XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp. CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH Niên khóa: 2008 – 2012 Tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH, TUYỂN CHỌN CÁC DÒNG Bradyrhizobium sp CỘNG SINH TRÊN CÂY ĐẬU XANH TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH KS TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP Tháng năm 2012 LỜI CẢM ƠN Tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tất thầy tận tình dạy dỗ, giúp đỡ thời gian theo học trƣờng Cảm ơn PGS.TS Lê Đình Đơn hết lòng học trò, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt thời gian theo học trƣờng nhƣ suốt q trình thực khóa luận KS Trần Thị Quỳnh Diệp, KS Võ Khánh Hƣng, KS Nguyễn Phan Thành, thầy cô anh chị công tác Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trƣờng tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tơi vật chất kỹ thuật Cảm ơn bạn lớp DH08SH, em Nguyễn Thị Dƣợc (DH09SH), Nguyễn Thị Phƣơng Khanh (DH10SH) giúp đỡ, góp ý chia sẻ tơi khó khăn thời gian học tập thực khóa luận Cảm ơn bạn, chúc bạn thành công Cuối muốn gửi đến ba mẹ nuôi dƣỡng, ủng hộ, tạo cho điều kiện tốt chỗ dựa vững để có đƣợc hơm Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Nguyễn Thị Hồng Hạnh i TÓM TẮT Trên giới, vi khuẩn cố định đạm đƣợc nghiên cứu từ kỷ 19 thu đƣợc nhiều kết quan trọng, ứng dụng hiệu cho việc cải tạo đất, tăng xuất trồng Ở Việt Nam, nghiên cứu tiềm ứng dụng loài vi khuẩn bƣớc đầu Hiện nay, việc tuyển chọn dòng vi khuẩn cố định đạm để tạo chế phẩm vi sinh có chứa vi khuẩn vơ cần thiết cho phát triển nông nghiệp nƣớc nhà Xuất phát từ yêu cầu thực tế đề tài “Xác định tuyển chọn dòng Bradyrhizobium sp cộng sinh đậu xanh phòng thí nghiệm” đƣợc thực Đề tài bao gồm thí nghiệm nhƣ xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sp mốc thời gian 24 sau lắc tăng sinh phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt, trồng đậu xanh hệ thống bioassay với vi khuẩn đƣợc phân lập xác định sinh hóa với mật số vi khuẩn khác nhằm xác định chủng vi khuẩn mật số vi khuẩn thích hợp có thời gian xuất nốt sần ngắn Sau tiến hành định danh kỹ thuật sinh học phân tử Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sp mốc thời gian 24 sau lắc tăng sinh đƣợc xác định khoảng 109 - 1010 CFU/ml Năm chủng vi khuẩn có khả cộng sinh rễ đậu xanh làm tăng nhanh chiều dài thân rễ đƣợc xác định, mật số vi khuẩn có thời gian xuất nốt sần sớm khoảng 109 - 1010 CFU/ml Với cặp mồi đƣợc thiết kế vùng bảo tồn 16S rDNA khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 585 bp Bradyrhizobium sp tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có khả khuếch đại đoạn DNA Cuối chọn đƣợc chủng vi khuẩn tiếp tục cho thí nghiệm sau Bradyrhizobium sp (X4), Bradyrhizobium sp (A3.2.I), Bradyrhizobium sp.(A3.2.II), Bradyrhizobium sp (H1), Bradyrhizobium sp (H3) ii SUMMARY The thesis "Identification and selection of the symbiotic Bradyrhizobium sp on Vigna radiata in the laboratory " was carried out at Research Institute for Biotechnology Environment, Nong Lam University, from February to July, 2012 In the world, nitrogen-fixing bacteria have been studied since the 19th century and obtained many important results, effective applications for soil improvement, and increase crop capacity In Vietnam, the potential researches and applications of this bacterium are only the first step Currently, the selection of these nitrogen-fixing bacteria strains to create a microbiological preparations containing bacteria are extremely necessary for the development of agriculture in the country Stemming from the practical requirements our research