Nghiên cứu, đánh giá chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh

Nhưng ở nước ta hiện nay kỹ thuật khai thác tinh trực tiếp từ mào tinh có được áp dụng rộng rãi hay không và chất lượng của tinh trùng có đảm bảo yêu cầu kỹ thuật trong thụ tinh hay không

Trong những năm qua, việc ứng dụng khoa học công nghệ vào thực tiễnsản xuất bước đầu đã thu được những thành tựu quan trọng, chẳng hạn trongcông nghệ sinh học động vật: thụ tinh nhân tạo, cấy chuyển phôi, xác định giớitính phôi, động vật chuyển gen, đông lạnh tế bào và phôi, nhân bản động vật…

Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo đã có từ lâu đời, trong đó kỹ thuật thụ tinhnhân tạo trên lợn đã mang lại hiệu quả cao cho ngành sản xuất giống cũngnhư chăn nuôi ở Việt Nam và trên thế giới Tuy vậy còn nhiều vấn đề tồn tạicần được tiếp tục nghiên cứu, đặc biệt là vấn đề khai thác và bảo tồn tinhdịch Việc khai thác tinh ở giai đoạn thích hợp sẽ thu được tinh dịch có sốlượng cũng như chất lượng tốt, còn công tác bảo tồn tinh dịch vừa giữ được

tinh trùng sống lâu, vừa dễ ứng dụng vào sản xuất.

Đông lạnh tinh dịch gia súc để kéo dài thời gian sống của tinh trùng làmột thành tựu kỳ diệu của kỹ thuật TTNT nói riêng và của sinh học lạnh nóichung Bằng kỹ thuật đông lạnh, người ta có thể giữ tinh trùng sống hàngchục năm, tiến tới việc thành lập ngân hàng gen cho mỗi quốc gia

Với mục đích mang lại hiệu quả và năng suất cao cũng như nhằm khắcphục những hạn chế trong kỹ thuật khai thác tinh truyền thống, kỹ thuật thulấy tinh trực tiếp từ bao dịch hoàn đã góp phần đáp ứng đáng kể nhu cầu củathời đại

Nhưng ở nước ta hiện nay kỹ thuật khai thác tinh trực tiếp từ mào tinh

có được áp dụng rộng rãi hay không và chất lượng của tinh trùng có đảm bảoyêu cầu kỹ thuật trong thụ tinh hay không Nhằm mục đích giải quyết những

khúc mắc trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu, đánh giá

chất lượng tinh trùng được lấy từ mào tinh sau bảo quản đông lạnh”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Trên cơ sở nghiên cứu một số đặc tính sinh học của tinh dịch lợn nhằm:

- Khảo sát, đánh giá chất lượng tinh lợn được mổ lấy từ mào tinh saubảo quản lạnh để phục vụ TTON

- Từ những kết quả nghiên cứu có thể tìm ra được những ưu điểm vànhược điểm của phương pháp mới này để khác phục và nâng cao chất lượngtinh dịch, sư dụng tinh nguồn gốc mào tinh trong CNSS

1.3 Ý nghĩa đề tài

Đề tài mang ý nghĩa khoa học cũng như thực tiễn,việc nghiên cứu khảosát, đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn bảo quản ở -196oC trongni-tơ lỏng giúp cho việc đánh giá bước đầu hiệu quả cuả phương pháp thu lấytinh dịch từ mào tinh, đông lạnh tinh lợn, cung cấp nguyên liệu cho TTON,tiến tới thành lập ngân hang tinh và phôi động vật đông lạnh, chủ động trong

nghiên cứu các kỹ thuật in vitro.

Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Các phương pháp bảo quản tinh lợn

2.1.1 Tình hình đông lạnh tinh trùng

Phương pháp TTNT đã có từ những nằm 1776 do tu sĩ LazzaroSpallanzani áp dụng cho thú vật và đã thành công mỹ mãn Ngày nay, ở Mỹ

có khoảng 95% súc vật được TTNT, trong đó đối với lợn khoảng 50%,và đạtđược tỷ lệ 80% lợn đẻ 10 con trên lứa, nhưng công nghệ sinh sản chỉ thực sựbắt phát triển những năm 1950 khi khoa học thành công trong việc đông lạnhtinh dịch bò ở -79oC(trong CO2) để thụ tinh với bò cái (Polge và Rowson,1952) Hai tác giả người Anh này dã tìm ra Glyxerin để có thể đông lạnh vĩnhcửu tinh trùng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)

Có thể hiểu: bảo quản lạnh là quá trình mà các tế bào hoặc toàn bộ môđược bảo quản ở nhiệt độ lạnh âm sâu, như 77K hay -196 oC(điểm sôi củaNitơ lỏng) Ở nhiệt độ đó, mọi hoạt động sinh học (trong đó có phản ứng sinhhóa) dẫn đến làm chết tế bào đều ngừng lại

Thay đổi chủ yếu trong việc dự trữ tinh trùng xảy ra vào những năm

1950 khi chuyển từ dự trữ trong CO2 rắn ở -79 oC sang dự trữ trong nitơ lỏng

ở -196 oC

Năm 1960, người ta đã thành công trong việc bảo quản tinh dịch trongnitơ ở -196 oC có thể giữ khả năng thụ thai của tinh trùng hàng chục năm sau.Kết quả này đã tạo tiền đề cho những nghiên cứu về đông lạnh tinh sau này,trong đó những tổng kết về quả về bảo quản lạnh tinh trùng các loài động vật,bao gồm việc mô tả kỹ thuật và kết quả thụ tinh đối với trâu bò (Vishwanath

va Shannon, 2000), cừu (Salamon và Maxel, 2000), lợn (Jonhson vcs,2000),

dê (Seboeuf vcs, 2000), ngựa (Ecot vsc, 2000) gần đây đã được xuất bản.

Sự đông lạnh tinh trùng đã được thực hiện cách đây hơn 30 năm và kếtquả được thể hiện ở con cháu đang sống của chúng sau khi tiến hành thụ tinh

ở voi Fallope, tuy nhiên, kỹ thuật đông lạnh hiện nay vẫn đem lại sản lượngthấp vì sự dung nạp của tinh trùng khi đông lạnh là thấp Chúng ta biết là khảnăng xâm nhập vào trứng của cả tinh trùng tươi và tinh trùng đông lạnh- giảiđông là khác nhau phụ thuộc vào lợn đực được khai thác tinh Vì những lý dosinh lý học của tinh trùng nên khó khăn trong việc kiểm soát sản phẩm phụtrong quá trình bảo quản lạnh tinh trùng lợn Tuy nhiên, bảo quản lạnh tinhtrùng lợn là nguồn lực chính trong việc bảo tồn nguồn gen lợn

Theo K Kikuchi vcs (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu về khả năngthụ tinh ống nghiệm của tinh trùng lợn được khai thác từ mào tinh và đượcbảo quản lạnh ở 4oC

2.1.1.1 Cơ sở khoa học xây dựng môi trường pha loãng bảo tồn

Ivanov (1999) khẳng định: tinh thanh không tham gia thụ tinh mà chứcnăng sinh học của tinh thanh là nuôi dưỡng, hoạt hóa tinh trùng, hoạt hóađường sinh dục cái Ông cho rằng có thể thay thế tinh thanh bằng môi trườngnhân tạo và ý niệm này đã đặt nền móng cho việc điều chế, chế tạo môitrường pha loãng tinh dịch mà ngày nay sử dụng rất phổ biến

Một số đặc điểm lý hóa học cơ bản của tinh dịch chính là thể hiện đòihỏi về điều kiện sống của tinh trùng ngoài cơ thể Do vậy việc tổng hợp môitrường cần thỏa mãn tối ưu các yêu cầu cơ bản đó

2.1.1.2 Nguyên tắc cơ bản của MTPLBT tinh dịch lợn

- Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu

của tinh dịch

- pH của môi trường phải tương đương hoặc thấp hơn 1 chút so với pHtinh dịch

- Môi trường phải có năng lực đệm.

