều kiện phân tích kháng sinh tetracycline trong sản phẩm thủy sản ở điều kiện phòng thí nghiệm dinh dưỡng và chế biến thủy sản
19
Phương pháp gây nhiễm
Tiến hành gây nhiễm bằng cách cho trực tiếp chất kháng sinh Doxycycline với nồng độ 500 ppb vào mẫu cá, sau khi chuẩn bị mẫu xong tiến hành phân tích mẫu trên HPLC.
Hiệu suất thu hồi
Công thức tính hiệu suất thu hồi:
100
1 2
Trong đó:
H: Hiệu suất thu hồi (%)
N1: Nồng độ ban đầu của chất phõn tớch (àg/mL) N2: Nồng độ lỳc sau của chất phõn tớch (àg/mL)
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm bố trí với 1 nhân tố lặp lại 2 lần
Sơ đồ bố trí thí ngiệm
Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Mẫu cá tra nguyên liệu (Cá tra fillet) được mua từ siêu thị Metro Cần Thơ (Địa chỉ: Lộ 91B nối dài – Phường Hưng Lợi – Quận Ninh Kiều – TP.
Cần Thơ) được xay nhuyễn và bảo quản ở nhiệt độ -200C.
Cá nguyên liệu
Chuẩn bị mẫu
Lây nhiễm
Q1 Q2
Phân tích trên HPLC
20
Tiến hành thí nghiệm
Mẫu sau khi chuẩn bị xong sẽ được gây nhiễm với Doxycycline ở nồng độ biết trước (250ppb), để yên trong 5 phút và sau đó sẽ được tiến hành khảo sát 2 qui trình để xác định hiệu suất thu hồi.
Qui trình chiết tách
Chuẩn bị hóa chất
Chuẩn bị dung dịch đệm McIlvaine (pH = 4.0 ± 0.05)
Dung dịch A: hòa tan 28,4 g Na2HPO4 khan bằng nước cất trong bình định mức có dung tích la 1000 mL. Định mức tới vạch.
Dung dịch B: hòa tan 21,0 g acid xitric bằng nước cất trong bình định mức. Định mức tới vạch
Cho từ từ 625 mL dung dịch A vào 1000 mL B. Điều chỉnh pH = 4.0 (±
0.05) bằng cách cho từng giọt NaOH 0,1 M (Sử dụng pH kế để xác định pH).
Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị dung dịch McIlvaine – EDTA buffer
Hòa tan 60,5 g EDTA vào 1625 mL dung dịch McIlvaine.
Chú ý: Dung dịch bền trong vòng 1 tuần ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị dung môi rửa giải trong chiết tách pha rắn SPE
Hòa tan 1,26 g acid oxalic bằng methanol trong bình định mức 1000 mL. Định mức tới vạch
Tách chiết mẫu
Qui trình chiết tách
1. Cân 2,00 g (±0,05) mẫu cá đã được xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 15mL thứ 1. Thêm 7 mL dung dịch đệm McIlvaine – EDTA vào ống ly tâm.
Sau đó ta đem mẫu đi vortex trong 1 phút; lắc ngang trong 15 phút, tốc độ 300 vòng/phút; ly tâm 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C.
2. Gạn dịch trong ống thứ 1 cho vào ống ly tâm thứ 2. Cho thêm 7 mL dung dịch đệm McIlvaine – EDTA ống thứ 1. Tiếp tục đem mẫu đi vortex trong 1 phút; lắc ngang trong 15 phút, tốc độ 300 vòng/phút; ly tâm 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C rồi lại gạn dịch chiết cho vào ống ly tâm thứ 2.
3. Đem ống ly tâm thứ 2 (Chứa dịch chiết 2 lần) đi ly tâm 15 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 50C.
21
Làm sạch mẫu
4. Hoạt hóa cột Sep – Pak C18 bằng 6 mL methanol và 6 mL nước cất.
loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
5. Cho dịch chiết trong ống ly tâm thứ 2 vào cột, loại bỏ dịch chiết chảy qua cột.
Chú ý: Không được để cho cột bị khô giữa 2 giai đoạn chuẩn bị cột và làm sạch dịch chiết, điều chỉnh cho dịch ra khỏi cột thành từng giọt.
6. Cho 5 mL nước cất chảy qua cột, loại bỏ dung dịch chảy qua cột.
Làm khô cột bằng không khí sạch trong vòng 2 phút.
7. Rửa giải các chất kháng sinh nhóm Tetracyclin bằng cách cho 5mL Acid oxalic – Methanol chảy qua cột, thu dịch ra khỏi cột vào ống nghiệm thủy tinh 10 mL.
