Cây Vani, nguồn gốc sản xuất hương vani tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của rất nhiều nước châu Mĩ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÔN CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỀ TÀI: VI NHÂN GIỐNG VÀ BẢO TỒN CÂY VANI (VANILLA) TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM TP.HCM, tháng 6/2011 - 1 - VI NHÂN GIỐNG VÀ BẢO TỒN CÂY VANI (VANILLA) TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU .04 2. NGUYÊN VẬT LIỆU 07 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN .09 4. CHÚ Ý .16 5. SO SÁNH VỚI PHƯƠNG PHÁP KHÁC .17 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .19 - 2 - TÓM TẮT Cây Vani, nguồn gốc sản xuất hương vani tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của rất nhiều nước châu Mĩ. Tuy là loài cây bản địa ở Nam Mĩ, nhưng nguồn gen tự nhiên của giống này đang bị đe dọa bởi nạn phá rừng cũng như khai thác quá mức - lí do của sự biến mất dần của nhiều giống cây trồng và động vật hoang dã khác. Ngày nay, người ta có thể sản xuất hương vani bằng tổng hợp hóa học, nhưng sự đa dạng về gen của loài Vanilla đang thu hẹp dần nên vi nhân giống và bảo tồn giống cây này là điều tối quan trọng. Hoa của cây Vanilla Planifolia - 3 - 1. GIỚI THIỆU Vanilla planifolia thuộc họ lan, thân dây leo, là giống cây trồng quan trọng trong công nghiệp sản xuất hương vị và cũng là giống mang tính thương mại nhất thuộc họ lan. Nó được ứng dụng rộng rãi vào thực phẩm trong việc tạo mùi kem, sôcôla, thức uống, bánh ngọt… trong công nghệ sản xuất nước hoa, hay trong dược phẩm để ức chế vị đắng của thuốc… Cây Vanilla Planifolia là loài dây leo - 4 - Quả Vanilla Planifolia Đây là loại cây được trồng khắp các nước, đặc biệt là vùng nhiệt đới. Tuy nhiên nguồn gốc xuất phát của nó là ở Nam Mĩ – nơi mà nguồn gen của nhiều loài động thực vật đang bị đe dọa tuyệt chủng. Vì giống cây này đang bị tàn phá nơi sinh sống nghiêm trọng mà người ta bắt buộc phải tìm cách để nhân giống, bảo tồn và làm đa dạng lại nguồn gen. Không chỉ bị đe dọa bởi nạn phá rừng mà Vanilla planifolia còn đối mặt với rất nhiều loại bệnh khác do các loại nấm gây ra như Phytophthora meadii, Fusarium oxysporum, Calospora vanillae… - 5 - Vi nhân giống chắc chắn sẽ giúp phát triển một số lượng lớn cây sạch bệnh, cùng với việc bảo tồn giống cây trước khi nó tuyệt chủng là một điều cần thiết và cũng là một cách lý tưởng để có thể tìm ra nhiều phương pháp ex-situ. Phân bố của cây Vanilla Planifolia trên thế giới, tập trung nhiều nhất là ở Madagasca - 6 - 2. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1. Vật liệu nuôi cấy - Đoạn thân mang chồi - Đỉnh sinh trưởng 2.2. Dụng cụ - Erlen 500 ml bằng Borosilicate (hệ số giãn nở thấp) - 2 bình thủy tinh 250 ml - Ống môi trường 22cm x 3.5cm - Erlen 250 ml 2.3. Chất gel - 7.0 g/l Bacteriological grade agar 2.4. Môi trường - Dung dịch gồm khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, amino acids và chất điều hòa sinh trưởng. - Đường Sucrose 20–30 g/l. - Điều chỉnh pH về 5.8, trong thời gian đó nấu chảy agar trong lò viba rồi trộn agar vào hỗn hợp. - Khử trùng môi trường ở 121°C ở 1 atm trong 20 phút. - 7 - Murashige and Skoog (MS) - 8 - 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN : 3.1. Gieo hạt in vitro: - Lấy một số quả vanilla trưởng thành từ 4-7 tháng. Khử trùng bề mặt mẫu trong ethanol 95% trong tủ cấy vô trùng. - Tách vỏ bên ngoài để lấy hạt giống và chuyển chúng vào môi trường nuôi cấy đã được vô trùng. - Môi trường rắn hay lỏng đều có thể sử dụng cho sự nảy mầm và nuôi cấy.Môi trường MS rắn có bổ sung 0.5mg/l kinetin, 20g/l sucrose và được đặt trên máy lắc với tốc độ 200rpm. - Cấy những hạt đã nảy mầm vào môi trường nhân giống, môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA. Sự nảy mầm của các hạt tự nhiên và hột nhân tạo - 9 - 3.2. Vi nhân giống: - Lấy những đoạn chồi ngọn hay đốt thân từ các cây V.planifolia, V.aphylla, V.pilifera, V. andamanica. - Rửa và làm sạch các mẫu với 100ml/l teepol và khử trùng bề mặt với 1g/l HgCl 2 từ 5-7 phút trong tủ cấy vô trùng. - Sau đó rửa lại với nước nhiều lần để loại bỏ hoàn toàn HgCl 2 . Sau đó tạo vết thương trước khi cấy vào môi trường MS có 1mg/l BA và 0.5mg/l IBA. - Cấy tế bào vào môi trường mới trong vòng 20 ngày. Các tế bào được nuôi cấy ở 22±2 o C với thời gian chiếu sáng 14h với tốc độ chiếu sáng 35µmol/ m 2 /s được cung cấp của nguồng sáng là ánh sáng trắng của đèn huỳnh quang. - Sau 5-7 tháng, mỗi mô cấy sẽ tạo ra rất nhiều chồi con có thể gấp 12 lần ban đầu. Cảm ứng tạo chồi in vitro và sự phát triển sau đó - 10 - [...]... triển của chồi và hệ thống rễ và cuối cùng huấn luyện cây và chuyển ra vườn - 15 - - 16 - 3.8 Huấn luyện cây và chuyển ra vườn 1 Cây con in vitro với hệ thống rễ phát triển tốt được rửa sạch môi trường bám vào rễ 2 Dìm chúng trong 0.3% Dithane-M45 trogn vòng 5-10 phút và trồng lại trong tui poly chứa hh đất trong vườn, cát và chất khoáng với tỷ lệ bằng nhau (1:1:1) 3 Giữ độ ẩm từ 70-80%, và cường độ ánh... - Các hạt nhân tạo được sản xuất theo cách này có thể bảo quản được trong 10 tháng trong nước vô trùng ở 22±2 0C với tỉ lệ nảy mầm 80% - Cấy các hạt này vào môi trường nhân giống, môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0.5 mg/l IBA Hột nhân tạo - 13 - 3.7 Bảo quản phôi 3.7.1 Bảo quản trung hạn in vitro nhờ sự sinh trưởng chậm Nguyên tắc − Có nhiều cách khác nhau để kéo dài sự sống của mô và cơ quan... dinh du7õng, và bổ sung 10-15 mg/l mannitol sự thay đổi này sẽ hạn chế sự sinh trưởng của chồi 2-3 cm trong 360 ngày, và tỷ lệ sống sót thấp nhất là 80% - 17 - 5 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP KHÁC Phương pháp 2: Nhân giống vô tính cây Vani bằng phương pháp nuôi cấy mô của Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Xuân Du trong phòng Công nghệ tế bào thực vật, Vi n Sinh học Nhiệt đới 5.1 Vật liệu - Giống Vanilla