- Môi trường tổng hợp phải đảm bảo đầy đủ các chất dinh dưỡng cầnthiết cho sự sống và trao đổi của tinh trùng

- Môi trường phải có tỷ lệ các chất điện giải/ chất không điện giải thích hợp

- Tỷ trọng của môi trường phải tương đương tỷ trọng của tinh dịch

- Độ nhớt của môi trường phải tương đưng độ nhớt tinh dịch

- Môi trường phải đảm bảo vô trùng tuyệt đói

- Môi trường phải có điểm sôi, điểm đông đặc, điểm bốc hơi phải tươngđương hoặc thấp hơn môi trường tinh dịch

- Môi trường phải thả mãn tính kinh tế và thực tiễn nghĩa là giá thành rẻ

và dễ ứng dụng trong sản xuất

2.1.1.3 Các chất cấu tạo nên môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch

- Chất đường: cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng sống và vậnđộng, còn có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, tránh hiện tượng tinh trùng bị

Muối Trilon B (tên khác: EDTA-B2, complexon-3, Selecton II, Titon(Na2H2Y- , M = 372,24) nhờ muối này môi trường sống của tinh trùng trở nên

vô độc, kéo dài thời gian sống của tinh trùng TrilonB lần đầu tiên đượcVoloxievich (1962-1963) (Dương Đình Long, 1996) dung để bảo tồn tinhdịch lợn ở 0oC Cơ chế tác dụng của muối này: H2Y2- sẽ tạo phức càng cua với

các ion kim loại nặng Ca2+, Mg2+ trong tinh dịch, tác dụng như chất rửa sạchmôi trường.

- Chất kháng sinh: tập đoàn vi sinh vật phát triển rất nhanh trong tinhdịch làm thay đổi đặc điểm lý hóa môi trường sống của tinh trùng và cướpchất dinh dưỡng làm tinh trùng bị chết nhanh chóng Bổ sung chất kháng sinhvào môi trường là hết sức cần thiết Tuy nhiên, các chất kháng sinh đó về địnhtính và định lượng phải vô hại với tinh trùng Dựa vào cơ chế tác dụng và phổtác dụng của kháng sinh đối với các loại vi khuẩn, trong môi trường pha loãngbảo tồn tinh dịch lợn người ta thường bổ sung các chất kháng sinh penicillin,streptomycin, tetracycline… Hỗn hợp penicillin và streptomycin được sửdụng rộng rãi để bảo tồn tinh lỏng cũng như tinh đông lạnh

- Chất đông lạnh: Ở nhiệt độ thấp, quá trình sống và vận động, trao đổichất của tinh trùng bị ức chế nên kéo dài được thời gian sống của tinh trùngngoài cơ thể Song nhiệt độ thấp dễ làm tinh trùng bị sốc lạnh Nguyên sinhchất của đầu tinh trùng bị “thủy tinh hóa” làm cho chúng bị gãy cổ đứt đuôi

Để bảo tồn tinh dịch ở nhiệt độ thấp, hay bảo quản lạnh cần bổ sung vào môitrường chất chống lạnh cho tinh trùng

Lòng đỏ trứng gà: chứa nhiều Lecitine (7%) là 1 lipoit có tác dụng bảo

vệ tinh trùng, chống lại hiện tượng sốc lạnh, và cũng để tăng độ nhớt, tăng độdinh dưỡng cho môi trường Lecitine có khả năng chống lạnh cho tinh trùng

là do cấu trúc phần tử của nó có 1 phần ưa nước và 1 phần kị nước, phần ưanước bị hydrat hóa, phần kị nước không bị hydrat hóa và liên kết với nhau tạothành 1 hệ lưới vi thể trong dung dịch làm giảm hệ số tăng nhiệt trong môitrường Do đó mà tinh trùng đỡ bị sốc do nhiệt độ (Trần Tiến Dũng vcs,2002) Vì vậy, lòng đỏ trứng không thể thiếu trong môi trường đông lạnh tinhdịch (môi trường phối hợp sẵn Laicifot, Baier, môi trường sữa, môi trườngPolge 1970)

Glyxerin: đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của kỹ thuậtđông lạnh tinh dịch nói riêng và công nghệ sinh học lạnh nói chung Khi đônglạnh tinh dịch ở nhiệt độ lạnh sâu thì các phân tử Glyxerin không bị kết tinh,

do đó tinh dịch đông lạnh không tăng về thể tích, không “thủy tinh hóa” Khigiải đông các tế bào lại hồi phục sự sống sau “ ngủ đông”

Glyxerin trong nước làm thay đổi tính chất vật lý của nước, đặc biệt làlàm tăng nhiều giá trị của độ tăng phí điểm và độ hạ băng điểm của dung dịch

so với dung môi, nghĩa là với sự có mặt của Glyxerin thì hệ số truyền nhiệt bịgiảm đi nhiều Hơn nữa Glyxerin còn có tác dụng bảo vệ màng tế bào, ngănngừa hiện tượng mất nước của plasma tế bào, giúp tế bào tránh được hiệntượng “thủy tinh hóa” nguyên sinh chất trong điều kiện lạnh sâu Vì vậy việcphát hiện ra Glyxerin có tác dụng tốt trong vai trò đông lạnh cho tinh trùng làmột gốc quan trọng trong công nghệ sinh học,

2.1.2 Phương pháp bảo quản lạnh tinh trùng

2.1.2.1 Đông lạnh tinh từ dịch tinh xuất ra ngoài

- Năm 1949, tinh trùng được bảo tồn lạnh lần đầu tiên bởi nhóm cácnhà khoa học do Polge lãnh đạo

Nền tảng của bảo tồn tinh trùng đã có hơn nửa thế kỷ trước đây bằngviệc phát hiện ra những tác nhân có tính chat bảo vệ trong lòng đỏ trứng khilàm lạnh (Phillip vcs, 1940) và Glyxerol để đông lạnh tinh trùng gà và trâu bò(Polge vcs, 1952)