8. Tiến hành phân tích dịch thu được bằng hệ thống HPLC
22
Sơ đồ tóm tắt qui trình chiết tách
Hình 3.2 Sơ đồ chiết tách qui trình 1 Hỗn hợp tách 2 lớp
- Thêm 7 mL dung dịch đệm McIlvaine – EDTA
- Lắc ngang bằng máy lắc trong 15 phút.
- Ly tâm 15 phút, tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C Ống nghiệm ly
tâm 15 mL
Cân 2 g đã nghiền đồng nhất
Dịch chiết (lần 1) Hỗn hợp tách 2 lớp
Dịch chiết (lần 2) Ly tâm 15 phút, tốc độ 4000 vòng/phút, t0 = 50C Xác thịt - Thêm 7 ml dung dịch đệm
McIlvaine – EDTA
- Lắc ngang bằng máy lắc trong 15 phút
- Ly tâm 15 phút
6 mL metanol 6 mL nước cất
Dịch chiết chảy qua cột, bị loại bỏ
Dịch chiết (2 lần)
Ống thủy tinh 10mL
Làm khô cột bằng không khí sạch trong 2 phút
5 mL nước cất 5,0 mL dung dịch acid oxalic – methanol
Phân tích trên HPLC Hoạt hóa cột SPE:
Xác thịt Loại bỏ
23
3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh Doxycycline trên nguyên liệu cá tra
a. Xác định thời gian tồn lưu của kháng sinh Doxycycline trong mẫu thức ăn thí nghiệm
Thức ăn thí nghiệm
Thức ăn dùng trong thí nghiệm là loại thức ăn công nghiệp 30% CP được bổ sung chất kháng sinh Doxycycline. Thuốc được sử dụng trong thí nghiệm là Vimefloro FDP đóng chai, dạng dịch lỏng, với thể tích thực là 250mL của Vemedim Corporation (Công ty Cổ phần SXKD Vật tư & Thuốc thú y). Thành phần của thuốc gồm có: Florfenicol 25g; Doxycyline 12,5g;
Propylen glycol 50g và Exp.qsp 250mL.
Thuốc kháng sinh được bổ sung vào thức ăn bằng cách sử dụng pipete hỳt chớnh xỏc 100àL dung dịch thuốc chứa khỏng sinh và hũa tan thuốc bằng nước cất, sau đó phun đều lên 0,1 kg thức ăn. Thức ăn phối trộn chỉ sử dụng trong ngày.
Mục đích
Xác định hàm lượng kháng sinh Doxycyline có trong thức ăn.
Phương pháp tiến hành
Thu mẫu phân tích
Mẫu thức ăn được thu lại sau khi phối trộn kháng sinh sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -200C trước khi tiến hành phân tích.
Qui trình phân tích
Mẫu thức ăn thí nghiệm sẽ được chiết tách và làm sạch mẫu dựa trên qui trình chiết tách của mục 3.2.2.2 sau đó tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC.
b. Xác định thời gian tồn lưu kháng sinh Doxycycline trong nguyên liệu cá tra
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được được tiến hành trên 3 bể cá 500 L, mỗi bể chứa 50 con, được sục khí liên tục, khối lượng mỗi con khoảng 20 g. Cá thí nghiệm được mua về và được nuôi trong bể 2 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm.
24
Tiến hành thí nghiệm
Cho cá ăn thức ăn có chứa kháng sinh mỗi ngày 2 lần trong 7 ngày liên tục, sau đó cho cá ăn thức ăn không chứa kháng sinh trong các ngày tiếp theo.
Thu mẫu
Thu mẫu các yếu tố môi trường: Nhiệt độ, oxy, pH mỗi ngày 2 lần trong suốt các ngày cho cá ăn thức ăn chứa kháng sinh và định kỳ vào các ngày thu mẫu.
Thu mẫu cơ thịt cá để phân tích tồn lưu kháng sinh: Thu mẫu cá (5con/1lần/1bể) vào các khoảng thời gian như sau:
Tại vị trí 0* là ngày thu mẫu trước khi cho ăn thức ăn chứa kháng sinh Hình 3.4 Sơ đồ thu mẫu
Chuẩn bị mẫu cá phân tích
Cá sau khi thu mẫu sẽ tiến hành fillet, cắt nhỏ, xay nhuyễn cho vào ống ly tâm 15 mL và bảo quản ở nhiệt độ -200C trước khi phân tích.