Ảnh hưởng nhiệt độ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis Cuvier &Valencienes, 1828 .... Ảnh hưởng nồng độ khác
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG TINH TRÙNG
VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN HOẠT
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn “Nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh
trùng và ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828)” thuộc đề tài “Nghiên cứu đặc
tính và bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &
Valencienes, 1828)” do Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ -
trường Đại học Nha Trang chủ trì - TS Lê Minh Hoàng chủ nhiệm, được thực hiện từ tháng 3 năm 2012 đến tháng 10 năm 2012 là chính xác Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác tới thời điểm này
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Hồng Nhung
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Nuôi trồng Thuỷ sản Trường Đại học Nha Trang,
Bộ môn Cơ sở Sinh học Nghề cá đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm sinh học nghề cá
Tôi xin cảm ơn các cán bộ, công nhân tại lồng bè nuôi cá Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa đã giúp chúng tôi nuôi vỗ thành thục cá
Tôi xin cảm ơn Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài giúp tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Minh Hoàng đã dìu dắt tôi trên con đường nghiên cứu khoa học, trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn
Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 53CHNT2011 đã luôn giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài
Xin gửi lời cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện đề tài
Trang 4MỤC LỤC
LỜI CAM DOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DẠNH MỤC CÁC HÌNH vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4
1.1 Đặc điểm sinh học, sinh sản cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 4
1.1.1 Đặc điểm hình thái: 4
1.1.2 Phân bố và tập tính: 5
1.1.3 Đặc điểm sinh sản: 5
1.2 Đặc điểm tinh trùng cá 5
1.2.1 Quá trình tạo tinh trùng cá (hình 1.2) 5
1.2.2 Cấu tạo tinh trùng cá (hình 1.3) 7
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá 8
1.2.3.1 Yếu tố lý học 8
1.2.3.2 Yếu tố hóa học: vai trò các ion bao gồm: Ion Na+ , K+, Ca2+, Mg2+ và ion Cl- 13
1.2.4 Đặc điểm hoạt lực của tinh trùng 15
1.2.4.1 Tỉ lệ pha loãng 16
1.2.4.2 Nhiệt độ 18
1.2.4.3 pH 18
1.2.4.4 Áp suất thẩm thấu 19
1.2.4.5 Ảnh hưởng các ion 20
1.3 Tình hình nghiên cứu đặc tính lý, hóa và hoạt lực tinh trùng cá trên thế giới và Việt Nam 24
1.3.1 Trên thế giới 24
Trang 51.3.2 Việt Nam 25
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 27
2.2 Đối tượng nghiên cứu 27
2.3 Bố trí thí nghiệm 27
2.3.1 Đặc tính lý học của tinh dịch được thực hiện theo sơ đồ khối sau đây: 27
2.3.2 Xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực tinh trùng 28
2.4 Phân tích số liệu 31
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1 Đặc tính lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 32
3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 36
3.2.1 Ảnh hưởng tỉ lệ pha loãng lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 37
3.2.2 Ảnh hưởng pH khác nhau lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 38
3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 40
3.2.4 Ảnh hưởng ASTT (mOsm/kg) lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 41
3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các ion Na+ , K+, Ca2+, Mg2+ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận tốc vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828) 42
a Ảnh hưởng của ion Na+ 42
b Ảnh hưởng của ion Kali 43
Trang 6c Ảnh hưởng của ion Ca2+
44
d Ảnh hưởng của ion Mg2+ 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
1 Kết luận 47
1.1 Thành phần lý học trong tinh dịch, thành phần hóa học trong dịch tương cá chẽm mõm nhọn 47
a Thành phần lý học: 47
b Thành phần hóa học: 47
1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn 47
a Tỉ lệ pha loãng: 47
b Ảnh hưởng của pH: 47
c Ảnh hưởng của nhiệt độ: 47
d Ảnh hưởng của ASTT: 47
e Ảnh hưởng nồng độ các cation: 47
2 Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 49
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Mật độ tinh trùng, độ quánh tinh dịch một số các loài đã nghiên cứu 10 Bảng 1.2 Giá trị pH, ASTT trong tinh dịch của một số loài cá 11 Bảng 1.3 Nồng độ các cation (Na+
, K+, Ca2+, Mg2+) (mM/l) trong dịch tương của một số loài cá 14 Bảng 1.4 Tỉ lệ pha loãng, nhiệt độ tối ưu cho một số loài cá đã nghiên cứu 17 Bảng 1.5 Nồng độ các ion Na+
, K+, Ca2+, Mg2+(mM/l) trong dịch tương tinh trùng một số loài cá 22 Bảng 3.1 Khối lượng, chiều dài, đặc tính lý học của tinh dịch cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis (N = 10) 32
Bảng 3.2 Ion trong dich tương và tổng protein, Áp suất thẩm thấu trong tinh dịch
cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis ( N = 10) 35
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu tạo ngoài cá chẽm mõm nhọn 4
Hình 1.2 Sơ đồ tạo tinh trùng cá 6
Hình 1.3 Cấu tạo tinh trùng cá 7
Hình 2.1 Quy trình xác định một số đặc tính lý hóa của tinh dịch cá 27
Hình 2.2 Quy trình xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng 29
Hình 2.3 Các dụng cụ tiến hành thu thập số liệu 30
Hình 2.4 Cách tiến hành thí nghiệm quan sát 31
Hình 3.1 Ảnh hưởng tỉ lệ pha loãng lên phần trăm, vận tốc, thời gian vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn 37
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH lên vận tốc, phần trăm, thời gian hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn 39
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên vận tốc, phần trăm, thời gian hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn 40
Hình 3.4 Ảnh hưởng ASTT lên vận tốc, phần trăm, thời gian hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn 41
Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các ion Na+ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận tốc vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 43
Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các ion K+ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận tốc vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 43
Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các ion Ca2+ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận tốc vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 44
Hình 3.8 Ảnh hưởng nồng độ khác nhau của các ion Mg2+ lên phần trăm tinh trùng hoạt động, thời gian và vận tốc vận động của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis 45
Trang 10và ấu trùng chứ không phải tinh trùng, mặc dù chất lượng tinh trùng ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thụ tinh và tạo ra ấu trùng khỏe mạnh [20, 31, 49] Nhưng gần đây, các nhà khoa học đã chú ý đến việc nâng cao chất lượng tinh trùng để khả năng thụ tinh đạt kết quả tốt hơn Không chỉ các thành phần hiện diện trong tinh dịch như: các ion, pH, áp suất thẩm thấu mà hoạt lực tinh trùng sau khi kích hoạt cũng được quan tâm [18, 74] Tinh trùng của hầu hết các loài cá biển đều không hoạt động trong buồng sẹ và dịch tương [6,
63, 103] Chúng chỉ vận động khi được phóng thích vào môi trường nước trong sinh sản
tự nhiên hay môi trường thích hợp khi sinh sản nhân tạo Chính vì vậy để tạo môi trường thích hợp cho tinh trùng hoạt động là một đòi hỏi cần thiết cho sự thành công thụ tinh nhân tạo hiện nay Trong sản xuất giống nhân tạo, việc đánh giá chất lượng tinh dịch (đặc tính lý hóa học, hoạt lực và khả năng thụ tinh của tinh trùng) là yếu tố quan trọng để có hiệu quả thụ tinh cao [18, 28, 75]
Trong nhiều loài cá biển được nuôi tại Việt Nam, cá chẽm mõm nhọn đang là đối tượng được ưa thích [5, 7] Trên thế giới và ở nước ta đã có nhiều công trình nghiên cứu
về đặc điểm sinh học, sinh sản, sản xuất giống nhân tạo, và các công trình nghiên cứu khác liên quan đến đối tượng này [3, 6, 94] Mặc dù những thông tin cơ bản về đặc điểm sinh sản, mùa vụ, yếu tố môi trường sống của cá chẽm mõm nhọn có đầy đủ trong nhiều nghiên cứu trước đó song dữ liệu về đánh giá chất lượng tinh trùng và các yếu tố: pH, nhiệt độ, cation: ion (Na, Ca, Mg, K), áp suất thẩm thấu và tỷ lệ pha loãng (tỷ lệ tinh trùng/dung môi tinh trùng vận động) ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng của đối tượng này vẫn chưa được biết [94] Với sự thiếu hụt của các kiến thức về các thông số trên, nghiên cứu này nhằm mục đích kiểm tra đánh giá chất lượng tinh trùng và tác động của sự thay đổi các thông số nêu trên lên khả năng hoạt lực của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Các
Trang 11thông số đánh giá lên khả năng hoạt lực của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn gồm: vận tốc, phần trăm hoạt lực và thời gian hoạt lực Hầu hết các thông số này sẽ giúp tạo ra được môi trường hoạt động tối ưu cho tinh trùng của cá chẽm mõm nhọn Điều này là rất hữu ích trong nuôi trồng thủy sản, cho phép sự phát triển tối ưu phương pháp sinh sản nhân tạo và góp phần cải thiện điều kiện bảo quản ngắn hạn và dài hạn của tinh trùng cho loài
cá này trong tương lai [83, 102]
Việc nghiên cứu đặc tính lý hóa sinh của tinh trùng cá chẽm mõm nhọn giúp chúng ta biết được quá trình sinh hóa cơ bản xảy ra trong suốt quá trình thụ tinh và hoạt lực của tinh trùng, thông qua đó đánh giá được khả năng sinh sản của tinh trùng, và tạo ra được môi trường tốt nhất cho quá trình thụ tinh xảy ra [30, 77] Tính đến thời điểm thực hiện đề tài này thì có rất nhiều công trình công bố về đánh giá chất lượng tinh trùng và ảnh hưởng của
các yếu tố đề cập ở trên lên hoạt lực tinh trùng cá biển như: Cá hồi Đại Tây Dương Salmo
salar [29], cá chẽm Lates calcarifer [100], cá bò da Paramonacanthus oblongus, cá đù
vàng Larimichthys polyactis [64]… nhưng chưa có công trình nào công bố trên thế giới về
cá chẽm mõm nhọn Đặc biệt hơn là vấn đề nghiên cứu này rất còn hạn chế đối với cá biển
ở nước ta Nghiên cứu này thực hiện sẽ là cơ sở dữ liệu bổ sung cho thế giới và ở nước ta
Cũng chính vì những lý do trên đề tài: “Nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng và
ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca
waigiensis (Cuvier &Valencienes, 1828)” thuộc đề tài “Nghiên cứu đặc tính và bảo
quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier & Valencienes,
1828)” do Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ được thực hiện
Luận văn tiến hành gồm các nội dung:
1 Xác định một số đặc tính lý học của tinh dịch
2 Xác định một số đặc tính hóa học của tinh dịch
3 Ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt lực tinh trùng
Trang 12Mục tiêu luận văn:
Xác định được hàm lượng, thành phần lý hóa học trong tinh dịch cá chẽm mõm nhọn Ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa học lên hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn Xác định môi trường tối ưu cho hoạt lực tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn:
Ý nghĩa khoa học: Là số liệu tham khảo, cơ sở bước đầu cho các nghiên cứu tương tự sau này trên các đối tượng khác
Tạo môi trường tốt cho tinh trùng cá chẽm mõm nhọn thụ tinh nhằm nâng cao tỉ lệ, hiệu quả thụ tinh trong công tác thụ tinh nhân tạo cá chẽm mõm nhọn
Trang 13CHƯƠNG I TỔNG QUAN Phân loại khoa học cá chẽm mõm nhọn [93, 18]
Giới (Kingdom): Animalia
Loài (Species): Psammoperca waigiensis (Cuvier & Valencienes, 1828)
Hình 1.1 Cấu tạo ngoài cá chẽm mõm nhọn [99]
Tên tiếng Việt: Cá chẽm mõm nhọn Tên tiếng Anh: Sand bass
Cá vược mõm nhọn Glass eyed perch
Cá thầy bói Sand perch
1.1 Đặc điểm sinh học, sinh sản cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis
1.1.1 Đặc điểm hình thái:
Thân hình thoi, dẹt bên Chiều dài thân bằng 2,7–3,6 lần chiều cao Đầu to, mõm nhọn, chiều dài hàm trên kéo dài đến ngang giữa mắt Hai vây lưng liền nhau, giữa lõm Vây đuôi tròn lồi Thân màu nâu xám, bụng trắng bạc Chiều dài lớn nhất 47cm, thông thường 19–25cm [23, 49]
Trang 141.1.2 Phân bố và tập tính:
Loài cá này phân bố chủ yếu ở Ấn Độ – Tây Thái Bình Dương, Srilanca, Australia,