tahitiensis... huấn luyện cây Sau đó chuyển cây ra vườn ươm, sau 1 năm chuyển cây ra vườn 4 CHÚ Ý 1 Khi làm nóng hạt, quá trình được lặp lại để tránh sự nhiễm khuẩn và cẩn thận để tránh phá huỷ hạt, ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của hạt 2 Môi trường đã dùng cần được loại bỏ và hấp khử trùng trước khi bỏ đi 3 Hầu hết cây mẹ vanilla bị nhiễm 1 hay nhiều loại virus Do đó, dùng bộ chẩn đoán virus, xét nghiệm miễn... thành vào môi trường MS có chứa 1mg/l BA và 0,5mg/l IBA.Nuôi cấy cấp 2 trong mối trường MS trong vòng 20 ngày - Mô sẹo sẽ phân hóa thành Protocorm, chồi có rễ trong khoảng 3-6 tháng - Tách rời và nuôi cấy các chồi phát triển tốt và có tạo rễ cho đến khi cứng cáp rồi đem ra trồng ngoài vườn hay sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống kế tiếp Các giai đoạn khác nhau của quá trình tái sinh cây. .. tục trong ngày từ 500-7000lux Nhiệt độ ngày đêm dao động trong khoảng 29oC+2 5.4 - Kết quả Cây nuôi cấy 60 ngày đạt chiều dài trên 5cm được ươm trên dớn cọng trong 15 ngày - Dớn cọng là một loại giá thể trồng lan có độ giữ nước ít, giúp cho bộ rễ khô ráo phù hợp với vi c ươm vanilla trong 15 ngày đầu Trong những ngày này không sử dụng phân bón - Khi đầu rễ vani bắt đầu nhú lên chứng tỏ sự hồi phục cây. .. trưởng rất chậm, có thể bảo quản trong ống nghiệm từ 7 đến 10 năm, mỗi năm cấy chuyền 1 lần vào môi trường mới 5 Để chồi phát triển bình thường, chuyển cây con vào môi trường MS cơ bản chứa 1.0 mg/l BA và 0.5 mg/l IBA ở 22±2°C với cường độ ánh sáng dưới 35 μmol/m2/s - 14 - 3.7.2 Bảo quản dài hạn bằng Phương pháp đông sâu Nguyên tắc − Nguyên liệu: mô chưa phân hóa, phôi soma và tổ chức đỉnh sinh trưởng... cách nhúng trực tiếp lọ cryo vào nước ở 40°C trong vòng 5-10 phút 2 Trồng những hạt đã được rã đông vào đĩa Petri chứa 25 ml môt trường MS rắn gồm 30 g/l sucrose, 1 mg/l BAP, và 0.5 mg/l IBA, đặt trong tối 7 ngày đầu và sau đó chiếu sáng với cường độ 35 μmol/m2/s để cây mẹ phát triển Tốc độ hồi phục là 50-70% 3 Sau 2 tuần, chồi mọc lên từ vỏ hột nhân tạo được cấy chuyền vào môi rường MS cơ bản để giúp... đoạn nhỏ và tiếp tục nhân giống 3.4 Cảm ứng tạo mô sẹo: - Nuối cấy mô, sau đó cắt các nguyên liệu nuôi cấy để chuẩn bọ cho quá trình cảm ứng tạo sẹo - Cấy các mô vào môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 0,5mg/l NAA - Ban đầu giữ cho mô cấy ở trong tối từ 2-5 ngày để cảm ứng tạo sẹo - Sau đó cấy các mô sẹo hình thành vào môi trường mới trong thời gian 20 ngày Sự cảm ứng tạo rễ - 11 - 3.5 Tái sinh cây -... tăng trưởng chậm thích hợp cho mọi loại cây trồng được nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng hay chồi ngọn − Có 3 loại tăng trưởng chậm: Nhân giống in vitro với tăng khoảng cách giữa các lần cấy chuyền Giảm tăng trưởng Ngừng tăng trưởng Thực hiện 1 Sự sinh trưởng chậm xảy ra trong môi trường nuôi cấy vanilla bẳng cách giảm nguồn carbon, giảm nồng độ cơ bản của môi trường, bổ sung mannitol, và giảm thiểu