Xuất phát từ thực trạng sử dụng lợn đực giống trong những năm qua:trong khi các nghiên cứu cho thấy tiềm năng khai thác tinh dịch lợn rất lớnnhưng thực tế cho thấy: việc phối giống trực tiếp gây lãng phí tinh dịch vàhiệu quả kinh tế thấp do 1 đực giống chỉ phụ trách 1 đến 2 lợn nái, kể cả việcTTNT bằng tinh tươi cũng gặp phải 1 số khó khăn: thời gian giữ tinh dịchkhông được lâu, đối với vùng giao thông đi lại khó khăn, việc mua tinh tươi

rồi bảo quản, vận chuyển về đến nơi thường mất nhiều thời gian làm giảmchất lượng tinh dịch, tỷ lệ thụ thai thấp, hơn nữa, TTNT bằng tinh tươi cầnlượng tinh dịch rất lớn (đối với lợn nội là 30ml tinh pha, còn lợn ngoại là 100

ml tinh pha) Còn sản xuất tinh theo liều phối dạng viên hay cọng rạ, bảoquản đông lạnh ở -196oC trong ni-tơ lỏng dùng cho TTNT hoặc IVF, chophép khai thác tối đa tiềm năng sinh sản của đực giống tốt, lại bảo quản đượcrất lâu, nó còn có ý nghĩa đặc biệt trong việc bảo tồn giống nòi tránh nguy cơtuyệt chủng Chính vì vậy, xây dựng ngân hang tinh, phôi cung cấp tinh cọng

rạ cho IVF và TTNT đã thay thế hầu hết tinh tươi và việc phối giống tực tiếp,tạo ra bước đột phá trong chăn nuôi nói riêng, CNSH động vật nói chung

Trong những năm qua, những điều chỉnh kỹ thuật thực nghiệm đã đượcđưa vào kỹ thuật bảo quản lạnh tinh trùng với mục đích mở rộng phương phápđối với nhiều loài và cải tiến hiệu quả của quá trình đông lạnh

Tinh trùng của các loài có màng tế bào khác nhau (Cross, 1998), nênảnh hưởng của việc làm lạnh đến tinh trùng cũng khác nhau: lợn đực mẫncảm nhất, trâu bó, cừu ngựa rất mẫn cảm, chó mèo mẫn cảm có mức độ, thỏ,người, gà ít mẫn cảm hơn (Parks, 1997) Có thể phòng tránh sốc lạnh trong kỹthuật bảo quản lạnh bằng việc kiểm soát tốc độ làm lạnh và bổ sung các thànhphần bảo vệ vào chất pha loãng tinh dịch (Parks, 1997; Foote, 1984) Tốc độlàm lạnh phù hợp nhất là: đầu tiên nhanh để cho nước ở ngoài tế bào đônglạnh mà không hình thành tinh thể đá trong tế bào, tốc độ đong lạnh tối ưu đốivới tinh trùng dao động theo loài: 1-10oC/ phút đối với người, 50-100 oC/phútđối với trâu bò (Woelders, 1997)

Theo Holth vcs (2000), ở một số loài, sử dụng liều tinh trùng bảo quanlạnh dù cao thì cũng đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương với sử dụng tinhtươi: tinh trùng bò bảo quản lạnh phải được phối với liều gấp 2-10 lần so vớitinh tươi để đạt được tỷ lệ thụ thai tương đương Nhưng tinh trùng đông lạnh

cần phải đực phối giống gần với thời điểm rụng trứng để tăng khả năng thụthai (Parrish vcs, 1986).

2.1.2.2 Đông lạnh tinh từ mào tinh

a) Khai thác tinh từ mào tinh

*) Cơ sở khoa học

Trong những phương pháp để khai thác tinh thì khai thác tinh từ màotinh là một đề cử quan trọng cho việc bảo quản lạnh tinh trùng Mào tinh lànguồn cung cấp nguồn gen quan trọng của động vật đực đối với những độngvật đang bị đe dọa tuyệt chủng, cũng như động vật hoang dã hay động vậtnuôi nhốt

Hơn nữa, đông lạnh- giải đông tinh khai thác từ mào tinh mang lại kếtquả cao hơn trong IVF so với tinh trùng đông lạnh- giải đông khai thác bằngphương pháp xuất tinh của cùng con lợn Việc sử dụng phương pháp bảo quảnlạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh, thụ tinh ở vòi Fallop hay IVF, kế tiếp làchuyển phôi (IVF/ET) là những phương pháp có thể hoàn thiện và khắc phụcgiới hạn về chất lượng tinh trùng kém Bởi vì tinh trùng được thụ tinh trong

âm đạo thì cần một lượng lớn và chất lượng tốt Còn thụ tinh ở vòi Fallophoặc IVF/ET yêu cầu tinh trùng có khả năng thụ tinh trong ống nghiệm vìtinh trùng không ở lại hoặc chỉ ở lại 1 khoảng thời gian ngắn trong đường sinh

dục con cái, (H,Ikeda, K,Kikuchi, I,Noguchi, H,Takeda, 2000, Effect of preincubation of cryopreserved porcine epididymal sperm) Bản báo cáo đã

nhấn mạnh việc bảo quản lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh là 1 phươngpháp quan trọng cho việc bảo tồn nguồn gen lợn

*) Kỹ thuật khai thác

- Thu lấy dịch hoàn lợn từ lò mổ

- Mổ dịch hoàn thu lấy mào tinh

- Đầu nhỏ của mào tinh được nối với ống để chứa tinh dịch

- Dùng kim cỡ 15 đã bấm đầu nhọn gắn vào lòng ống phia đầu còn lạicủa mào tinh

- Dùng xilanh 100ml đã hút đầy không khí gắn vào kim, rồi bơm hếtkhông khí ra Khi đó tinh dịch trong mào tinh sẽ được dồn hết về phía ốngchứa tinh Chúng ta sẽ thu được tinh dịch từ mào tinh

b) Đông lạnh tinh khai thác từ mào tinh

Sau khi thu được tinh dịch, tỷ lệ % hoạt lực tinh trùng sẽ được đánh giádưới ánh sáng kính hiển vi với khả năng chịu nhiệt 370C, độ phóng đại < 200.Nồng độ tinh trùng trong mỗi đơn vị thể tích được định lượng với phươngpháp đếm trong buồng đếm ThomZeiss

Môi trường bảo quản đông lạnh được thêm vào bằng cách nhỏ từnggiọt tới khi gần tương đương với lượng tinh dịch (tỷ lệ pha loãng 1:1), sau đólắc nhẹ trong vòng 10 đến 15 phút để tinh dịch và môi trường trộn đều vớinhau, và cuối cùng hỗn hợp được cho vào cọng rạ 250µl Các cọng rạ đượcđóng đầy ở nhiệt độ phòng, được gắn miệng bằng nhiệt độ cao, được nhuộmmàu và được đánh dấu riêng với số của con vật và ngày tháng Cọng rạ đượcnhúng chìm trong chậu nước (400 ml) và làm lạnh 1 cách từ từ khoảng 1,9đến 20C/phút

Sau 10 phút, cọng rạ đem đông lạnh được để ở -200C trong 15 phút,mẫu sẽ được làm lạnh thêm bằng cách đặt trong 1 lớp khí ni-tơ lỏng (cách 10

cm phía trên của bình ni-tơ lỏng) trong 10 phút Sau đó bình đựng cọng rạđông lạnh sẽ được đặt trực tiếp vào ni-tơ lỏng Cần tránh sự biến đổi nhiệt độquá nhanh, nên cần thao tác nhanh trong tất cả các bước, (Nguyen Van Hanh,Quan Xuan Huu, Nguyen Viet Linh, Nguyen Thi Men, Nguyen Thi Uoc, K,

Kikuchi, Takashi Nagai, 2007, Conservation of endangered species semen).

