NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY LÔ HỘI

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY LÔ HỘI

bằng kỹ thuật giâm cành, giâm hom

2 Nhân giống vô tính cây Lô hội

I Đặt vấn đề:

Cây Lô hội là loại cây hạt kín có hoa, thuộc họ Huệ tây (một họ có các loại cây mọng nước, trong đó có xương rồng), mọc nhiều ở các vùng có khí hậu nóng và khô Đây là cây dược liệu được dùng trong cả tây y và đông y

Cây Lô hội với các đặc tính y khoa của nó đã được nhiều thế hệ và nền văn minh trên khắp thế giới biết đến Ngày nay, có nhiều nhà nghiên cứu đã xem nó như một loại thảo dược chữa

"bách bệnh"

Ngoài ra, trong những năm gần đây, chất gel chiết rút từ cây Lô hội còn được dùng nhiều trong các ngành công nghệ dược phẩm, hoá mỹ phẩm như: kem thoa lên da, thuốc viên hay thuốc mỡ để trị bệnh với các thương hiệu thuốc Lô hội, mỹ phẩm Lô hội, và thực phẩm dưới dạng nước uống xirô

Ở Việt Nam, cây Lô hội có nhiều dòng khác nhau, trong đó cây Aloe Vera được ghi nhận

là một trong những cây thuốc cổ truyền Việt Nam, cây phân bố nhiều ở các vùng ven biển miền Trung, được nhân dân ta sử dụng trong các bài thuốc Đông y, và là nguồn nguyên liệu thảo dược trong hóa mỹ phẩm

Trước những tính năng tuyệt vời của cây Lô hội, vấn đề nhân giống và phát triển cây Lô hội được đặt ra Tuy nhiên, vấn đề cây giống cho các vùng nguyên liệu còn gặp khó khăn vì trong tự nhiên cây Lô hội rất khó nhân giống bằng hạt Vì vậy người dân vẫn thường nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp truyền thống đó là phương pháp tách chồi thụ động có hệ số nhân giống không cao, cây sinh ra có sức sống thấp vì thế không thể sản xuất được số lượng lớn cây giống theo quy mô công nghiệp

Trong những năm gần đây, nhằm tạo ra các giống cây trồng chất lượng tốt, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiều địa phương trong cả nước đã ứng dụng phương pháp giâm hom vào công tác nhân giống.Tuy nhiên phương pháp này cho kết quả không cao ở nhiều đối tượng cây trồng và chưa đáp ứng được số lượng lớn cây giống

Công nghệ nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong những phương thức nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm nổi trội là: cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó hoàn toàn có

II Giới thiệu tổng quan về cây Lô hội:

Lô hội để làm thuốc tẩy xổ

Ðến năm 1550 trước Công nguyên, có ghi chép của người Ai Cập cổ đại trên giấy sậy Người Ai Cập cổ dùng lá Lô hội đơn thuần hoặc phối hợp với nhiều dược thảo thành 12 dạng bào chế khác nhau, dùng chữa nhiều bệnh bên trong và bên ngoài

Khoảng 400 năm trước Công nguyên, lá Lô hội khô và nhựa Lô hội được bán sang châu Á Khoảng 50 năm trước Công nguyên, Celsius, một thầy thuốc Hy Lạp đã sử dụng nhựa Lô hội trong y học làm thuốc tẩy Từ đây Lô hội ngày càng được sử dụng rộng rãi trong y học Hy Lạp

- La Mã và y học phương Tây sau này

Khoảng thế kỷ thứ 7-8, đời Tùy - Ðường, Lô hội được sử dụng ở Trung Quốc Quyển sách thuốc sớm nhất của Trung Quốc (đời Ðường) có chép về Lô hội là sách Bản thảo, (Tân tu bản thảo của Lý Tích) Người Trung Quốc gọi cây này là Lô hội, có nghĩa là loài cây cho nhựa đen Các thầy thuốc Trung Quốc dùng Lô hội để chữa các bệnh sốt cao, co giật ở trẻ em cũng như dùng làm thuốc tẩy xổ