Indonesia, Malaysia, Philippines, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Thái Lan [23] Ở Việt Nam cá phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan nhưng không nhiều Chúng sống trong các hang đá, vùng đáy có cỏ biển, cũng thích nghi nơi đáy là các rạn san hô Ban ngày thường ẩn mình trong các bụi rong hoặc hang đá, có khi phân bố cả vùng nước lợ Loài cá chẽm mõm nhọn ăn mạnh vào tháng 9 đến tháng 10 [18, 93]
1.2 Đặc điểm tinh trùng cá
1.2.1 Quá trình tạo tinh trùng cá (hình 1.2)
Sự phát triển của tinh trùng được chia làm ba giai đoạn chính: giai đoạn tăng sinh của tinh nguyên bào gốc, sự phân chia phân bào giảm nhiễm và sự biến đổi của tinh tử
thành tinh trùng
- Giai đoạn 1: Giai đoạn tăng sinh: Trước khi bắt đầu phát triển tuyến sinh dục, tinh sào còn non chứa tinh nguyên bào gốc (spermatogonia) tăng sinh bằng cách phân chia nguyên phân Trong giai đoạn này, số lượng của các tế bào gốc trong tinh sào tăng lên qua một số chu kỳ phân bào từ khoảng 5 đến 15 tùy thuộc vào loài Trong quá trình phân chia,
tế bào con cần duy trì trực tiếp giữa các tế bào chất với nhau Trong giai đoạn của sự gia tăng phân bào, các spermatogonia đầu tiên thông qua một giai đoạn có tốc độ phân chia
Trang 15chậm được gọi là spermatogonia A và sau đó thông qua một giai đoạn có tốc độ phân chia nhanh hơn được gọi là spermatogonia B
Hình 1.2 Sơ đồ tạo tinh trùng cá [32]
- Giai đoạn 2: Giai đoạn phân bào giảm nhiễm: Việc phân bào cuối cùng của spermatogonia B tạo ra túi tinh bào (spermatocytes) chính tham gia vào quá trình phân bào giảm nhiễm Trong suốt giai đoạn 2, spermatocytes tiếp tục sự phân chia phân bào giảm nhiễm lần đầu, trong đó bao gồm việc sao chép DNA và tái tổ hợp thông tin di truyền, dẫn đến sự hình thành của spermatocytes thứ cấp Chúng nhanh chóng đi đến phân bào giảm nhiễm thứ cấp nhưng không sao chép DNA, dẫn đến sự hình thành của các tế bào mầm đơn bội gọi là tiền tinh trùng hay tinh tử (spermatids)
- Giai đoạn 3: Sự biến đổi của tinh tử và tinh trùng Tinh tử bắt đầu quá trình biến đổi trong đó các tế bào đơn bội spermatids biệt hóa thành tinh trùng roi Quá trình này
Tinh tử Tinh trùng Tinh trùng tưởng thành
Tế bào được làm mới
Tế bào mầm Phân bào
Phân bào Phân bào
Thành thục
Phân bào Biệt hóa Sinh tinh
Tinh trùng già
Trang 161.2.2 Cấu tạo tinh trùng cá (hình 1.3)
Tinh trùng là một tế bào đặc biệt thích ứng với chức năng vận động và thụ tinh Tinh trùng có kích thước vô cùng nhỏ từ 50 – 60 µm, được bao bọc bởi màng tế bào và có các
cơ quan như nhân, ty thể, trung thể Cấu tạo của tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần cổ
và phần đuôi [1, 2, 8]
Hình 1.3 Cấu tạo tinh trùng cá [28]
- Phần đầu: Đầu tinh trùng là phần có khả năng kích thích trứng và truyền vật liệu di
truyền Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy theo loài Ở cá sụn (Chondrichthyes) đầu tinh trùng lớn, hình trụ kéo dài hay hình chỉ thường xoắn lại Cá xương (Teleostei)
đầu tinh trùng có cấu tạo đơn giản gần như hình tròn Đầu tinh trùng do thể đỉnh và nhân tạo thành Trên cùng của đầu nằm ngay dưới màng là thể đỉnh, thể đỉnh có hình chiếc mũ trùm xuống, phía dưới có chứa enzyme như hialuronydase, protease… có tác dụng hòa tan màng tế bào của trứng mở đường cho tinh trùng xâm nhập vào trứng khi thụ tinh Thể đỉnh do bộ máy gongi tạo thành Nhân tế bào tinh trùng nằm dưới thể đỉnh, to và đông đặc Trong nhân tế bào có chứa vật liệu di truyền của giao tử đực Bao quanh nhân và thể đỉnh là một lớp tế bào chất mỏng [1]
Phần đầu
Phần cổ
Phần đuôi
Trang 17- Phần cổ: Tương đối ngắn, nằm giữa đầu và đuôi Trong cổ chứa trung tử đầu và trung tử đuôi Từ trung tử đuôi phát ra các sợi trục của tinh trùng Trung tử đầu đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia các giai đoạn của trứng được thụ tinh [8]
- Phần đuôi: Đuôi tinh trùng là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài Phần đầu của đuôi tinh trùng là vòng xoắn ty thể, ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa
và photphoryl hóa, liên quan đến quá trình chuyển hóa năng lượng của ty thể Phần còn lại của đuôi là sợi chỉ trục và lớp màng mỏng bao ngoài Trong chỉ trục còn có màng lượn sóng làm cho đuôi tinh trùng có khả năng vận động [1, 8]
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá
1.2.3.1 Yếu tố lý học
Tinh dịch là sản phẩm tiết của tinh sào và ống dẫn tinh trùng, sự xáo trộn thành phần của nó sẽ dẫn đến thay đổi chất lượng tinh trùng [28, 32] Vai trò chính của các thành phần trong tinh dịch là tạo ra môi trường tối ưu cho hoạt lực tinh trùng [87] Các thông số
lý học của tinh dịch được xác định bao gồm: Mật độ tinh trùng, độ quánh, pH, áp suất thẩm thấu, tổng hàm lượng protein [42, 44] Việc nghiên cứu các thành phần, hàm lượng,
sự thay đổi của các thông số trên là rất cần thiết và hữu ích để cung cấp những thông tin
về chất lượng tinh trùng cá cũng như cho biết quá trình già hóa, thay đổi hay nhiễm bẩn cũng như bất kỳ yếu tố khác ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng [26] Tuy nhiên, thành phần và nồng độ của các thông số trên khác nhau tùy mỗi loài, thậm chí trên cùng một loài tại những thời điểm sinh sản khác nhau, vì vậy không dễ dàng để giải thích kết quả thu được [40, 83]
Thành phần tinh dịch đã được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua điển hình là nhím biển và sau đó là hàng loạt báo cáo trên cá nước ngọt như nhóm cá hồi Salmonids [56,
51], nhóm cá chép cyprinid [74, 103], loài cá da trơn châu Âu Clarias macrocephalus [28] và các loài khác như: cá tuyết Đại Tây Dương Gadus morhua [30], Perca fluviatilis [16], cá hồi vân Oncorhynchus mykiss [81], cá bò Thamnaconus modestus [65], Mugil
cephalus [30]
Mật độ tinh trùng là một yếu tố đánh giá chất lượng tinh trùng cá, song mật độ tinh trùng có sự khác nhau giữa các con đực trong cùng loài, giữa mùa sinh sản, giữa các mùa
Trang 18trong năm và giữa các loài khác nhau [57, 82] Cá Carassius auratus là một ví dụ cho sự