2.2 Tình hình đông lạnh tinh tại Việt Nam

Bắt đầu từ năm 1983, Việt Nam đã ứng dụng thành công quy trình mới

về đông lạnh tế bào và phôi động vật, là cơ sở cho những nghiên cứu tiếptheo: tạo ra bê từ phôi TTON, xác định giới tính theo đơn đặt hàng từ năm

2002, phân lập tế bào gốc từ phôi và sử dụng tế bào gốc trong nhân bản vôtính vào năm 2004

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu công nghệ bảo quản tinh đông lạnhlợn Đại Bạch đã thành công, hoàn thiện vào những năm cuối thập kỷ 90 tạiphòng Sinh học tế bào sinh sản, viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâmKhoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia (hiện là viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam)

Theo Nguyễn Anh vcs (2004) đã công bố kết quả thực hiện đề tàinghiên cứu triển khai công nghệ bảo quản tinh đông lạnh lợn Ỉ nhằm bảo tồnnguồn gen quý hiếm của Việt Nam Hướng nghiên cứu tiếp theo cho đề tàinày là đánh giá hiệu quả công nghệ bảo quản đông lạnh thông qua kết quảTTON hoặc TTNT

Theo Nguyễn Văn Hạnh vcs (2007) đã tiến hành thu lấy tinh dịch từ 1

số động vật quý đang bị đe dọa (khỉ, lợn Bản) để bảo tồn nguồn gen bằngphương pháp thu lấy tinh từ mào tinh

Trong phòng thí nghiệm, bảo quản lạnh tinh trùng cho phép sử dụngcác kỹ thuật IVF cho các công nghệ sinh sản hỗ trợ như dùng trong sinh sảncủa người, bảo tồn tế bào sinh dục của những loài có nguy cơ tuyệt chủng vàđối với việc sử dụng những gia súc thí nghiệm

Tuy nhiên ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về tinh bảo quảnlạnh, đặc biệt là tinh lợn vì những khó khăn gặp phải khi nghiên cứu côngnghệ bảo quản so với các loài vật khác: môi trường đông lạnh tinh dịch,phương pháp đông lạnh tinh, các chất bảo vệ lạnh…

2.3 Đặc điểm sinh học tinh dịch lợn

Nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn được bắt đầu từ 1926- 1927bởi Ivanov (milovanov, 1962) Theo như nghiên cứu, tinh dịch gồm có 2thành phần: tinh trùng và tinh thành (95-97%)

2.3.1 Tinh trùng

Tinh trùng là tế bào duy trì nhất của cơ thể có khả năng tự vận độngngoài cơ thể,được sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn và được giữ lại

ở mào tinh (phụ dịch hoàn)

Tinh trùng của mỗi loài động vật có hình thái khác nhau, đặc trưng theoloài Tinh trùng lợn có dạng con nòng nọc gồm 3 phần: đầu, cổ thân, đuôi

Theo Mioti (1941), Randall (1950), Bonadonna (1953), Hancock(1957), kích thước các phần của tinh trùng lợn như sau:

Đầu : dài 6,5μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm, rộng 4,5 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm, dày 1,5 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm

Cổ thân :10-20 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmĐuôi : 30-40 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmDài tổng số : 50-60 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm Theo Kunitado Sato, Junichi Mori, Hiroshi Masuda (2005) cho biếtkích thước các phần tinh trùng lợn như sau:

Đầu : dài 7,2-7,9μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm, rộng 3,6-4,3 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmĐoạn giữa : 10 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm

Đuôi : 30 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmDài tổng số : 49,2-62,4 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmTheo Niwa vcs (1961):

Đầu : 8,51 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm, rộng 4,21 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmmDài tổng số : 54,58 μm, rộng 4,5 μm, dày 1,5 μmm

- Phần đầu:

Ở lợn, phần đầu tinh trùng có hình tang trống Trong màng, trên cùng

của đầu là hệ thống acrosom Phần trước của đầu được bao phủ bởi một mũmỏng tức bao đầu Dưới lớp này có cấu tạo hình dải gọi là thể đỉnh (thểngọn) Trong bao đầu tập trung nhiều enzim trong đó enzim hyaluronidaza cóvai trò phá vỡ màng phóng xạ của tế bào trứng trong quá trình thụ tinh, Trongquá trình bảo tồn, hệ thống acrosom rất dễ bị bong ra do các yếu tố áp suất,nhiệt độ, pH hay do vận chuyển rung động , xóc lắc … làm cho tinh trùng mấtkhả năng thụ tinh Men hyaluronidaza rất dễ bị thấm xuất ra ngoài Đây là vấn

đề cần nghiên cứu và quan tâm trong quà tình trong quá trình pha chế bảoquản và sử dụng tinh dịch nhằm nâng cao tỷ lệ thụ tinh Sau hệ thống acrosom

là nhân tinh trùng chiếm 76,7-80,3% phần đầu tinh trùng, nó là kho duy nhấtchứa mật di truyền của con đực

- Phần cổ thân:

Phần cổ thân đính với phần đầu rất lỏng lẻo có ý nghĩa trong quá trìnhthụ tinh nhưng cũng vì thế nó thế nó dễ bị đứt bởi tác động cơ học, nhiệt, hóachất… làm giảm khả năng thụ tinh và tỷ lệ thụ tinh

Phần cổ thân có cấu trúc 2+9+9 (2 sợi trục trung tâm, 9 sợi vành trong,

9 sợi vành ngoài) Giữa các sợi trục với nhau có mối liên hệ “bắt tay”, còngiữa các sợi dụng truyền thông tin rất nhanh, truyền năng lượng cho đuôi corút vận động

Ở phần cổ thân còn chứa một lượng ATP lớn có tác dụng cung cấp nănglượng cho tinh trùng vận động, song nó lại giảm đi rất nhanh, lượng ATP giảm

đi nhanh khi nhiệt độ bảo tồn cao Do đó, cần phải bổ sung năng lượng vào môitrường pha chế và bảo quản để kéo dài thời gian sống tinh trùng

- Phần đuôi:

Đuôi được chia làm 3 phần: đuôi trung đoạn, đuôi chính, đuôi phụ,cũng có cấu trúc 2+9+9 sắp xếp theo những vòng tròn đồng tâm Chức năngchủ yếu của đuôi là giúp cho tinh trùng vận động

2.3.2 Tinh thanh

Là hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ tiết ra cùng với tinhtrùng trong quá trình giao phối Tinh thanh không cần thiết cho quá trình thụthai nhưng lại cần cho tinh trùng hoạt động và chuyển động trong đường sinhdục con cái Dịch tiết của mỗi tuyến sinh dục phụ có thành phần hóa học vàchức năng khác nhau:

- Tuyến củ hành:

Tiết ra 1 thứ dịch trong suốt, có mùi đặc biệt, pH trung tính, tác dụngchủ yếu của dịch tiết này là làm trơn niệu đạo, rửa niệu đạotrước khi phóngtinh