Vào thế kỷ 16-17, Lô hội theo chân người Tây Ban Nha sang châu Mỹ Cây trở nên phổ biến tại đảo Caribê, trung và nam Mỹ Từ đây vùng đất mới này lại trở thành nơi sản xuất Lô hội chính để xuất khẩu sang châu Âu

Năm 1720 cây Lô hội được Carl Von Linne mô tả và đặt tên Aloe Vera Linne, đó cũng là tên khoa học của cây dùng tới ngày nay Năm 1820, Lô hội chính thức được công nhận trong Dược điển Mỹ với tác dụng tẩy xổ và bảo vệ da

Ngày nay ở Nhật Bản Lô hội thường được sử dụng như là một thành phần trong sữa chua thương mại Ngoài ra còn có nhiều công ty sản xuất đồ uống Lô hội Người dân ở Tamil Nadu, một bang của Ấn Độ, thường chuẩn bị một món cà ri sử dụng Lô hội đó là chuyện cùng với bánh mì Ấn Độ (nan bánh mì) hoặc cơm

2 Đặc điểm:

2.1 Tên gọi:

Cây Lô hội là loại cây bụi như xương rồng,

còn được gọi bằng một số tên khác như: Tượng

đảm, Long tu, Du thông, Lưỡi hổ, Hổ thiết

thuộc chi Aloe, họ Huệ tây (Asphodelaceae)

Trong khoảng 200 loài thuộc chi Aloe thì chỉ

có 4 loài được sử dụng để làm thuốc bổ dưỡng và

chữa bệnh, một số loài có độc tố Hai loài được

chú ý nhiều nhất là Aloe Ferox Mill và Aloe vera

Linne

Theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của Phạm

Hoàng Hộ thì chi Aloe ở nước ta chỉ có 1 loài là

Aloe vera L Sinensis Berger tức là cây Lô hội lá

nhỏ

Phân loại khoa học

Giới(regnum): Plantae

(không phân hạng):

Angiospermae

(không phân hạng)

Monocots

Bộ(ordo): Asparagales

Họ(familia): Asphodelaceae Chi(genus): Aloe

Loài(species): A vera

Tên hai phần

Aloe vera

( L ) Burm.f , 1768

2.2 Đặc điểm sinh học:

Lô hội là một loại cây mọng nước

Lô hội trưởng thành có lá mập, dài 30–50 cm, rộng

5–10cm, dày 1-2 cm

- Lá Lô hội gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp vỏ

xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng có mùi

hắc, để khô chuyển thành màu đen, phần trong là phần

thịt mọng nước dạng gel Đây chính là chất gel mang

nhiều đặc tính y học, khi phơi khô ta có chất Nha Đam

(Aloes) màu nâu đen hay ánh lục

- Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành

chùm, hoa to đều có màu vàng lục nhạt

- Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt

Nếu rạch một đường giữa lá Lô hội tươi rồi dùng thìa

nạo ở giữa lá Lô hội quan sát sẽ có một chất gel trong

suốt

- Các cấu trúc lá lô hội được tạo thành từ bốn lớp:

 Vỏ : lớp bảo vệ bên ngoài;

 Sáp: một lớp chất lỏng đắng giúp bảo vệ các nhà máy từ động vật;

 Chất nhầy Gel: phần bên trong của chiếc lá đó là buộc lại ra để làm cho Aloe Vera gel

 Aloe Vera (trong gel) gồm 8 thiết yếu Amino axit mà cơ thể con người cần nhưng không thể sản xuất

2.3 Phân bố địa lý:

Ở nước ta, cây Lô hội có thể trồng được ở nhiều nơi, nhưng sinh trưởng và phát triển tốt ở những khu vực có số ngày nắng trong năm cao như khu vực Miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt là Ninh Thuận và Bình Thuận

Khi trồng cây Lô hội không phải đầu tư ban đầu nhiều, kỹ thuật chăm sóc đơn giản và trồng một lần có thể thu hoạch lâu dài