thay đổi mật độ tinh trùng theo bốn mùa trong năm Mật độ tinh trùng (tb/ml/con đực) vào mùa hè (57,30±10,41tb/ml) và mùa đông (65,09±80,40 tb/ml) cao hơn mùa xuân (48,0±7,08 tb/ml) và mùa thu ( 40,42±16,54×109 tb/ml) [104] Độ quánh (spermatocrit) tinh dịch là một trong yếu tố ảnh hưởng tới mật độ tinh trùng loài cá đó Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng có một sự tương quan giữa mật độ tinh trùng và độ quánh tinh dịch cá như
trên cá hồi salmo salar, cá chép Cyprinus carpio và cá bơn Đại Tây Dương Hippoglossus
hippoglossus [53, 77] Độ quánh của tinh dịch loài được xem như thước đo cho mật độ
tinh trùng loài cá đó [48] Độ quánh cũng thay đổi tùy loài, đặc biệt độ quánh liên quan đến chất lượng nguồn cá đực Độ quánh cao chứng tỏ tinh dịch con cá đó cho mật độ cao hơn với những con cá khi vuốt tinh sẽ loãng hơn [53] Mặt khác, tinh dịch thường có màu trắng đục, khi tinh dịch cá vuốt ra có nhiễm phân hay nước tiểu màu sắc sẽ tối hơn và khi
đó xác định độ quánh sẽ không chính xác Vì vậy, không nên sử dụng tinh dịch có màu quá tối so với bình thường để phân tích vì khi đó các thành phần trong tinh dịch đã bị nhiễm bẩn hay chuyển hóa
Hàm lượng protein trong tinh dịch thấp chỉ (1–3 g/l) [36] Ciereszko,1996 cho rằng mối liên hệ giữa đặc tính sinh lý của tinh trùng là do sự tác động qua lại giữa hàm lượng protein trong tinh dịch và mật độ tinh trùng nhưng vai trò đặc biệt của protein trong tinh dịch vẫn chưa được hiểu rõ [61]
Trang 19Bảng 1.1 Mật độ tinh trùng, độ quánh tinh dịch một số các loài đã nghiên cứu
Trang 20Đối với cá nước mặn, áp suất thẩm thấu của tế bào chất tinh trùng gần bằng với dung dịch nước muối NaCl 0,75%, tức là thấp hơn so với áp suất thẩm thấu của nước biển Khi vào nước mặn, tinh trùng cá biển có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu để đảm bảo cho tế bào chất không bị mất nước, nhanh chóng thích nghi với môi trường, duy trì hoạt động và khả năng thụ tinh của tinh trùng trong điều kiện môi trường có áp suất thẩm thấu cao hơn Để thực hiện được quá trình điều chỉnh nói trên tinh trùng phải tiêu hao một phần năng lượng dự trữ dẫn đến làm giảm tuổi thọ của tinh trùng Tinh trùng cá biển không có khả năng điều hòa áp suất thẩm thấu khi chúng ở trong môi trường có áp suất thẩm thấu thấp hơn so với áp suất thẩm thấu của tế bào chất Tức không có khả năng chống lại sự xâm nhập của nước vào tế bào chất Do đó, khi tinh trùng cá biển vào nước ngọt thì tế bào chất của chúng hút nước, phần đuôi co lại biến thành hình tròn tựa viên bi, những tinh trùng dạng này tuy vẫn sống song không thể vận động được và không có khả năng thụ tinh Như tinh trùng cá đối khi vào nước ngọt bị biến dạng như trên mà vẫn có thể sống được khoảng 30 phút Nếu đưa chúng trở lại vào nước biển bình thường thì nước
từ trong tinh trùng lại có thể thấm ra ngoài, đuôi kéo dài ra như cũ, tinh trùng lại dần dần khôi phục sự vận động có hiệu quả [4, 8]
Bảng 1.2 Giá trị pH, ASTT trong tinh dịch của một số loài cá
Trang 21Đối với hầu hết các loài cá pH tinh dịch là một trong những yếu tố chính kích hoạt tinh trùng vận động như nghiên cứu trên nhóm cá hồi pH tinh dịch thường 7,5 đến 8,5 và
đó cũng là pH tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng loài cá này [13] Độ pH bên trong tế bào của tinh trùng thấp hơn khoảng 1 đơn vị so với pH bên ngoài môi trường [13]
Trang 221.2.3.2 Yếu tố hóa học: vai trò các ion bao gồm: Ion Na + , K + , Ca 2+, Mg 2+ và ion Cl
-Thành phần dịch tương tinh trùng cá đã được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua và các tác giả đều đưa ra kết quả năm ion chiếm ưu thế trong tinh dịch: natri (Na+
), kali (K+), clorua Cl-, canxi (Ca2+) và magiê (Mg2+) Trong đó ion Na+
, Cl- chiếm chủ yếu sau
đó là K+, 2 ion thứ yếu là Ca2+
và Mg2+ [17, 21, 41] Việc xác định nồng độ của chúng sẽ thay đổi từ loài này sang loài khác, nhưng có một khoảng thích hợp cho mỗi ion để cung cấp những điều kiện tốt nhất cho tinh trùng [9, 26]
Nghiên cứu trên cá Caspian Roach (Rutilus rutilus caspicus), tác giả đánh giá một
cách đầy đủ nhất sự thay đổi về thành phần lý hóa trong các tháng di cư sinh sản của loài
cá này Sự thay đổi về các tỷ lệ Na+
trùng và thành phần dịch tương trong tinh dịch cá Alburnus alburnus và gợi ý rằng mối
tương quan này có thể cho biết các thành phần ảnh hưởng tới khả năng di chuyển của tinh trùng Các tác giả kết luận rằng hàm lượng ion Na+
và K+ có mối quan hệ tích cực đôi khi
là tiêu cực tương ứng với tỷ lệ phần trăm (%) tinh trùng vận động [43, 62] Trong khi đó Hwang và Idler đã công nhận sự tương quan giữa tỉ lệ Na+
/K+ với khả năng sinh sản tinh
trùng trong cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) mà không đưa ra một kết luận nào về sự
liên quan đến vận động của tinh trùng cá [53] Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu của nhiều tác giả trên những đối tượng khác nhau về cả cá biển, cá nước ngọt hay các loài cá di cư nhận xét, không chỉ có nồng độ các ion nêu trên ảnh hưởng tới sự vận động của tinh trùng
cá mà tỉ lệ giữa các ion cũng có tác động lớn đến hoạt lực tinh trùng cả về mặt tích cực
Trang 23(tức là làm tăng hoạt lực tinh trùng) lẫn tiêu cực (tức là làm giảm, đôi khi kìm hãm hoạt lực tinh trùng) [25, 91]
Trang 24
Bảng 1.3 cho thấy hàm lượng ion Na+
chiếm ưu thế so với các ion còn lại trong cả
ba nhóm cá: cá biển, cá nước ngọt, cá di cư Hàm lượng ion Ca2+
là thấp nhất trong bốn
loại cation được nghiên cứu Khả năng vận động của tinh trùng cá hồi Macrostigma salmo
trutta phụ thuộc vào hàm lượng các ion khác như Ca2+ và Mg2+ [55] Hai cation hóa trị hai này có tác dụng ức chế ion K+
về khả năng di chuyển của tinh trùng hơn so với ion
Na+ Khả năng ức chế di chuyển của tinh trùng của K+ có thể được khắc phục bằng cách tăng hàm lượng Ca2+
ngoại bào [76, 79, 92] Chính vì vậy, một khi xác định chính xác hàm lượng các ion trong dịch tương cũng là yếu tố xem xét và điều chỉnh nồng độ các ion ngoại bào [24]
1.2.4 Đặc điểm hoạt lực của tinh trùng
Tinh trùng có khả năng vận động độc lập do sự co duỗi của phần đuôi Năng lực, tốc