Trong dịch tiết của tuyến củ hành có chứa một lượng khá lớn hạt thểselatin (chiếm 20-30% lượng tinh dịch), có bản chất là Anbumonoit đặtquánh, trong suốt Khi xuất tinh, các hạt thể này gặp men Vegikinaza củatuyến tinh nang đông lại tạo thành những thể lớn hơn gọi là keo phèn Tronggiao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng “ đóng nút cổ tử cung “ không chotinh dịch chảy ra ngoài, còn trong TTNT phải chóng loại bỏ keo phèn tránhlàm cho tinh trùng bị kết dính,

- Tuyến tiền liệt:

Tiết ra dịch tiết không trong suốt, có tính kiềm có tác dụng trung hòa

độ axit trong lòng niệu đạo và H2CO3 do tinh trùng sinh ra trong quá trìnhhoạt động Ngoài ra nó còn có chức năng nội tiết: tiết hormon Prostaglandin

có tác dụng tăng co bóp cơ trơn ống dẫn tinh và tăng co bóp cơ trơn tử cunglàm tăng tốc độ di chuyển của tinh trùng vào ống dẫn trứng để thụ tinh

- Tuyên tinh nang:

Tiết ra chất keo màu trắng hoặc vàng Chất keo này gặp dịch tiết củatuyến tiền liệt thì kết lại tạo ra một cái nút để đóng cổ tử cung sau quá trìnhgiao phối, mục đích không cho tinh trùng chảy ra ngoài Chất keo này còn coGlucose, axit béo cùng một số enzim khác để tăng cường dinh dưỡng hoạt lực

cho tinh trùng,.

2.4 Quá trình phát triển của tinh trùng

2.4.1 Giai đoạn phát triển

Tế bào phôi nguyên thủy (tế bào tinh nguyên thủy) đều giống nhau ởcon đực và cái Những tế bào này sản sinh thành tinh nguyên bào, các tinhnguyên bào này xuất hiện không lâu trước khi thành thục về tính, là những tếbào lớn hình tròn, có chất nhiễm sắc phân tán rất điển hình, có dạng hạt nhỏ li

ti hay hạt phấn hoa

2.4.2 Giai đoạn sinh trưởng

Trong giai đoạn này tinh nguyên bào tăng kích thước của nó Đến cuốigiai đoạn sinh trưởng tế bào phôi được gọi là inh bào cấp I (Cyt I)

Quá rình phân chia gián phân (Mitosis) cho ra những Cyt I với 2nnhiễm sắc thể (NST) Giai đoạn này xảy ra 15 – 17 ngày

2.4.3 Giai đoạn thành thục

Đặc trưng của giai đoạn này là số lượng nhất định các lần phân chia tếbào và đặc biệt là số lần phân chia giảm nhiễm bộ nhiễm sắc (Meiosis) thànhđơn bội (n nhiễm sắc thể)

Phân bào giảm nhiễm ở đây gồm 2 lần phân chia liên tiếp:

- Lần 1: Theo cách phân chia giảm, tạo ra Cyt II với n nhiễm sắc thể,xảy ra 13 – 17 ngày

- Lần 2: Theo cách phân chia đều, phân chia NS có sau lần phân chia 1 đểtạo ra tinh tử (tiền tinh trùng) Lần phân chia này xảy ra rất nhanh 1 – 2 ngày

2.4.4 Giai đoạn biến thái

Tinh tử phải trải qua giai đoạn biến thái:

- Nhân tế bào thu nhỏ và biến thành đầu tinh trùng; phần lớn tế bào chấtdồn về một phía tạo thành phần cổ thân Một số thể Golgi tập trung ở đầu múttrước của tinh trùng tạo thành Acrosom, các màng bọc và xoang Acrosom

Cả hệ thống Acrosom cùng với màng nhân và màng ngoài tạo thành mũtrước chóp của tinh trùng và nối với tế bào Sertoli để nuôi dưỡng tinh trùng.

Hai trung tử thì chuyển động về phía sau nhân, nằm đối diện với Acrosom

Ở phía sau nhân xuất hiện một chỗ lõm gọi là hố thụ tinh, 1 trung tử sẽnằm trong hố đó Trung tử thứ 2 nằm sau trung tử 1 và là nơi xuất phát cho 2 sợitrục trung tâm cung với các sợi xoắn khác (fibrin) để tạo thành đuôi tinh trùng

Các ty thể chuyển ới vùng cổ thân, phần lớn tế bào chất được biến đichỉ còn lại 1 lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi

Quá trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sertoli trong lòng ốngsinh tinh, trong khoảng thời gian 14 – 15 ngày Sau đó chúng trở thành tinhtrùng non và rơi vào trong lòng ống sinh tinh, được đùn đẩy và đưa về phíaphụ dịch hoàn

2.4.5 Giai đoạn phát dục

Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành thục Trongquá trình di chuyển từ đầu đến cuối phụ dịch hoàn, tinh trùng phải di chuyểnvới đoạn đường khá dài (khoảng trên 100m) nằm uốn khúc quanh co Trongquá trình này có khá nhiều tinh trùng non bị phân hủy, có thể tới 50%,

Thời gian di chuyển 14-15 ngày

2.4.6 Giai đoạn biến đổi hóa học

Chính ở phụ dịch hoàn màng bán thấm Lipoprotein được hình thànhnhờ vách đuôi phụ dịch hoàn Tinh trùng được dự trữ trong phụ dịch hoàn rấtlâu cho tới khi thành thục hoàn toàn vì ở đây nó có đủ điều kiện sống thuậnlợi Tế bào vách của phụ dịch hoàn tiết ra 1 chất toan yếu, nồng độ ion N gấp

10 lần so với ở rong lòng ống sinh tinh, trong chất dịch của phụ dịch hoàn cóchứa chất điện giải nhưng ít hơn so với dịch hoàn, nhiệt độ cũng thấp hơn, tất

cả những điều kiện đó làm tinh trùng ở trạng thái không hoạt động, năng

lượng tiêu hao giảm thấp hơn, cho nên nó có thể ở đây trên 2 tháng mà vẫncòn khả năng thụ thai.

2.5 Các chỉ tiêu đánh giá tinh dịch sau khi bảo quản đông lạnh

2.5.1 Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A%)

Hoạt lực là sức sống (sức hoạt động) của tinh trùng có phương hướngchuyển động tiến thẳng, A là chỉ tiêu kỹ thuật quan trọng trong việc đánh giáchất lượng tinh dịch, A cho biết khả năng thụ thai của quần thể tinh trùngtrong tinh dịch (Dương Đình Long, 1996)

Theo Corteel (1977), tinh trùng có hoạt lực tốt thì tỷ lệ thụ tinh cao,tinh trùng có hoạt lực yếu thì tỷ lệ thụ tinh kém

Ở phụ dịch hoàn, tinh trùng không được hoạt động, khi ra ngoài cơ thể,tinh trùng được tinh thành hoạt hóa nên đã được hoạt động với tất cả sức sốngcủa mình Tùy theo sức sống mà tinh trùng có, chúng sẽ vận động theo 1trong 3 phương thức như sau:

- Tiến thẳng : là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vậnđộng ổn định

- Xoay vòng: là sự vận động của tinh trùng mà phương của vectơ vậnđộng luôn luôn bị thay đổi