Ngoài ra, trong cây Lô hội còn chứa các hoạt chất:

- Các vitamin: A, E (tan trong dầu mỡ), B1, B2, B6, follic acid, B3, C, Niacin (tan trong

nước) Năm 1983, Arnold Fox cho biết cây Lô Hội là loại thực vật duy nhất chứa B12 Đây là nguyên chất sinh tạo máu của các loại động vật, thiếu B12 con người dễ bị những chứng bệnh : đau tim, bao tử, nhức đầu, đau xương, đau thần kinh, cúm, mệt mỏi, đau bắp thịt

- Chất khoáng: Calcium, zine, managanese, potassium, magnessium, chromium, sodium, copper, chromium

- Mono và Polysaccharit: Aldonantose, cellulose, glucose, L.Rhamnose, manose

Hình 2.1 Chất gel cây Lô hội

- Các axit amin thiết yếu: có 8/10 axit amin và có 11//14 axit amin không thiếu yếu: Alanice, arainine, acid aspartic cytine, acid glytamic, glycerine, histidien, hydroxyproline, isolecine, leucine, lysine, prolin méthionine

- Các enzym: Amylaza và Proteaza (tiêu hóa đường và đạm) Creatin Phosphokinaza (enzym thuộc nhóm cơ); Lipaza (hấp thụ chất béo), Bradikinaza (giảm đau, chống viêm, kích thích hệ miễn dịch)

4 Tác dụng:

Từ 1700 năm trước Công nguyên, con người đã biết sử dụng cây Lô hội để trị bá bệnh như:

da, lành vết thương Sau đó, người ta đã dần dần phát hiện thêm nhiều tác dụng chữa bệnh khác của cây Lô hội:

- 1930 – 1940: trị phỏng, mịn da, tăng cường sức khỏe

- 1960 – 1970: trị loét dạ dày, làm lành các vết thương

- 1981: Hội đồng Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ: Bảo vệ các viện bào chế các sản phẩm Lô hội

- 1986: hành loạt các sản phẩm được tổng hợp từ Lô hội

4.1 Tác dụng dược lý:

 Theo y học cổ truyền:

- Lô hội có vị đắng, tính hàn

- Vào 4 kinh: can, tỳ, vị, đại tràng

- Có tác dụng thông đại tiện, mát huyết, hạ nhiệt

- Kinh nghiệm trị cam tích, kinh giản trẻ em, trị táo bón, ăn uống không tiêu, giúp tiêu hóa, đắp ngoài trị phỏng, rôm sảy, lác…

 Theo y học hiện đại:

a Làm lành vết thương:

Lô hội có chứa nhiều khoáng chất như Calci, Potassium, Kẽm… có chứa nhiều vitamin C

và E Các chất này là tiền chất cơ bản để đẩy nhanh tiến trình làm lành da Calci giữ vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh và mô cơ, nó cũng là chất xúc tác chính trong tất cả các quá trình chữa lành vết thương

b Chống viêm nhiễm dị ứng:

Lô hội có tác dụng làm lành vết đứt, vết loét, vết phỏng hay vết sưng do côn trùng cắn đốt trên da vì nó có chứa những hợp chất hữu cơ gồm vitamin, các hormon, chất Magnesium lactate… có tác dụng ức chế phản ứng Histamin, ức chế và loại trừ Bradykinin là những thành phần gây phản ứng dị ứng và viêm

c Chống sự lão hóa tế bào:

Lô hộicó chứa Calci có liên quan đến tân dịch trong tế bào cơ thể, duy trì sự cân bằng giữa trong và ngoài tế bào, tạo ra các tế bào khỏe mạnh

- Lô hội có chứa 17 amino – acid cần thiết để tổng hợp protein và mô tế bào

- Lô hội có chứa các chất khoáng như Calci, Phospho, Đồng, Sắt, Magne, Potassium,