project: " Identification and selection of the symbiotic Bradyrhizobium sp on Vigna radiata in the laboratory" was conducted This topip including science experiments: identifying density of bacteria Bradyrhizobium sp in time 24 hours after proliferation by Drop plate Count method, planting Vigna radiata Bioassay system with the bacteria was isolated and identified by biochemical with the density of different bacterial strains to determine bacteria and bacterial density which resulted shortest for nodules to appear Then proceed to identify them use molecular biology techniques The result was identified bacteria Bradyrhizobium sp at 24 hours after proliferation is at about 109 to 1010 CFU / ml At the same time have identified five strains of bacteria capable of symbiosis on the roots of Vigna radiata accelerates the body length and root density of bacteria have time to appear as early nodules about 109 - 1010 CFU /ml With primers designed on conserved regions of 16S rDNA amplified a DNA fragment about 585 bp size of Bradyrhizobium sp., six strains of the bacteria were selected Finally, five strains were selected for use in further experiments, which are Bradyrhizobium sp (X4), Bradyrhizobium sp (A3.2.I), Bradyrhizobium sp (A3.2.II), Bradyrhizobium sp (H1), Bradyrhizobium sp (H3) Key words : Bradyrhizobium sp., Drop plate Count method, Vigna radiata iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu đậu xanh 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Đặc điểm hình thái đậu xanh 2.2 Quá trình cố định Nitơ 2.2.1 Vai trò Nitơ thực vật 2.2.2 Các nguồn Nitơ cung cấp cho 2.2.3 Chu trình cố định Nitơ tự nhiên 2.3 Tổng quan vi khuẩn cố định Nitơ 2.3.1 Phân loại vi khuẩn cố định Nitơ 2.3.2 Đặc điểm vi khuẩn cố định Nitơ 2.3.3 Vai trò vi khuẩn cố định Nitơ tự nhiên 2.4 Sơ lƣợc Bradyrhizobium 2.4.1 Phân loại khoa học 2.4.2 Đặc điểm 2.4.3 Cơ chế tạo nốt sần 2.5 Ly trích DNA phản ứng PCR 11 2.5.1 Ly trích DNA 11 iv 2.5.2 Phản ứng PCR 11 2.5.2.1 Khái niệm 11 2.5.2.2 Nguyên lý 11 2.5.2.3 Các giai đoạn phản ứng 12 2.5.2.4 Thành phần phản ứng PCR 13 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng 14 3.2.2.1 Thiết bị dụng cụ: 14 3.2.2.2 Hóa chất 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium thời gian 24 phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Count) 15 3.3.1.1 Nguyên tắc 15 3.3.1.2 Phƣơng pháp thực 15 3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định chủngvi khuẩn mật số vi khuẩn Bradyrhizobium chủng giống đậu xanh hệ thống bioassay 17 3.3.2.1 Hệ thống dùng bioassay 17 3.3.2.2 Mơ tả thí nghiệm 17 2.3.2.3 Bố trí thí nghiệm 18 3.3.2.4 Các tiêu phƣơng pháp theo dõi 18 3.3.2.5 Quy trình kỹ thuật: 18 3.3.3 Thí nghiệm 3: Phát chủng vi khuẩn Bradyrhizobium kỹ thuật PCR 19 3.3.3.1 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 19 3.3.3.2 Quy trình điện di kiểm tra DNA tổng số vi khuẩn 20 3.3.3.3 Khuếch đại trình tự rDNA 16S vi khuẩn phản ứng PCR 20 3.3.3.4 Điện di đọc kết PCR 21 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết xác định mật số vi khuẩn Bradyrhizobium thời gian 24 v sau lắc tăng sinh phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate Count) 23 4.2 Kết xác định chủng mật độ vi khuẩn Bradyrhizobium làm xuất nốt sần giống đậu xanh hệ thống bioassay 24 4.2.1 Kết thí nghiệm 24 4.2.1.1.Kết chiều dài rễ thân dƣới tác động vi khuẩn sau ngày gieo 24 4.2.1.2 Kết chiều dài rễ thân dƣới tác động mật số vi khuẩn khác sau ngày gieo 26 4.2.1.3 Kết chiều dài rễ thân dƣới tác động chủng vi khuẩn mật số vi khuẩn sau ngày sau gieo 27 4.2.1.4 Kết đếm số nốt sần qua lần nhuộm 30 4.2.2 Thảo luận 31 4.3 