- Lắc lư : là sự vận động của tinh trùng mà hầu như không có vectơ vậnđộng, không thay đổi vị trí tương đối của chúng (Trần Tiến Dũng vcs, 2002)

Chỉ tinh trùng vận động tiến thẳng mới có khả năng tham gia vào quátrình thụ tinh, Theo Milovanov (1962), sức sống của đời sau cũng phụ thuộcvào sức sống của tinh trùng, Tinh trùng càng nhiều sức sống thì khả năng sinhtrưởng phát dục, sức đề kháng bệnh tất… của đời sau càng cao

Theo Nguyên Thiện vcs (2005), tinh trùng có các phương thức vậnđộng: tiến thẳng, vòng quanh, dao động, không hoạt động (chết)

Theo Tổ chức Y Tế thế giới WHO, tinh trùng có các kiểu vận động :

0= Không vận động1= Vận động yếu ớt2= Vận động chậm3= Không vận động tiến thẳng về trước4= Vận động tiến nhanh về phía trướcCác giống lợn ngoại đã cải tiến: Đại bạch, Landrace, Duroc, A= 80-90%, còn các giống lợn chưa được cải tiến, A nhỏ hơn: 70 – 80%, A thay đổitheo giống là chủ yếu (Dương Đình Long, 1996).

Theo Nguyễn Lăng (1994), A của lợn Yorshire: 80-90%, Landrace: 70-80%Theo kết quả nghiên cứu của Đào Đức Thà vcs (2003), ALandrace= 72%,

Ayorshire= 73%

Trong TTNT cho gia súc, chỉ tinh dịch đạt A ≥ 70% thì tinh dịch đómới đủ tiêu chuẩn để pha chế bảo tồn ở dạng đông lạnh (Trần Tiến Dũng vcs,2002)

Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, A ≥ 70% mới sử dụng đểpha chế bảo tồn (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998)

Tinh dich bảo tồn phải đạt A ≥ 40-50% (tinh lỏng) và A ≥ 30% (tinhđông lạnh) mới được sử dụng để dẫn tinh cho gia súc cái

Các yếu tố: nhiệt độ, khoảng cách lấy tinh, dinh dưỡng, kỹ thuật khaithác…đều có ảnh hưởng đến A Nhiệt độ cao làm tinh trùng chết rất nhanh,nhiệt độ thấp làm cho sức vận động của tinh trùng giảm, thậm chí ngừng vậnđộng, đây cũng chính là cơ sở khoa học để bảo tồn và đông lạnh tinh

2.5.2 Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml)

Nồng độ tinh trùng là số lượng tinh trùng có trong 1 đơn vị thể tích tinhdịch nguyên (chưa pha loãng) (thường tính bằng đơn vị 106/ml hoặc 108/ml)

Nồng độ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh dịch,

là chỉ tiêu cơ sở để tính số liều tinh sản xuất Do vậy ở các cơ sở sản xuất tinh

dịch công nghiệp, sản xuất tinh đông lạnh, C là chỉ tiêu kiểm tra thường xuyên.

Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyên Quốc Đạt (1997), C là 1 thông số cầnthiết giúp ta quyết định tỷ lệ pha loãng tinh nguyên với môi trường bảo quản

và định liều phối trong TTNT

Để pha loãng bảo quản tinh dịch đạt kết quả cao thì tinh dịch phải đạtyêu cầu:

Theo tiêu chuẩn nhà nước TCVN 1859/76, C lợn ngoại ≥ 80,106/ml,

C lợn nội = 20,106/ml

Nồng độ tinh trùng lợn thấp hơn các gia súc khác: Milovanov (1962)C= 10-20,106/ml, cao nhất 100,106/ml; Mann (1954), Ctrung bình =100,106/ml

Trần Thế Thông vcs (1974) cho biết: C Đại Bạch =110-130,106/ml,

C Landrace = 120-300,106/ml, C Ỉ pha = 30-60,106/ml

Dương Đình Long (1996), C Đại Bạch= 178,8,106/ml, dao động 200,106/ml, C Landrace= 167,5,106/ml, dao động 150-190,106/ml, C lợn Ỉ=39,4,106/ml, dao động 21-78,106/ml

170-Nồng độ tinh trùng phụ thuộc nhiều yếu tố : giống, tuổi, mùa vụ, chămsóc nuôi dưỡng, quản lý…

Nguyễn Thiện vcs (2005) cho biết:

Ở 4-8 tháng tuổi Lợn nội C= 80-100,10Lợn ngoại C= 80-100,1066/ml/ml

1-2 năm Lợn nộiLợn ngoại C= 40-50,10C= 250-300,106/ml6/ml

3-4 năm Lợn nộiLợn ngoại C= 20-40,10C= 200-250,106/ml6/ml

2.5.3 Tỷ lệ sống (Sg: %)

Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu hỗ trợ đánh giá chất lượng tinh trùng.Khi tinh trùng chết, màng của nó có thể cho chất nhuộm màu thấm qua, còntinh trùng sống thì không bắt màu, Do đó ta có thể xác định được tỷ lệ tinhtrùng sống Chỉ tiêu này cũng là cơ sở để tính số tinh trùng cần thiết cho một

liều phối (Đỗ văn Thu, Nguyễn Anh, Lê Thành Đô, 2003).

Tỷ lệ tinh trùng sống có ý nghĩa quan trọng trong quá trình pha chế,bảo tồn tinh dịch Theo Nguyễn Thiện (2005), tỷ lệ sống phải đạt ≥ 80% mớiđạt yêu cầu trong pha chế, bảo tồn tinh dịch

Theo TCVN 1859/76, tỷ lệ sống chung cho cả lợn nội và lợn ngoại phải

≥ 70% (Nguyễn Thiện, Đào Đức Thà, 1998)

Nguyễn Anh (2004) cho biết lợn Ỉ có Sg = 83,18%, dao động 60-98%

Tỷ lệ sống phụ thuộc nhiều yếu tố: giống, tuổi, chế độ khai thác, nuôidưỡng và quản lý đực giống,

2.5.4 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %)

tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình thái học khong bìnhthường ở đầu, cổ thân, đuôi Những tinh trùng này không có khả năng thụthai Đây là chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch

Những tinh trùng kỳ hình thường dược xuất ngay từ giai đoạn đầu(Asdell, 1946)

Theo Hafez (1974), K của tinh trùng lợn biến động từ 10-30%

Còn Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) cho biết chỉ sỗ này ở lợn ViệtNam < 20%, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình càng thấp càng tốt, không nên quá 20%

Quy trình kỹ thuật TTNT lợn của Bộ Nông Nghiệp 1985 và tiêu chuẩntinh dịch lợn Việt Nam 1982 cũng quy định Kmax = 16%

Theo Dương Đình Long (1996), lợn Landrace có K= 6,2% dao động 3- 10,4%, lợn Đại Bạch K= 6,2%, dao động 3-4%, lợn Ỉ K= 4,1% dao động

3 - 5,7%, lợn Móng Cái, K= 4,76% dao ddoongj 4-5%

Trương Lăng (1994) cho biết lợn Landrace, Yorshire có K= 9,86%.Đào Đức Thà vcs, 2003 nghiên cứu cho thấy: Landrace K= 4,91%,Yorshire K=5,81%

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch phản ánh tình trạng sức khỏecủa con đực, hoạt động sinh dục và đặc biệt là quá trình sinh tinh Vì vậy nó

phụ thuộc tuổi, chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc và chế độ khai thác tinh.