Sodium… là các yếu tố cần thiết cho sự trao đổi chất và các hoạt động của tế bào

d Giải độc cho cơ thể:

Lô hội có chứa Potassium cải thiện và kích thích chức năng gan, thận, hai cơ quan chủ yếu của việc loại trừ chất độc trong cơ thể

- Lô hội có chứa Uronic acid, loại trừ chất độc trong tế bào

- Lô hội có phần chất xơ cuốn sạch các thành phần chất thải nằm kẹt trong các nếp gấp của ruột

e Sinh năng lượng và dinh dưỡng:

Lô hội có chứa Vitamin C thúc đầu quá trình trao đổi chất, sinh năng lượng cần thiết, và duy trì hoạt động miễn dịch giúp phòng được nhiều bệnh

- Lô hội có chứa các amino – acid để tạo protein giúp hình thành tế bào và mô

- Lô hội chứa các Enzym cần thiết để phân giải các chất đường, đạm và béo trong dạ dày và ruột

f Vai trò tá dược:

- Lô hội có chứa chất Lignin, là chất giúp thấm sâu và luân chuyển cùng với các yếu tố khác

mà nó liên kết, đây là lý do nhiều sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm pha trộn với Lô hội

- Lô hội còn có polysaccharide, các chất khoáng, vitamin, amino acid… cùng với chất

Lignintẩy sạch tế bào chết, kích thích tái sinh tế bào mới, và dinh dưỡng cho da

Một số loại bệnh cây Lô hội có thể chữa được : táo bón, mất ngủ, tăng huyết áp, viêm gan, vàng da, ngứa, mề đay, phong thấp, viêm đường tiết niệu, đứt tay chân, chảy máu, mặt mụn, nám, nhặm mắt, đỏ mắt, tiểu đường, phỏng nước sôi, phỏng lửa, khí hư bạch đới, rôm sẩy, mụn nhọt, vảy nến, da mịn, gia tăng sức khỏe, sinh lực

Lô hội chữa được AIDS, ung thư: các nghiên cứu thấy rằng Lô hội có chứa trên 20 loại polypeptids có tác dụng kích thích khả năng miễn dịch, cũng như có ít nhất là 3 chất chống khối u Như vậy Lô hội sẽ góp phần chống các bệnh về siêu vi (trong đó gồm cả HIV) cũng như ung thư Tuy vậy quá trình nghiên cứu vẫn đang tiếp tục, nên chưa thể khẳng định Lô hội

sẽ thay thế được các thuốc đặc trị, mà chỉ nên dùng như một liệu pháp dinh dưỡng bổ sung

4.2 Các ứng dụng điều trị lâm sàng:

- Trị táo bón: bột Lô hội, cao mật bò, bột cam thảo và tá dược; hay dùng: Lô hội tươi 100g, đậu xanh cả vỏ 20g, đường cát 50g nấu ăn

- Trị đau lưng: Lô hội tươi 50g, đậu đen 50g, đường cát 100g nấu ăn

- Trị mụn nhọt - Abces: giã nhuyễn cả lá lẫn vỏ đắp lên vùng sưng đỏ

- Trị rôm sảy mụn: lấy nước cốt Lô hội tươi thoa lên vùng da bệnh

4.3 Lô hội chăm sóc sắc đẹp:

- Lô hội là một trong những thành phần quan trọng của mỹ phẩm, làm sạch da nhưng vẫn giữ cho da mịn màng và mềm mại Chất Ligmin thấm sâu tới hạ bì, tẩy sạch vi khuẩn, bụi bặm sau đó các chất dinh dưỡng tự nhiên trong lô hội lại nuôi dưỡng da kích thích tái sinh tế bào mới

- Lô hội được sử dụng làm kem, giữ ẩm cho da, kem dưỡng da, kem chống nắng

5 Kĩ thuật thu hoạch và chế biến:

Lô hội muốn có dược tính cao yêu cầu phải có qui trình trồng trọt và thu hái hợp lý Các

lá đầu tiên thu hái là các lá tốt nhất được ưu tiên dùng trong mỹ phẩm Sau khi rửa sạch lá bằng hơi nước, người ta lấy phần thịt bên trong lá, loại bỏ celluloza rồi xác định thành phần và hoạt tính sinh học để chế tạo gel