độ và thời gian vận động của tinh trùng phụ thuộc vào mức độ thành thục và điều kiện môi trường sống của chúng Năng lượng cung cấp cho tinh trùng hoạt động chủ yếu dựa vào sự phân giải gluxit - năng lượng dự trữ của tinh trùng Hoạt lực là tiêu chuẩn quan trọng nhất để xác định sức sống của chúng [8] Thời gian vận động ở trong nước của tinh trùng các loài cá rất khác nhau và đều rất ngắn Theo hầu hết tác giả nhận định rằng tinh trùng các loài cá biển vận động lâu hơn các loài cá nước ngọt [25, 38] Chẳng hạn như cá
chẽm châu Âu Dicentrurchus luhrux và cá bơn Scoplzthalrnus muxirilus thời gian vận
động tương ứng là 3 và 26 phút [85] Ngược lại đối với cá loài cá xương nước ngọt chưa
đến 1 phút khoảng 15-50s [58] Tinh trùng cá chép khoảng 3 phút, cá diếc Carassius
carassius 1-3,2 phút, cá Rutilus rutilus 2-4,6 phút, Tinca tinca 11,5 phút [8] Tinh trùng
cá hồi Salmo trutta macrostigma thời gian hoạt lực tối đa là 1 phút 20 giây [38] Trong một nghiên cứu gần đây, các nhà nghiên cứu đã được tìm thấy cá rô Perca fluviatilis tinh
trùng có khả năng bơi hơn hai giờ trong điều kiện nước mặn [44]
Quá trình kích hoạt sự vận động của tinh trùng là một quá trình phức tạp và cần có một lời giải thích sâu hơn Tinh trùng trong nước là những tế bào rất đơn giản, với hiệu suất sản xuất năng lượng thấp và được giải phóng vào một môi trường vận động tích cực,
mà chúng không cho phép tồn tại lâu dài Trong điều kiện như vậy cơ chế cung cấp cho
Trang 25sự chuyển động lâu dài không cần thiết và thụ tinh thành công phụ thuộc vào khả năng xâm nhập của một số lượng lớn các tinh trùng rất gần với trứng, cũng như về cơ chế có thể tạo thuận lợi cho việc tiếp xúc của chúng [44, 73] Các yếu tố kích hoạt liên quan đến khả năng vận động của tinh trùng đã được nghiên cứu, mặc dù một số khía cạnh của các
cơ chế đó thì chưa được hiểu rõ [57, 70] Hai yếu tố chính đã được xác định gây nên sự vận động đó là: các yếu tố môi trường liên quan đến tinh trùng sau khi được phóng thích
và các yếu tố diện trong tinh dịch cá [28]
1.2.4.1 Tỉ lệ pha loãng
Khi pha loãng với một tỉ lệ nhất định cho phép tất cả các tinh trùng được kích hoạt cùng một lúc và tránh sai sót trong trường hợp quan sát [35] Điều này đặc biệt quan trọng đối với các loài có mật độ tinh trùng cao và tinh trùng chuyển động nhanh Pha loãng tinh trùng sẽ làm giảm mật độ của tinh trùng, một khi mật độ quá dày sẽ ảnh hưởng đến khả năng bơi của chúng do phải cạnh tranh trong một không gian hẹp, điều này sẽ khiến cho tinh trùng tiêu hao năng lượng và mau chết hơn [95, 101] Nhưng mật độ thưa quá cũng làm giảm khả năng thụ tinh của tinh trùng do quãng đường chúng phải bơi để gặp trứng
xa hơn Do đó tỉ lệ pha loãng tối ưu là một yếu tố quan trọng để tất cả tinh trùng hoạt động tốt, cũng như cho kết quả thụ tinh cao hơn [31, 39]
Tỉ lệ pha loãng là khác nhau đối với tùy loài, nó phụ thuộc vào mật độ tinh trùng của loài đó [77] Tổng hợp các nghiên cứu trước đó trên các loài khác nhau đều đưa ra một nhận định chung rằng với loài có mật độ tinh trùng tương đối cao thì tỉ lệ pha loãng thường là 1:100 (1ml tinh trùng:99 ml dung dịch), còn đối với những loài có mật độ tinh trùng thấp tỉ lệ pha loãng đề xuất là 1:50 [54, 70, 72] Mặt khác, tỉ lệ pha loãng còn ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng [61, 101] Tinh trùng cá chép vận động dài nhất 6 phút
với tỉ lệ pha loãng 1:100 [105], còn đối với cá Tầm Acipenser persicus tỉ lệ pha loãng tốt
nhất là 1:50 [54]
Trang 26Bảng 1.4 Tỉ lệ pha loãng, nhiệt độ tối ưu cho một số loài cá đã nghiên cứu
Trang 271.2.4.2 Nhiệt độ
Thời gian, vận tốc hoạt lực của tinh trùng, khả năng thụ tinh bị ảnh hưởng nhiều bởi nhiệt độ [14] Các nguồn năng lượng của tinh trùng cá còn hạn chế, sự gia tăng vận tốc gây ra bởi sự gia tăng nhiệt độ trong các môi trường dẫn đến thời gian vận động ngắn, và ngược lại, giảm nhiệt độ bơi lội trong một thời gian dài thời gian vận động và vận tốc di động giảm Nhiệt độ thấp dẫn đến thời gian vận động kéo dài do sự giảm tốc độ của các tế bào và tăng tần số nhịp roi [27]
Có nhiều nghiên cứu chứng minh sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian vận động của tinh trùng như trong cá hồi vân thời gian di chuyển là khoảng 140s ở 5ºC và giảm chỉ còn 70s ở 10ºC [89] Hiện tượng này chủ yếu là do các nguồn năng lượng tiêu tốn nhiều khi nhiệt độ cao do đó tinh trùng phải sản xuất nhiều năng lượng hơn [48] Cũng trên cá
tuyết Đại Tây Dương Gadus morhua nghiên cứu với các mức nhiệt độ (3, 6, 11, và 21°C)
tổng thời gian vận động của tinh trùng cá tương ứng (30, 60, 120, hoặc 180s), tinh trùng bắt đầu vận động nhanh nhất sau 30 giây kích hoạt [84]
Thời gian hoạt lực của tinh trùng cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idella ngắn hơn so
với cá chép Kết quả cho thấy tinh trùng cá chép di động lâu hơn ở 20°C so với ở 26°C
hoặc 30°C và 30°C ở cá trắm cỏ, trong khi đó ở cá tầm Siberi Acipenser baeri hoạt lực
tinh trùng giảm khi nhiệt độ tăng lên từ 10°C đến 17,5°C [24]
Như vậy, với những loài sống trong môi trường có nền nhiệt độ khác nhau thì tinh trùng các loài cá đó cũng thích nghi với khoảng nhiệt độ tương tự như vậy [40]
1.2.4.3 pH
pH ngoại bào và nội bào (trong tế bào), cũng như thành phần ion của dung dịch kích hoạt, ảnh hưởng đến việc bắt đầu và thời gian vận động của tinh trùng [14] Nghiên cứu
chứng minh trên nhiều loài như: cá bơn Verasper variegatus [53], Verasper moserii [90],
Psetta maxima [91], và trên nhóm cá hồi Oncorhynchus mykiss, O keta) [61], các loài cá
nước ngọt điển hình như: Myripristis amaena, Scarus quoyi, Rastrelliger [14] Trong một
số loài cá xương biển, sự gia tăng độ pH trong tế bào đã được tìm thấy trong quá trình kích hoạt khả năng vận động [14] Ở cá vền biển Sparus aurata nước biển nhân tạo với
pH = 9,3 tinh trùng vận động nhanh nhất và tỷ lệ phần trăm cũng lớn nhất [27] Thực tế
Trang 28này cũng được quan sát trên cá bơn Psettodes erumei, trong đó vận động có thể được bắt
đầu trong điều kiện đẳng trương nếu độ pH trong tế bào tăng [86] Tuy nhiên, Aas (1991) lại cho rằng pH không có ảnh hưởng đến hoạt lực của tinh trùng cá hồi [9]