Khuếch đại trình tự rDNA 16S vi khuẩn phản ứng PCR 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 Tài liệu tham khảo Phụ lục vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT dNTP : deoxynucleotide triphosphat Tm : Melting temperature YEM : Yeast Extract Mannitol YMA : Yeast Mannitol Agar Bp : base pair SDS : Sodium dodecyl sulfat TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam PCR : Polymease Chain Reaction DNA : Deoxyribonucleic acid TBE : Tris Borate EDTA vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu địa thu thập mẫu 15 Bảng 3.2 Primer sử dụng khuếch đại trình tự 16S rDNA vi khuẩn 22 Bảng 3.3 Thành phần cho phản ứng PCR 22 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 22 Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn Bradyrhizobium sau thời gian 24 tăng sinh 24 Bảng 4.2 Chiều dài rễ sau ngày gieo dƣới tác động chủng vi khuẩn 25 Bảng 4.3 Chiều dài thân sau ngày gieo dƣới tác động chủng vi khuẩn 26 Bảng 4.4 : Chiều dài rễ sau ngày gieo dƣới tác động mật độ vi khuẩn khác 27 Bảng 4.5: Chiều dài thân sau ngày gieo dƣới tác động mật độ vi khuẩn khác 28 Bảng 4.6 Chiều dài rễ ngày sau gieo dƣới tác động chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn 29 Bảng 4.7 Chiều dài rễ sau ngày gieo hạt dƣới tác động chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn 30 Bảng 4.8 Chiều dài thân sau ngày gieo dƣới tác động chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn 31 Bảng 4.9 Chiều dài thân sau ngày gieo dƣới tác động chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn 32 Bảng 4.10 Số nốt sần chủng vi khuẩn mật độ vi khuẩn 24 qua lần nhuộm 33 viii Total 104 255,265 -Coefficient of Variation: 5,47% Bảng 2.3 Trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm kết xử lý Bảng 2.2 Yếu tố A Error Mean Square = 0,2830 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 21 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,4347 s_ = 0,1161 at alpha = 0,010 x &k2S Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 9,097 9,077 9,336 9,451 11,70 B B B B A Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 11,70 9,451 9,336 9,097 9,077 A B B B B Yếu tố B Error Mean Square = 0,2830 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 15 Least Significant Difference Test LSD value = 0,5144 at alpha = 0,010 &k2S Original Order Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 10,33 9,143 10,37 10,29 9,179 9,642 9,188 A B A A B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 10,37 10,33 10,29 9,642 9,188 9,179 9,143 Yếu tố AB Error Mean Square = 0,2830 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1,150 s_ = 0,3071 at alpha = 0,010 x Original Order 40 Ranked Order A A A B B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 9,260 9,000 9,220 9,547 8,547 8,943 9,160 9,200 8,917 9,157 9,440 9,283 8,893 8,647 8,960 8,800 9,317 9,193 9,550 9,627 9,907 9,610 8,840 9,673 9,187 8,933 11,09 8,820 14,60 10,16 14,47 14,07 9,583 9,653 9,407 CD CD CD CD D CD CD CD CD CD CD CD CD D CD CD CD CD CD CD BCD CD CD CD CD CD B CD A BC A A CD CD CD Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 29 31 32 27 30 21 24 34 20 22 33 19 11 35 17 12 18 25 10 15 26 13 23 28 16 14 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 14,60 14,47 14,07 11,09 10,16 9,907 9,673 9,653 9,627 9,610 9,583 9,550 9,547 9,440 9,407 9,317 9,283 9,260 9,220 9,200 9,193 9,187 9,160 9,157 9,000 8,960 8,943 8,933 8,917 8,893 8,840 8,820 8,800 8,647 8,547 A A A B BC BCD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD D D Bảng 2.4 Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm (Chiều dài rễ sau ngày