Hình 2.2 Các sản phẩm từ cây Lô hội

III Các phương pháp nhân giống vô tính cây Lô hội:

1 Nhân giống vô tính cây Lô hội bằng kỹ thuật giâm cành, giâm hom:

1.1 Cơ sở khoa học:

 Cơ sở khoa học:

Khi có tác động cắt cành thì auxin sẽ được hình thành một cách nhanh chóng tại đỉnh sinh trưởng và các cơ quan non, sau đó qua hệ thống mạch libe, auxin được vận chuyển về phần vết cắt cành chiết, cành giâm để kích thích tạo rễ bất định

Người ta chia sự hình thành rễ bất định làm ba giai đoạn :

- Giai đoạn phản phân hoá của tế bào tượng tầng trở lại chức năng phân chia của mô phân sinh tạo khối tế bào bất định (callus) Lượng auxin lớn để phản phân hoá tế bào (10-4- 10-5g/cm3)

- Giai đoạn tái phân hoá : các tế bào bất định tái phân hoá hình thành mầm rễ bất định cần lượng auxin thấp hơn (10-7g/cm3)

- Giai đoạn sinh trưởng của mầm rễ để hình thành rễ bất định Lượng auxin cần rất thấp (10-11-

10-12g/cm3) hoặc không cần

Thường sử dụng các chất thuộc nhóm auxin ngoại sinh để kích thích sự tạo rễ bất định nhanh và hiệu quả trong kỹ thuật giâm chiết cành: IBA, α-NAA, 2,4D

 Ưu điểm:

- Cây con giữ nguyên tính trạng của cây mẹ, cây đồng đều thuận tiện cho quá trình chăm sóc, thu hoạch

- Thời gian nhân giống tương đối nhanh, hệ số nhân giống cao

- Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao

1.2 Vật liệu:

- Đoạn thân của cây Lô hội trưởng thành (1năm tuổi) trồng trong vườn ươm từ cây giống in vitro

- Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm trong vườn

1.3 Phương pháp nuôi cấy:

 Phương pháp giâm hom thân:

- Rửa sạch đoạn thân, cắt thành từng đoạn 2,0 - 2,5 cm sao cho các hom đều có mắt ngủ

- Hom được xử lý chống nấm thối bằng dung dịch Benlate 0,15% trong 10 phút Sau đó được

xử lý kích thích ra rễ bằng IBA rồi tiến hành giâm vào cát mịn đã được xử lý bằng thuốc

chống nấm Benlate trước đó khoảng 5 ngày

 Phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng:

- Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm tại vườn, dùng kéo hoặc dao sắc huỷ bỏ đỉnh sinh trưởng

 Phương pháp sử dụng chế phẩm dinh dưỡng:

- Dùng chế phẩm dinh dưỡng 10% MS + 5ppm BAP, phun 10 ngày/lần lên cây Lô hội trưởng thành trong vườn ươm

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng:

 Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát sinh chồi nách tạo vật

liệu giâm hom thân cây Lô hội

- Huỷ đỉnh sinh trưởng làm phát sinh chồi nách có thể xem là một trong những phương pháp nhân giống vô tính cổ truyền được áp dụng để nhân giống dinh dưỡng nhiều loại cây

- Bản chất của phương pháp là áp dụng kỹ thuật huỷ đỉnh sinh trưởng cưỡng bức, gây ức chế nội tại, kích thích các chồi ngủ tiềm ẩn ở nách lá, đầu rễ, phân hoá thành chồi mới

- Khảo sát thời gian hủy đỉnh sinh trưởng vào tháng 3,6,9,12

Bảng 1: Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát sinh chồi nách

cây Lô hội

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ cây nảy chồi

(%)

Hệ số nhân (lần)