Theo Milovanov (1962), có 2 thời kỳ có thê gây kỳ hình cho tinh trùng:

- Ngay trong quá trình sinh tinh, điều này xảy ra đều bắt nguồn từnhững nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý

- Sau khi tinh trùng ra ngoài cơ thể, trường hợp này xảy ra thường có liênquan với các nhân ngoại cảnh và kỹ thuật không đúng khi kiểm tra tinh dịch

Theo Hà Văn Chiêu (1999) nếu tinh trùng còn giọt bào tương bám theothì tinh trùng đó được coi là kỳ hình và không có khả năng thụ thai Còn theoTrần Tiến Dũng vcs (2002), tinh trùng còn giọt nguyên sinh ở cổ thân, đuôi lànhững tinh trùng chưa thành thục-tinh trùng non

Phân loại tinh trùng kỳ hình:

- Kỳ hình ở phần đầu: đầu khổng lồ, đầu bé bất thường, bong xoangacrosom, 2 đầu

- Kỳ hình ở phần đuôi: đuôi xoăn, đuôi cuộn, đuôi cong, đuôi gập, 2 đuôi.Tinh trùng kỳ hình đuôi là chủ yếu chiếm 80%

2.6 Thụ tinh ống nghiệm bằng tinh bảo tồn lạnh trong Nitơ lỏng -196 0 C

+ Nguyên lý thụ tinh:

TTON là sự két hợp giữa trứng đã nuôi thành thục trong ống nghiệmvới tinh trùng đã được kiện toàn năng lực thụ tinh Trong kỹ thuật TTON, tếbào trứng và tinh trùng là nguyên liệu cơ bản đồi hỏi cần có sự chuẩn bị kỹcàng cùng với các điều kiện nuôi cấy thích hợp

+ Các giai đoạn của quá trình thụ tinh:

Các giai đoạn của TTON cũng có những điểm tương đồng với thụ tinhinvivo, bao gồm các giai đoạn:

- Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào vành phóng xạ

- Tương tác của tinh trùng với màng trong suốt

- Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt

- Phản ứng thể đỉnh

- Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt

- Sự dung hợp của giao tử đực và giao tử cái

- Sự hoạt hóa tế bào trứng

Để tiến hành IVF cần thực hiện các bước:

- Thu buồng trứng, bảo quản và vận chuyển buồng trứng

- Thu trứng từ các nang trứng

- Nuôi thành thục trứng invitro

- Xử lý tinh trùng (kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng)

- Thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm

+ Kiện toàn năng lực thụ tinh của tinh trùng:

Astin (1951) thí nghiệm trên chuột và Chang (1951) trên thỏ khi tiếnhành thí nghiệm thụ tinh bằng tinh trùng trong ống dẫn trứng, cả 2 ông đềuchỉ ra rằng: Các tinh trùng trong tinh dịch khi phóng tinh đều không có khảnăng thụ tinh trực tiếp với trứng mà chúng phải trải qua một thời gian nhấtđịnh trong đường sinh dục con cái để đạt tới khả năng thụ tinh Chính vì vậy

“kiện toàn năng lực thụ tinh chi tinh trùng” là khâu quan trọng ảnh hưởng trựctiếp đến kết quả thụ tinh ống nghiệm

Hiện nay có 1 số phương pháp xử lý tinh trùng được phổ biến:

- Phương pháp bơi ngược dòng (swim-up)

Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37oC trong 1 phút,Toàn bộ tinh trùng được đưa vào môi trường TALP trong vòng 45-60 phút ở38,5-39oC Thu lấy phần trên và ly tâm 200xg trong 10 phút Những tinhtrùng đạt tiêu chuẩn được đưa vào thụ tinh, Kolbe và Holz (1999), bổ sungNaHCO3, Pyruvat, lactate, gluco, BSA, dịch nang trứng, Kanamycine, giữ pH

= 7,8 và đưa vào tủ nuôi 39 oC, 5% CO2, độ ẩm bão hòa trong 90 phút

- Phương pháp ly tâm (centrifusion)

Tinh trùng đông lạnh được giải đông ở nhiệt độ 35-37 oC trong 1 phút

và được rửa lại 2-3 lần trong môi trường TCT-PVA bổ sung axit béo – free

BSA, đưa vào ly tâm 2 lần, mỗi lần 5 phút, 9000 xg/phút Tinh trùng thu đượccho vào ống nhựa hình chóp (4ml), để vào tủ ấm 38,5 oC, độ ẩm bão hòa trong

15 phút đến khi thụ tinh, lúc này tinh trùng đã đủ tiêu chuẩn đưa vào thụ tinh

+ Phương pháp lọc qua phân lớp Percoll (gradient percoll)

Tinh trùng đông lạnh được giải đông trong nước ấm 35-37 oC trong 1phút Chúng được cho lên lớp Percoll với nồng độ khác nhau (90%/45%: 1lớp percoll 90% ơ dưới và 1 lớp percoll 45% ở trên), ly tâm 700 xg/phút trong20-3- phút, Phần lắng xuống đáy là những tinh trùng khỏe mạnh đạt tiêuchuẩn thụ tinh

Ngoài ra còn có phương pháp lọc qua phân lớp Polyvinyl pyrrolidone(Guerin, 1981)

+ Phương pháp thụ tinh trứng lợn trong ống nghiệm:

Trứng đã thành thục và tinh trùng đã được tăng cường năng lực thụtinh, sẵn sàng tham gia vào thụ tinh thì tiến hành TTON

Loại bỏ môi trường bảo quản đông lạnh tinh bằng cách ly tâm 200vòng/phút sau đó pha loãng với một số môi trường thích hợp: DPPS, TCM-

199, Saline-BSA…

Sau khi xử lý tinh trùng xong phải tiến hành kiểm tra nồng độ và hoạtlực tinh trùng tiến thẳng, thông thường nồng độ tinh trùng sau pha loãng phảiđạt 5x105- 106 tinh trùng/ml

+ Một số yếu tố ảnh hưởng đến TTON

Kết quả TTON phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó chủ yếu là: kíchthước nag trứng, chat lượng trứng, môi trường và điều kiện nuôi cấy, giống,mùa vụ, tuổi, đực giống, phương pháp xử lý hoạt hóa tinh trùng, nồng độ vàhoạt lực tinh trùng tiến thẳng…

Phần thứ ba VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đánh giá 1 số đặc điểm sinh học tinh dịch lợn được tiến hành trên 2giống lợn: Lợn Bản và Landrace nuôi tại các trại giống gia súc gia cầm Thuậnthành – Bắc Ninh, trại Cầu Diễn – Hà Nội… lợn khỏe mạnh, được chăm sócnuôi dưỡng tốt, giao phối thuần thục trước khi mổ lấy

Khảo sát 1 số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn Bản, Landrace sau đônglạnh, Lợn Bản (hay còn gọi lợn Mường, lợn “cắp nách”, Minipig) là 1 giốnglợn quý, kích cỡ nhỏ (khối lượng lợn đực trưởng thành là 30-40 kg, lợn nái20-30 kg (7-8 tháng tuổi)), được nuôi chủ yếu ở vùng đồi núi phía Bắc, vùngtrung du

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 1 đến hết tháng 4 năm 2010.