gieo hạt) Chủng vi khuẩn X4 mật độ vi khuẩn 101 101 101 102 102 102 103 103 Lần chiều dài rễ trung lặp lại bình 17,42 18,10 18,73 18,95 19,82 18,52 19,38 20,55 41 M2,6 A3,2,I A3,2,II 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 3 3 3 3 3 3 3 3 42 19,33 19,28 20,12 19,65 21,68 21,13 21,25 18,48 19,80 19,47 18,63 17,80 18,98 19,32 18,22 20,55 19,92 18,58 19,07 18,95 19,05 19,57 19,42 19,17 18,37 19,95 19,43 19,28 19,68 19,85 19,13 21,37 20,70 21,35 23,35 23,65 23,70 18,23 19,18 18,77 20,08 20,15 20,05 20,98 18,53 18,92 H1 H3 H7 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 3 3 3 3 3 3 3 43 20,82 19,02 19,02 20,54 20,82 20,87 18,10 18,32 18,73 17,77 18,57 18,83 20,20 18,57 18,05 19,55 18,25 18,82 21,07 20,97 20,72 18,30 18,57 18,33 18,47 19,18 19,0 19,35 18,65 18,55 18,37 18,60 18,48 21,0 21,05 20,03 18,03 18,93 19,08 17,92 18,43 20,03 20,28 18,32 18,33 20,28 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 3 18,65 17,92 19,02 18,88 19,88 Bảng 2.5 Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu Bảng2 A N A L Y S I S K O F V A R I A N C E Degrees of Value Source Freedom T A B L E Sum of Mean Squares F Square Value Prob -2 Factor A 57,130 14,283 32,1022 0,0000 Factor B 29,995 4,999 11,2364 0,0000 AB 24 34,052 1,419 3,1890 0,0001 Error 70 31,144 0,445 -7 -Total 104 152,321 -Coefficient of Variation: 3,43% Bảng 2.6 Trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm dựa kết xử lý Bảng 2.5 Yếu tố A Error Mean Square = 0,4450 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 15 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,6450 s_ = 0,1722 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 18,64 19,04 19,27 19,42 20,82 C BC BC B A Mean Mean Mean Mean Mean Yếu tố B Error Mean Square = 0,4450 44 Ranked Order = = = = = 20,82 19,42 19,27 19,04 18,64 A B BC BC C Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 21 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,5451 s_ = 0,1456 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 19,59 19,09 20,56 19,73 19,10 19,06 18,93 BC CD A B CD CD D Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 20,56 19,73 19,59 19,10 19,09 19,06 18,93 A B BC CD CD CD D Yếu tố AB Error Mean Square = 0,4450 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1,442 s_ = 0,3851 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 18,08 19,25 18,99 18,73 18,38 18,40 18,68 19,10 18,47 19,55 20,09 18,39 18,88 18,79 19,75 19,36 19,55 19,48 18,94 18,85 18,98 19,68 19,19 21,14 19,62 18,87 18,48 18,95 21,35 19,19 H DEFGH FGH GH GH GH GH EFGH GH CDEFGH BCDEFG GH GH GH BCDEFGH DEFGH CDEFGH CDEFGH GH GH GH CDEFGH EFGH BC CDEFGH GH GH GH B EFGH Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 45 31 29 24 33 32 34 11 15 22 25 10 17 18 16 35 30 23 21 28 19 13 26 20 14 27 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 23,57 21,35 21,14 20,92 20,74 20,69 20,09 19,75 19,68 19,62 19,55 19,55 19,48 19,36 19,26 19,25 19,19 19,19 19,10 18,99 18,98 18,95 18,94 18,88 18,87 18,85 18,79 18,73 18,68 18,48 A B BC BCD BCDE BCDEF BCDEFG BCDEFGH CDEFGH CDEFGH CDEFGH CDEFGH CDEFGH DEFGH DEFGH DEFGH EFGH EFGH EFGH FGH GH GH GH GH GH GH GH GH GH GH Mean Mean Mean Mean Mean 31 32 33 34 35 = = = = = 23,57 20,74 20,92 20,69 19,26 A BCDE BCD BCDEF DEFGH Mean Mean Mean Mean Mean 12 = = = = = 18,47 18,40 18,39 18,38 18,08 GH GH GH GH H Bảng 2.7 Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm (chiều dài thân ngày sau gieo) Chủng vi khuẩn X4 M2,6 A3,2,I mật độ vi khuẩn 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 Lần chiều dài thân lặp lại trung bình 5,17 5,30 5,15 5,45 5,43 6,30 5,67 6,23 