Trong các nghiên cứu gần đây cho nhận định chung rằng hầu như tất cả các loài phạm vi pH để kích hoạt vận động là khá lớn, và khác nhau, từ acid (pH = 5) đến kiềm (pH = 10) [17, 81]
1.2.4.4 Áp suất thẩm thấu
Ở hầu hết các loài cá, hoạt lực tinh trùng phụ thuộc vào độ thẩm thấu của môi trường bên ngoài do sự thay đổi nồng độ ion nội bào tăng lên hoặc giảm đi (Cosson 2004) Theo đó, yếu tố khởi đầu vận động tinh trùng được kích hoạt bởi sự thay đổi độ thẩm thấu: gia tăng độ thẩm thấu đối với các loài cá biển và giảm độ thẩm thấu đối với cá nước ngọt bằng cách thay đổi nồng độ ion [74, 48, 79, 92]
Đối với nhóm cá xương sụn (Chondrostean) thì cả hai yếu tố kích hoạt khả năng di
chuyển của tinh trùng và thời gian vận động đều phụ thuộc vào độ thẩm thấu và thành phần ion của môi trường [55] Trong khi tăng độ thẩm thấu và sự hiện diện của ion Ca2+
có thể kéo dài thời gian di chuyển, ion Ca2+
trong bất kỳ môi trường vận động làđiều kiện
tiên quyết kích hoạt khả năng di chuyển của tinh trùng [17]
Theo Morisawa và Suzuki 1980 cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu liên quan đến khả năng di chuyển cũng như năng lượng của tinh trùng trước khi tham gia sinh sản [75]
Trong cá xương sụn Chondrostean, chẳng hạn như cá tầm và cá hồi tác giả lại cho rằng
không phải độ thẩm thấu quyết định sự di chuyển của tinh trùng mà ion K+
mới là yếu tố chủ yếu điều hòa khả năng vận động của tinh trùng loài cá này [92] Còn đối với cá biển việc bắt đầu các khả năng vận động của tinh trùng cũng liên quan đến sự gia tăng nồng độ bên trong của ion Ca2+
có thể bắt nguồn từ trong tế bào [79]
Đối với loài cá nước ngọt hay một số loài cá nước biển tinh trùng hoạt động khi tiếp xúc với môi trường nhược trương hay ưu trương [76] Trong một số loài, chẳng hạn
như cá vền biển Sparus aurata, Solea senegalensis, cá nóc Takifugu niphobles khả năng
vận động đã được kích hoạt bằng cách sử dụng môi trường từ các loại đường hoặc các hợp chất khác không chứa ion điều này chứng minh rằng các nhân tố chính gây ra sự vận
Trang 29động của tinh trùng là áp suất thẩm thấu [68, 80] Thay đổi trong áp suất thẩm thấu (0-300 mOsm/kg) có thể bắt đầu tính di động trong hầu hết các cá [74]
Một điều đặc biệt đối với các loài có khả năng chịu được độ mặn cao (Euryhaline) là chúng phụ thuộc vào thời gian thích ứng với môi trường nước, cá thích nghi với nước biển tinh trùng sẽ được kích hoạt trong độ thẩm thấu lên tới gần 1000 mOsm/kg (tương tự
như ASTT của nước biển) [68]
Ion Kali
Một đánh giá gần đây bởi Alavi và Cosson đã mô tả các tương tác và ảnh hưởng của
Ca2+ và K + 2 ion lớn hiện diện trong dịch tương tinh trùng [83] Chúng được coi là các ion chìa khóa để kích hoạt vận động của tinh trùng trong loài cá biển, nhóm cá hồi Salmonids và cá tầm Acipenseridae Trong cá hồi Salmonids, dịch tương có chứa K +
nồng độ cao (từ 20 đến 60 mM) có thể liên quan đến sự bất động của tinh trùng trong tinh dịch [74] [46] Vận động được kích hoạt bởi sự suy giảm nồng độ K+
môi trường bên ngoài qua màng tế bào Tuy nhiên nói như vậy không phải chỉ có K+
liên quan đến sự kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng mà các ion khác cũng góp phần đáng kể cho chức năng này [76] Một số nghiên cứu xác nhận các cation hoá trị hai như Ca2+
và Mg2+ trong môi trường thụ tinh, thường đối kháng lại hay ức chế ion K+
[18] Alavi và Cosson đưa ra giả thuyết rằng các yếu tố ức chế nồng độ cao của K+
có thể phụ thuộc vào sự nhạy cảm
Trang 30của các tinh trùng với ion này thay đổi giữa con đực và mùa sinh sản, có thể do những thay đổi theo mùa làm thay đổi nồng độ K+
và Ca2+ trong dịch tương [92]
Cho đến nay, cơ chế điều chỉnh vận động trong tinh trùng cá tầm và tinh trùng cá
tầm thìa Polyodon spathula vẫn chưa được xác định, nhưng đã được trình bày khá tương
đồng với tinh trùng cá hồi salmonid [67]
Alavi và nhóm nghiên cứu của ông cho thấy nồng độ kali trong dịch tương
cá tầm Acipenser persicus là 6,92±0,88 mmol/l Và tác giả cũng kết luận rằng K+ là một chất ức chế chủ yếu của khả năng di chuyển của tinh trùng cá tầm A persicus còn với cá
Macrozoarces americanus L nồng độ K+ từ 10–20 mmol/l, giá trị này tương ứng với nồng
độ trong dịch tương [19] Tinh trùng cá chép ít nhạy cảm với K+, nhưng khả năng vận động của chúng được phục hồi sau khi cho chúng ở trong môi trường K+
với nồng độ cao khi các tế bào ở trạng thái bất động [105] Như vậy K+ là một ion quan trọng kiểm soát vận động của tinh trùng cá [98]
Trang 32sự giải phóng các Ca2+
từ lưu trữ, nhưng trong trường hợp này không có các dòng của canxi từ bên ngoài vào, sự phóng thích canxi từ lưu trữ gây ra bởi các cơ chế khác mà không phải là kích hoạt vận động của tinh trùng, cho thấy rằng đường đi của Ca2+
bên ngoài cũng là một yếu tố cần thiết cho quá trình kích hoạt tinh trùng vận động khi chúng được phóng ra môi trường ngoài [12]
Kết quả tương tự được ghi nhận bởi Alavi và Cosson trên tinh trùng cá hồi thay đổi nồng độ bên trong tế bào của ion Ca2+
từ 30 nM đến 180 nM trước và sau khi vận động [32]
Trong các loài cá khác như cá nóc Takifugu niphobles hoặc loài thích nghi với nước ngọt như cá rô phi Oreochromis mossambicus bằng chứng thuyết phục cho thấy rằng nếu
không có ion Ca2+ ngoại bào thì Ca2+ nội bào tăng lên trong suốt quá trình kích hoạt sự vận động [55]
Đối với những loài có thể kích hoạt sự vận động ở môi trường ưu trương không chứa ion, có thể tăng canxi bên trong tế bào là cần thiết để kích hoạt tinh trùng hoạt động hoặc để tạo ra các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng với lượng canxi có trong tinh dịch Như vậy có thể thấy rằng nồng độ canxi trong tế bào
đã được cho là thành phần quan trọng trong kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng
Một nghiên cứu khác cũng về nội dung này trên cá Tầm Acipenser ruthenus hoạt lực tinh
trùng đã hoàn toàn bị ức chế tại 0,35 mM Ca2+ và tác giả cũng cho biết thêm chính ion K+
Trang 33hoạt vận động tinh trùng cá của ion này và chỉ gần đây vai trò của Na+ mới được biết đến
qua một nghiên cứu trên tinh trùng cá trích Sardinella aurit, Vines và đồng nghiệp phát
hiện sự trao đổi qua lại hàm lượng Na+