 Kém : Chồi gầy, lá xanh nhạt

 Trung bình : chồi mập, lá xanh nhạt

 Tốt : chồi mập, lá xanh đậm

→ Có thể áp dụng phương pháp nhân giống bằng kỹ thuật huỷ đỉnh sinh trưởng để tăng hệ số nhân nhanh giống cây Lô hội.Thời vụ không ảnh hưởng nhiều đến hệ số nhân chồi cũng như chất lượng chồi qua các mùa vụ

Hình 3.1 : Ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến hệ số nhân chồi cây Lô hội

 Ảnh hưởng của việc xử lý IBA đến khả năng ra rễ và nảy mầm đoạn hom thân cây Lô

lệ hom sống thấp, tỷ lệ hom sống cao nhất mới chỉ đạt (35,5%) khi sử dụng IBA dạng bột

Tỷ lệ hom nảy mầm là rất thấp, cao nhất mới chỉ đạt (8,8%) ở trường hợp sử dụng IBA dạng bột, thấp nhất là khi không sử dụng IBA, tỷ lệ hom nảy mầm là (0%)

Như vậy, nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp giâm hom thân cho hiệu quả thấp, vì vậy chỉ nên áp dụng nghiên cứu thực nghiệm không nên xây dựng quy trình sản xuất thực tiễn

 Ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng phát sinh chồi nách cây

Lô hội:

Việc nhân giống cây Lô hội hoàn toàn thụ động dựa vào việc tách chồi nách Hạn chế của phương pháp nhân giống này là thụ động, phụ thuộc vào yếu tố tự nhiên, hệ số nhân thấp, chất lượng giống cây không đồng đều

Xử lý kích thích chồi nách cây Lô hội bằng cách phun chế phẩm dinh dưưỡng bao gồm 10%MS + 5ppm BAP giúp nâng cao hiệu quả nhân giống và giải quyết các hạn chế trên

Bảng 3: Ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng phát sinh chồi

nách cây Lô hội

Chỉ tiêu theo dõi

Tỷ lệ bật chồi nách

(%)

Số chồi / cây (chồi)

- Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông qua sự phản phân hoá

và phân hoá của tế bào

- Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

2.2 Vật liệu:

- Chồi đỉnh của cây Lô hội dòng Aloe vera Linne Sinensis Berger (Lô hội lá nhỏ)

Đây là cây Lô hội được chọn lọc trong điều kiện tự nhiên, cây khỏe mạnh, không có triệu chứng nhiễm virus

- Các chất điều tiết sinh trưởng: thuộc hai nhóm auxin (-NAA, IBA) và xytokinin (BAP, kinetin), với các nồng độ BAP và kinetin từ 0,5 ppm đến 3,0 ppm, - IAA có nồng độ từ 0,2 ppm đến 1,0 ppm Ngoài ra, còn sử dụng than hoạt tính

2.3 Phương pháp nuôi cấy:

 Điều kiện nuôi cấy:

- Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi có chế độ chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ

tối với cường độ ánh sáng 2.500 – 3.000 Lux

- Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 20C

- Độ ẩm không khí: 50 – 60%

 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

- Môi trường dinh dưỡng MS (Muraskige & Skoog, 1968) với 30g/l đường saccaroza và 6,5 g/l agar

- Bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và than hoạt tính

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là : 5,8 – 6,0

- Thể tích dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi cấy là 20 - 35 ml/bình

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm trong 20 phút

 Phương pháp khử trùng mẫu cấy:

- Mẫu được cắt bằng dao hoặc kéo sắc rồi được đem vào rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới vòi nước chảy và tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất

- Khử trùng sơ bộ bằng cồn 75% Tiếp đó đem mẫu vào tủ cấy để tiến hành các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% theo 2 phương pháp là khử trùng đơn hoặc khử trùng kép

- Khử trùng kép : Lần 1 khử trùng bằng HgCl20,1% sau đó tráng lại mẫu bằng nước cất vô trùng, khử trùng tiếp bằng HgCl20,1%