6,58 6,45 5,63 6,58 8,70 9,45 8,80 4,42 5,72 5,55 5,68 5,17 5,50 5,23 4,72 4,77 5,72 5,77 5,35 6,07 5,70 5,80 5,28 46 A3,2,II H1 H3 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 3 3 3 3 3 3 3 47 5,32 5,12 5,17 5,75 5,63 5,35 5,53 5,85 6,02 5,85 6,33 8,70 8,88 9,17 5,48 5,67 6,02 6,03 6,18 5,43 5,53 5,82 5,50 5,53 6,23 6,55 8,73 8,95 8,80 5,43 5,12 5,43 5,50 5,33 5,37 5,22 4,83 4,95 5,78 5,72 5,35 5,72 5,63 5,72 5,43 5,12 101 102 10 2 10 3 10 103 10 10 10 104 10 10 - 10 10 10 - 10 109 - 1010 H7 10 1 10 10 10 102 2 10 3 10 103 10 10 10 104 10 10 - 10 10 10 - 10 10 10 - 10 Bảng 2.8 Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu Bảng 2.7 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E 5,43 5,50 5,33 5,37 5,22 4,83 4,95 5,78 5,72 5,75 5,72 6,02 5,72 5,13 5,50 5,23 5,25 5,28 4,98 5,23 5,38 5,07 5,87 5,12 5,27 6,05 5,65 5,67 T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 47,378 11,845 137,8905 0,0000 Factor B 24,591 4,099 47,7143 0,0000 AB 24 32,451 1,352 15,7410 0,0000 -7 Error 70 6,013 0,086 -Total 104 110,433 Bảng 2.9 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm kết Bảng 2.8 Yếu tố A Error Mean Square = 0,08600 Error Degrees of Freedom = 70 48 No, of observations to calculate a mean = 15 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,2835 s_ = 0,07572 at alpha = 0,010 x &k2S Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 5,334 5,506 5,355 5,827 7,126 C C C B A Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 7,126 5,827 5,506 5,355 5,334 A B C C C Yếu tố B Error Mean Square = 0,08600 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 21 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,2396 s_ = 0,06399 at alpha = 0,010 x &k2S Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 6,459 5,411 6,263 6,430 5,407 5,459 5,379 A B A A B B B Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 6,459 6,430 6,263 5,459 5,411 5,407 5,379 Yếu tố AB Error Mean Square = 0,08600 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,6340 s_ = 0,1693 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = = 5,207 5,230 5,240 5,723 5,327 5,327 5,287 5,727 EFG EFG EFG BCDEF DEFG DEFG EFG BCDEF Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 49 29 31 32 22 15 25 24 11 = = = = = = = = 8,983 8,917 8,827 6,220 6,160 6,103 6,067 5,880 A A A B BC BC BCD BCDE A A A B B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 5,450 5,517 5,880 5,400 5,400 5,170 6,160 4,907 5,577 5,617 5,000 5,000 5,227 6,220 5,613 6,067 6,103 5,617 5,750 5,420 8,983 5,857 8,917 8,827 5,690 5,820 5,790 CDEFG BCDEFG BCDE CDEFG CDEFG EFG BC G BCDEFG BCDEFG FG FG EFG B BCDEFG BCD BC BCDEFG BCDEF CDEFG A BCDE A A BCDEF BCDE BCDE Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 30 34 35 27 33 18 26 23 17 10 28 12 13 21 14 19 20 16 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 5,857 5,820 5,790 5,750 5,727 5,723 5,690 5,617 5,617 5,613 5,577 5,517 5,450 5,420 5,400 5,400 5,327 5,327 5,287 5,240 5,230 5,227 5,207 5,170 5,000 5,000 4,907 BCDE BCDE BCDE BCDEF BCDEF BCDEF BCDEF BCDEFG BCDEFG BCDEFG BCDEFG BCDEFG CDEFG CDEFG CDEFG CDEFG DEFG DEFG EFG EFG EFG EFG EFG EFG FG FG G Bảng 2.10 Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm (chiều dài thân ngày sau gieo) Chủng vi khuẩn X4 M2,6 mật độ vi khuẩn 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 10 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 Lần lặp lại 3 3 3 50 chiều dài thân trung bình 11,0 11,57 10,94 11,53 11,53 11,0 12,38 11,05 11,23 12,21 11,16 10,73 18,33 18,29 18,48 11,22 10,90 11,13 10,75 11,22 11,15 A3,2,I A3,2,II H1 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 