/Ca2+ trong tinh trùng của loài này và công nhận rằng bắt đầu vận động xảy ra bằng cách đảo ngược sự trao đổi Na+
/Ca2+ [23].Cơ chế này cho phép tinh trùng thay đổi về phía trước để đảo ngược kênh điều hành dưới sự kiểm soát nồng độ ion bên trong và bên ngoài tế bào.Thời gian vận động của loài này có thể dài hơn 60 phút, có vẻ như rõ ràng rằng các tế bào có thể điều chỉnh tăng canxi bên trong bằng cách hoạt động trong một chế độ đảo ngược Điều này sẽ cho phép khả năng vận động trong thời gian dài cũng như duy trì tinh trùng tiếp xúc với nước biển trong một trạng thái ít tiêu hao năng lượng trước khi tiếp xúc với trứng cho đến khi quá trình thụ tinh xảy ra [98]
Ion Mg 2+ : Đây cũng là một ion thứ yếu trong dịch tương tinh trùng cá mà có liên
quan đến kích hoạt vận động của tinh trùng Theo các nghiên cứu trên cá nước ngọt, ion
Mg2+ ức chế sự hoạt động của ion K+, song trên cá biển vẫn chưa có chứng minh nào cho điều đó Sự ức chế khả năng vận động của tinh trùng trong tinh dịch chủ yếu là do ion K+
trong cá hồi và áp suất thẩm thấu trong cá chép nhưng Mg2+
cũng có phần ảnh hưởng tới tính bất hoạt của tinh trùng [31]
1.3 Tình hình nghiên cứu đặc tính lý, hóa và hoạt lực tinh trùng cá trên thế giới và Việt Nam
1.3.1 Trên thế giới
Thành phần dịch tương cá đã nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua, điển hình là loài nhím biển, cấu trúc của tinh trùng đã được nghiên cứu trong 280 loài chủ yếu ở trên các loài cá nước ngọt: Salmonids [60] và trong họ cá chép cyprinid [24] Đối với cá nước ngọt những đối tượng chính được quan tâm đó là: họ cá hồi Salmonidae [40], cá trắm cỏ
Ctenopharyngodon idella [83], cá rô phi Oreochromis mossambicus [72] Đối với các loài
cá biển các nghiên cứu tập trung vào một số đối tượng như: cá chẽm, cá bơn
Hippoglossus hippoglossus, cá bơn Scophthalmus maximus (L.), cá bò Thamnaconus modestus, cá tuyết Gadus morhua macrocephalus, cá nóc sao Takifugu niphobles, cá bơn Limanda yokohamae, Kareius bicoloratus cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax, Mugil
Trang 34cephalus, Trachurus mediterraneus, Mullus barbutus, Boops boops, Diplodus sargus, cá
bống Gillichthys mirabilis [83]
Một thống kê có ý nghĩa về mối tương quan giữa tinh dịch và mật độ tinh trùng một
cách thuyết phục trên sáu loài: cá hồi vân Oncorhynchus mykiss [59], cá hồi Coho
Oncorhynchus kisutch [76] Cá hồi Đại Tây Dương Salmo salar [79], Whitefish Coreogonus clupeaformis, Yellow perch, Perca flaisescens [71] và Rabbit fish Siganus guttatus [25], cá bơn Scophthalmus maximus [91], cá tuyết Đại Tây Dương Gadus morhua [84].
Về mật độ: các nghiên cứu về mật độ riêng lẻ thực tế là không nhiều, song có không
ít nghiên cứu chỉ ra mật độ có liên quan đến khả năng vận động của tinh trùng [53] Điển
hình loài cá chẽm châu Âu Dicentrarchus labrax, tác giả đã cho biết mật độ tinh trùng là
60x109tb/ml, song mật độ này sẽ giảm dần theo mùa sinh sản, càng về cuối mùa sinh sản mật độ giảm, điều đáng nói là thời gian vận động của tinh trùng loài cá này tương đối thấp
40 giây, trong 10 giây đầu tiên tinh trùng vận động 100% và khả năng thụ tinh, tiếp cận trứng cũng tốt nhất ở giai đoạn này Và ở 10 giây cuối cùng thì hầu như tinh trùng không
hoạt động.[46, 50]
Để đáp ứng toàn diện hơn nữa, các nghiên cứu không chỉ tập trung vào cá đực bình thường mà còn có những nghiên cứu về những thay đổi trong khả năng vận động của tinh trùng trên một số loài cá mà điển hình là cá hồi vân đực đảo ngược giới tính [50, 51] Mục đích của nghiên cứu tác giả muốn so sánh chất lượng tinh trùng của những con cá đực bình thường và những con cá đực đảo ngược giới tính Điều đó cho thấy việc nghiên cứu
về đặc tính tinh trùng cá là yếu tố quan trọng trong việc đa dạng hóa đối tượng nuôi cũng như trong công tác thụ tinh nhân tạo [70]
1.3.2 Việt Nam
Tại Việt Nam tính đến thời điểm này chưa có bất kỳ một nghiên cứu nào về đặc tính
lý hóa và hoạt lực tinh trùng cá biển Trên cá nước ngọt chủ yếu nghiên cứu đồng thời cùng quy trình bảo quản tinh trùng Tác giả Hồ Kim Diệp Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, đã nghiên cứu thành công quy trình bảo quản tinh trùng một số loài cá nước ngọt như cá Chép, Trắm cỏ, Bỗng, Mrigan Trước khi nghiên cứu bảo quản nhóm tác giả
Trang 35cũng đánh giá chất lượng tinh trùng nhưng không nghiên cứu sâu về thành phần dịch tương của loài cá nào
Nguyễn Minh Thành và ctv (2003) Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 (RIA
2) đã bảo quản thành công tinh cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) dài hạn bằng nitơ
lỏng Các tác giả cũng có báo cáo đánh giá chất lượng tinh trùng cá tra về mặt mật độ và hoạt lực của tinh trùng nhưng chưa thật sâu sắc
Thiết nghĩ, Việt Nam có nền nuôi biển nói chung và cá biển nói riêng đã phát triển vượt bậc, cùng với xu hướng phát triển nghề nuôi trồng thủy sản thì sinh sản nhân tạo cần
có những bước nhảy vọt Nếu nắm được các đặc tính sinh lý hóa tinh trùng cũng như cơ chế cho sự kích hoạt tinh trùng hoạt động sẽ giúp tạo ra một giải pháp tối ưu cho nâng cao thành công thụ tinh nhân tạo Vì vậy, với nghiên cứu đánh giá chất lượng tinh trùng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực tinh trùng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu sau này để hoàn thiện và nâng cao hiệu quả sản xuất nhân tạo cá chẽm mõm nhọn tại Việt Nam
Trang 36CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu:
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm sinh học nghề cá – Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại Học Nha Trang
2.2 Đối tượng nghiên cứu
Cá chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier & Valencienes, 1828)
Cá đực thu thập từ tự nhiên, mang về chia ra làm 2 lồng nuôi vỗ một thời gian tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa
Cá đực được cho ăn bằng cá tạp (khẩu phần ăn là 5% khối lượng cơ thể) có bổ sung vitamin và các khoáng chất đồng thời chăm sóc để cá thành thục tốt nhất Sau 2 – 3 tuần tiến hành kiểm tra Khi cá đạt chất lượng tinh tốt thì tiến hành vuốt tinh để tiến hành các thí nghiệm trong luận văn này