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ phôi, viện CNSH, viện Khoiahọc và công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội

Trung tâm giống gia súc gia cầm Thuận Thành – Bắc Ninh

Trại nuôi động vật thí nghiệm của phòng công nghệ phôi

3.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và đánh giá chất lượng tinh trùng trước và sau bảo quản lạnhđược mổ lấy từ mào tinh của lợn Landrace theo các chi tiêu A, K, Sg

Đánh giá chất lượng tinh dịch của tinh từ mào tinh của lợn Landracequa việc tham gia vào thụ tinh ống nghiệm

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp thu tinh

Tinh trùng khai thác từ mào tinh được thu thập từ 5 con lợn Landrace.Đối với mào tinh của lợn ngoại Landrace được thu thập tại lò mổ địaphương và được vận chuyển về phồng thí nghiệm để ở nhiệt độ phòng Baogồm các bước như sau:

- Mổ dịch hoàn thu lấy mào tinh

- Đầu nhỏ của mào tinh được nối với ống để chứa tinh dịch

- Dùng kim cỡ 15 đã bấm đầu nhọn gắn vào lòng ống phia đầu còn lạicủa mào tinh

- Dùng xilanh 100ml đã hút đầy không khí gắn vào kim, rồi bơm hếtkhông khí ra, Khi đó tinh dịch trong mào tinh sẽ được dồn hết về phía ốngchứa tinh, Chúng ta sẽ thu được tinh dịch từ mào tinh

3.4.2 Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch lợn thu được

- Lượng tinh thu được (V: ml)

Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991) dùng ốngđong, cốc đong có chia độ sẵn, đặt thăng bằng ngang tầm mắt và đọc kết quả

ở mặt cong dưới của tinh dịch

- Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (A: %)

Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991), cách tiếnhành:

Dùng đũa thủy tinh sạch, lấy 1 giọt tinh dịch nhỏ lên phiến kính khô,sạch, ấm (35-370C) Dùng 1 lamen sạch, ấm đặt lên giọt tinh dịch sao cho giọttinh dịch được dàn đều ra 4 cạnh của lamen và không lẫn bọt khí

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400 lần, ước lượng tỷ lệphần trăm tinh trùng tiến thẳng (theo kinh nghiệm) trong vi trường quan sátđược Trong khi kiểm tra, tiêu bản được sưởi ấm 37-390C

Việc đánh giá hoạt lực tiến thẳng được cho điểm theo thang 1 điểm:

95 85

85 75

75 65

-65 – 55

55 45

45 34

35 25

-25 – 15

15 5

Nồng độ tinh trùng (C: triệu/ml)

+ Theo phương pháp của Milovanov (1962), Chemineau (1991), Dùngbuồng đếm hồng cầu theo kiểu Toma và ống pha loãng hồng cầu pha loãngtinh dịch bằng dung dịch NaCl 3%

+ Dùng pipet 1000 µl hút 990 µl NaCl 3% vào ống ibendoft

Dùng pipet 100 µl hút 10 µl tinh dịch vào ống ibendoft, trộn đều

Tỷ lệ pha loãng 100 lần

Hút 1 giọt nhỏ lên buồng đếm hồng cầu

Đặt buồng đếm lên kính hiển vi độ phóng đại 200-600 lần Đếm tinhtrùng trong 5 ô lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa – mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ, mỗi ônhỏ có diện tích 1/400 mm2, độ sâu 1/10 mm2)

Nguyên tắc đếm:

Đếm tinh trùng theo đầu, đếm lần lượt theo hàng, hết hàng nọ đến hàngkia theo hình chữ chi, Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm ở 2cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải)

Đếm xong lấy kết quả trung bình qua 3 lần đếm được trong 5 ô lớn,Nếu kết quả của 2 lần đếm chênh lệch nhau trên 30% thì phải làm lại Nếutinh trùng tụ thành đám không đếm được thì cũng bỏ đi, làm lại

Công thức tính nồng độ tinh trùng : C = n.106

Trong đó: C: nồng độ tinh trùng trong tinh dịch

n: số tinh trùng đếm được trong 5 ô lớn

106 : chỉ số quy nồng độ tinh trùng về 1 ml tinh nguyên

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400 lần Đếm tổng sốkhoảng 200 tinh trùng phân bố đều ở các vùng, Các tinh trùng sống không bắtmàu Tinh trùng chết bắt màu đỏ.

Công thức tính:

Sg (%) = Số tinh trùng sống x 100

Tổng số tinh trùng đếm

- Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %)

Theo phương pháp của William (1921), kết hợp với phương pháp củaChemineau (1991), sử dụng phương pháp nhuộm bằng dung dịch xanhMethylen, đỏ Fucsin, Eosin-Nigrosin…

Cách tiến hành:

Nhỏ 1 giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, nhẵn, ấm, dùng lamen sạch,nhẵn dàn đều tinh dịch trên phiến kính (nếu đặc pha bằng nước sinh lý hoặcNatricitrai 2,9%) Để tự khô trong không khí, sau đó cố định bằng cồn (2-3phút), rửa nhẹ bằng nước cất, vẩy khô

Nhuộm màu tinh trùng: Nhuộm đơn bằng dung dịch eosin-nigrosintrong 5-7 phút, rửa nhẹ bằng nước cất, vẩy khô

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi độ phóng đại 400-600 lần Đếm tổng số300-500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình,không đếm lặp

Công thức tính:

Số lượng tinh trùng kỳ hình Tổng số tinh

trùng đếm được

Tỷ lệ kỳ hình(%)

3.4.3 Pha loãng và bảo tồn tinh dịch lợn ở nhiệt độ -196 0 C

Tinh dịch lợn vừa mới khai thác được đánh giá chất lượng tinh dịchngay, sau đó pha loãng tinh dịch để bảo quản dài ngày hoặc bảo quản đônglạnh, Nếu A đạt ≥ 70%, Sg ≥ 80% mới đủ tiêu chẩn pha chế bảo tồn đônglạnh được

Phương pháp đông lạnh: trước đây, một số tác giả đã nghiên cứu thửnghiệm 1 số quy trình đông lạnh tinh lợn: phương pháp đông lạnh củaDương Đình Long (1996), phương pháp đông lạnh tinh dịch lợn Ỉ củaNguyễn Anh (2004)

Ở đây chúng tôi đông lạnh tinh lợn theo phương pháp đông lạnh củaKikuchi vcs (1998)

3.4.4 Phương pháp khảo sát, đánh giá chất lượng tinh dịch lợn sau thời gian bảo tồn

Định kỳ kiểm tra các chỉ tiêu A, Sg, C, K theo phương pháp ở mục3.4.2 trong suốt quá trình bảo quản lạnh trong ni-tơ lỏng -1960C

3.4.5 TTON bằng tinh lợn bảo tồn ở -196 0 C

- Chuẩn bị trứng:

Trứng sau khi được nuôi thành thục trong môi trường nuôi tại phòngCông nghệ phôi sẽ được chúng tôi tiến hành TTON Trứng được đánh giá là