103 103 104 104 104 109 - 1010 109 - 1010 109 - 1010 101 101 101 102 102 102 103 3 3 3 3 3 3 3 51 10,87 11,43 11,22 11,15 11,52 11,17 11,40 11,40 11,25 11,73 11,52 11,07 11,34 11,15 11,45 11,33 11,27 11,68 12,45 11,13 11,22 18,75 17,33 17,42 10,57 10,83 10,33 10,98 10,80 10,50 11,82 11,18 10,98 11,95 11,20 11,67 17,45 16,95 16,65 10,18 11,05 10,92 10,95 11,07 11,03 11,12 103 103 10 10 10 109 - 1010 10 10 - 10 10 10 - 10 H3 10 101 10 10 10 102 3 10 10 10 104 10 10 109 - 1010 10 10 - 10 10 10 - 10 H7 10 1 10 101 10 10 2 10 103 10 10 104 10 10 10 10 - 10 109 - 1010 10 10 - 10 Bảng 2.11 Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu Bảng 2.10 11,38 11,22 11,52 10,92 11,45 11,67 11,69 11,55 10,60 10,85 11,63 11,17 11,23 11,55 11,43 12,17 11,68 10,43 12,17 11,02 11,10 11,0 10,78 10,62 10,95 11,15 11,23 11,27 11,12 11,20 11,17 11,53 11,55 11,47 11,15 11,68 11,23 11,37 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob -2 Factor A 139,343 34,836 226,5530 0,0000 Factor B 50,272 8,379 54,4906 0,0000 AB 24 167,091 6,962 45,2778 0,0000 -7 Error 70 10,764 0,154 52 -Total 104 367,471 -Coefficient of Variation: 3,32% Bảng 2.12 Trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm dựa kết Bảng 2.11 Yếu tố A Error Mean Square = 0,1540 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 15 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,3794 s_ = 0,1013 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 10,99 11,14 11,40 11,39 14,08 C BC B B A Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = 14,08 11,40 11,39 11,14 10,99 A B B BC C Yếu tố B Error Mean Square = 0,1540 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = 21 Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,3207 s_ = 0,08563 at alpha = 0,010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 12,76 11,19 12,72 12,26 11,18 11,25 11,25 A C A B C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = Yếu tố AB Error Mean Square = 0,1540 Error Degrees of Freedom = 70 No, of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0,8484 s_ = 0,2266 at alpha = 0,010 53 12,76 12,72 12,26 11,25 11,25 11,19 11,18 A A B C C C C x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 11,17 11,08 11,44 10,58 10,72 11,03 10,91 11,35 11,04 11,31 10,76 11,02 11,32 11,21 11,55 11,17 11,43 11,33 11,24 11,76 11,30 11,37 11,28 11,60 11,61 11,30 11,21 11,39 18,37 11,35 17,83 17,02 11,64 10,96 11,43 Ranked Order CD CD CD D CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD C CD CD CD CD CD CD CD CD A CD AB B C CD CD Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 54 29 31 32 20 33 25 24 15 17 35 28 22 30 18 13 10 21 26 23 19 27 14 16 12 34 11 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 18,37 17,83 17,02 11,76 11,64 11,61 11,60 11,55 11,44 11,43 11,43 11,39 11,37 11,35 11,35 11,33 11,32 11,31 11,30 11,30 11,28 11,24 11,21 11,21 11,17 11,17 11,08 11,04 11,03 11,02 10,96 10,91 10,76 10,72 10,58 A AB B C C CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD CD D ... cộng sinh rễ đậu xanh làm tăng nhanh chiều dài thân rễ đƣợc xác định, mật số vi khuẩn có thời gian xuất nốt sần sớm khoảng 109 - 1010 CFU/ml Với cặp mồi đƣợc thi t kế vùng bảo tồn 16S rDNA khuếch... nghiên cứu 14 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 3.2.2 Thi t bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng 14 3.2.2.1 Thi t bị dụng cụ: 14 3.2.2.2 Hóa chất 15 3.3... thuật tổng hợp nhân tạo đoạn DNA với tốc độ nhanh, xác cao đƣợc thực máy luân nhiệt Kỹ thuật PCR đƣợc Karry Mullis phát minh năm 1985 đƣợc tiếp thu hoàn thi n thông qua việc phát sản xuất đƣợc enzyme