2.3 Bố trí thí nghiệm
Tinh dịch được thu từ cá chẽm mõm nhọn đực thành thục sinh dục, cho vào các eppendorf 1,5ml và được giữ lạnh bằng thùng xốp có đá bào để bảo đảm chất lượng mẫu Mẫu tinh trùng sau khi thu được đưa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành phân tích
2.3.1 Đặc tính lý, hóa học của tinh dịch được thực hiện theo sơ đồ khối sau đây:
Hình 2.1 Quy trình xác định một số đặc tính lý hóa của tinh dịch cá
Sau khi thu thập được tinh dịch cá, tiến hành xác định một số đặc tính lý hóa của tinh trùng cá Cách tiến hành xác định:
Ly tâm: 15 000 rpm khoảng 10 phút
Tinh dịch cá chẽm Mật độ tinh trùng
1,5 ml Eppendorf
tube
75 mm capillary tube Thể tích tinh trùng
Trang 37 Thể tích của tinh dịch được xác định bằng 1,5ml eppendorf tube
Mật độ tinh trùng được xác định bằng phương pháp đếm ở buồng đếm hồng cầu Tinh dịch đã được pha loãng 1000 lần trong một dung dịch Formalin 4% Một giọt tinh dịch pha loãng đã được đặt trên buồng đếm hồng cầu (độ sâu 0,1mm) với bên ngoài Sau 10 phút (một thời gian để cho tinh trùng lắng xuống), số lượng tinh trùng được tính theo công thức:
M = A x 4000 x R x 1000
80 Trong đó:
M: Mật độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch (tế bào/ml) A: Tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm
R: Hệ số pha loãng tinh dịch
4000: Nghịch đảo thể tích của 1 ô nhỏ
80: Tổng số ô vuông nhỏ trong buồng đếm
Độ quánh của tinh trùng được xác định bằng Hawksley micro-hematocrit reader
Xác định pH, áp suất thẩm thấu và các đặc tính hóa học: Cho tinh dịch vào 1,5 ml eppendorf tube sau đó li tâm (15000 rpm) khoảng 10 phút Sau khi li tâm tiến hành tách phần dịch tương ở phía trên rồi tiến hành xác định pH, áp suất thẩm thấu
pH được xác định bằng máy đo pH
Áp suất thẩm thấu xác định bằng máy đo áp suất thẩm thấu
Hoạt lực tinh trùng: Tinh trùng được pha loãng với nước biển nhân tạo ở tỉ lệ thích hợp nhất Hoạt lực (vận tốc, phần trăm hoạt lực, thời gian) của chúng được quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 400X Vận tốc của tinh trùng được tính bằng khoảng cách của chúng di chuyển trong 1 giây Phần trăm hoạt lực được xác định bằng số tinh trùng hoạt lực so với số tinh trùng quan sát được Thời gian hoạt lực được tính từ lúc pha loãng cho đến 100% tinh trùng bất hoạt
Các đặc tính hóa học của tinh trùng được xác định bằng máy Fuji Dri- Chem 3500
2.3.2 Xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực tinh trùng
Xác định các thông số này thông qua sơ đồ khối sau:
Trang 38Hình 2.2 Quy trình xác định các yếu tố tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng
Trước tiên, tiến hành quan sát hoạt lực của tinh trùng được pha loãng với nước biển nhân tạo ở các tỷ lệ khác nhau để chọn ra tỉ lệ pha loãng tối ưu cho hoạt lực tinh trùng và sau đó sử dụng tỉ lệ pha loãng này cho các quan sát tiếp theo như về nhiệt độ, pH, ASTT, ảnh hưởng của các cation sẽ được tiến hành trong môi trường có tỷ lệ pha loãng tốt nhất
đã được chọn ra
Xác định ảnh hưởng của các độ pha loãng khác nhau lên sự vận động của tinh trùng: trong quan sát này thì nước biển nhân tạo được sử dụng để đánh giá hoạt lực tinh trùng và thành phần nước biển nhân tạo bao gồm: 27g NaCl, 0,5g KCl, MgCl2
g 1,2 g CaCl2, 4,6, 0,5 g NaHCO3 được pha trong một lít nước cất
Trong quan sát tỉ lệ pha loãng tinh dịch với các tỉ lệ (tinh dịch : nước biển nhân tạo) như sau: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200, sau đó kiểm tra hoạt động của tinh trùng bao gồm các thông số: phần trăm tinh trùng hoạt động, tổng thời gian và vận tốc hoạt động của tinh trùng
→ Sau khi xác định được tỉ lệ pha loãng tốt nhất ta tiến hành thực hiện các quan sát tiếp theo
ASTT
Tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Tỷ lệ pha loãng tốt nhất cho tinh trùng
Đánh giá thông số hoạt lực của tinh trùng (thời
gian, vận tốc, phần trăm)
Trang 39 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự vận động của tinh trùng: Các mẫu tinh
dịch đã được pha loãng ở tỉ lệ tối ưu điều chỉnh ở các nhiệt độ khác nhau: 10; 20; 30; 40 (oC) Điều chỉnh nhiệt độ ở các mức độ khác nhau bằng cách dụng cụ heater
để tăng nhiệt độ, và dùng đá giảm nhiệt độ Sau đó kiểm tra hoạt lực tinh trùng (thời gian, phần trăm, vận tốc hoạt lực tinh trùng)
Xác định ảnh hưởng của pH lên sự vận động của tinh trùng: Các mẫu tinh dịch
đã được pha loãng ở tỉ lệ tối ưu điều chỉnh ở các mức pH khác nhau: 6; 7; 8; 9 và kiểm tra hoạt lực của tinh trùng
Xác định ảnh hưởng của các ion (K+
; Na+; Ca2+; Mg2+) lên sự vận động của tinh trùng: các mẫu tinh dịch được kích hoạt trong dung dịch chứa 0; 0,2; 0,4; 0,6 M KCl, NaCl, CaCl2, MgCl2 Đánh giá hoạt lực của tinh trùng
Xác định ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên sự vận động của tinh trùng: sử
dụng dung dịch NaCl ở các nồng độ 200; 300; 400; 500 mOsm/kg để kiểm tra tác
động của áp suất thẩm thấu đối với vận động của tinh trùng
Hình 2.3 Các dụng cụ tiến hành thu thập số liệu
Trang 40Tất cả các thí nghiệm đều được pha loãng với tỉ lệ 1:100, mẫu thí nghiệm pha trong 25ml, sau đó dùng pipet hút 3ml cho lên kính hiển vi có gắn camera trên máy vi tính được gắn trước
Hình 2.4 Cách tiến hành thí nghiệm quan sát
→ Dụng cụ để phân tích về sự vận động của tinh trùng là thiết bị có sự hỗ trợ của máy vi tính có gắn camera Các file video được ghi lại và tiến hành phân tích chúng dựa vào phần mềm CASA (Computer aided for sperm analysis) Trong phần này thì các thông
số phần trăm hoạt lực, vận tốc và thời gian hoạt lực tinh trùng được sử dụng trong các quan sát này
Mỗi thí nghiệm được tiến hành quan sát 3 lần Trung bình của mỗi quan sát là thông số kết quả cho nghiên cứu này
2.4 Phân tích số liệu
Số liệu về ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng, pH, nhiệt độ và hàm lượng cation lên vận động của tinh trùng được phân tích bằng SPSS 16.0 Phân tích ANOVA và kiểm tra Duncan (vận động của tinh trùng) ở mức P <0,05 Số liệu được trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± sai số chuẩn hoặc độ lệch chuẩn