CHỌN LỌC VI KHUẨN NỐT SẦN TRÊN CÂY ĐẬU XANH

Kết quả chọn được bốn chủng vi khuẩn thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh tạo ra nốt sần hữu hiệu, đó là các chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I.. Kết quả sau 16 ngày sau khi

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em xin chân thành cảm ơn

Công ơn sinh thành, dưỡng dục của ba mẹ, sự động viên khích lệ của người thân trong gia đình trong suốt thời gian qua

Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

Quý thầy cô khoa Nông Học đã tận tình dạy bảo em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

PGS.TS Lê Đình Đôn, người đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Các bạn sinh viên lớp DH08NH, DH08BV, DH08SH và em Nguyễn Thị Dược

đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tp.Hồ Chí Minh, 9 tháng 7 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Mai Ngọc Điềm

TÓM TẮT

MAI NGỌC ĐIỀM, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2012 Chọn lọc vi khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS LÊ ĐÌNH ĐÔN

Trong canh tác, việc sử dụng các chế phẩm sinh học sẽ góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững Đề tài đã thực hiện thành công việc cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn cố định đạm trên đậu xanh đồng thời tiến hành chọn lọc các chủng vi khuẩn đã phân lập dựa trên mô hình đã cải tiến

Nội dung nghiên cứu gồm 3 phần chính là: thứ nhất, phân lập ra các chủng vi khuẩn cố định đạm trên cây họ đậu: đậu xanh, đậu đen, đâu phụng Thứ hai, cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng các chủng vi khuẩn đã phân lập lên cây đậu xanh Thứ ba, tiến hành chủng các chủng vi khuẩn phân lập được trên giống đậu xanh APN –

208

Việc phân lập dựa vào sự phát triển của khuẩn lạc trên môi trường yeast mannitol agar (YMA) sau 24 giờ cấy Sau đó tiếp tục cấy tăng sinh các chủng vi khuẩn cho khuẩn lạc điển hình, sau 24 giờ ở 370C, tiến hành chủng các chủng vi khuẩn cần phân lập lên giống đậu xanh APN 208 trong môi trường đất và tro trấu đã được hấp ở

1210C Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, với 13 nghiệm thức (NT), trong đó có một NT đối chứng, 12 NT là các chủng vi khuẩn cần phân lập,

đó là các chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, ĐP4, P4.1 Kết quả chọn được bốn chủng vi khuẩn thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh tạo ra nốt sần hữu hiệu, đó là các chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I

Việc thứ hai là cải tiến bioassay bằng cách trồng đậu xanh trên giấy ăn thấm nước và được phủ bên ngoài bằng tấm giấy bìa cứng Những tập giấy này được dựng đứng bằng cách cố định vào những dây kẽm Sau đó tiến hành thí nghiệm với các mức khoảng cách trồng giữa các hạt đậu xanh khác nhau Nhằm chọn ra được một khoảng cách trồng phù hợp mà cây phát triển bình thường cũng như để khảo sát sự phát triển của cây trên hệ thống bioassay Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên, 4 lần lặp lại, với 4 nghiệm thức (NT) tương ứng với các mức khoảng cách giữa các hạt khi gieo là: NT 1: 2 cm, NT 2: 3 cm, NT 3: 4 cm, NT 4: 5 cm Kết quả đã chọn được mức khoảng cách phù hợp là 4 cm để phục vụ cho việc chủng invitro các chủng

vi khuẩn đã phân lập được trong quy mô phòng thí nghiệm trên hệ thống bioassay Việc thứ ba được tiến hành trên giống đậu xanh APN – 208, thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, với 5 nghiệm thức tương ứng với các chủng vi khuẩn gồm: NT1: X4; NT2: H1; NT3: H3; NT4: A3I; NT5: Đối chứng không

có vi khuẩn Kết quả sau 16 ngày sau khi chủng vi khuẩn trên đậu xanh, cả bốn chủng

vi khuẩn: X4, H1, H3 và A3I đã tạo được mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh trên hệ thống bioassay, tạo được nốt sần hữu hiệu Ngày thứ bảy sau khi chủng vi khuẩn thì nốt sần đã xuất hiện Chủng vi khuẩn X4 là chủng vi khuẩn hoạt động mạnh nhất trong bốn chủng vi khuẩn tạo được nốt sần trên rễ đậu xanh

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách các bảng, danh sách các hình viii

Danh sách các phụ lục ix

Danh sách các chữ viết tắt ix

Chương 1 Giới thiệu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Giới hạn của đề tài 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật 3

2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh 3

2.2.1 Khóa phân loại 3

2.2.2 Đặc điểm 4

2.3 Các nguồn cung cấp đạm trong đất và quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh 4

2.3.1 Các nguồn cung cấp đạm trong đất 4

2.3.2 Quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh 5

2.3.2.1 Khái niệm chung về quá trình cố định đạm 5

2.3.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm 6

2.4 Vi khuẩn nốt sần và sự hình thành nốt sần 6

2.4.1 Lịch sử phát triển 6

2.4.2 Đặc điểm 7

2.4.3 Phân loại 9

2.5 Quá trình hình thành nốt sần 10

2.6 Vi khuẩn chi Rhizobium 11

2.6.1 Lịch sử phát triển 11

2.6.2 Phân loại 12

2.6.3 Đặc điểm 12

2.7 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium 13

Chương 3 Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 14

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu thí nghiệm 14

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

3.2.2 Thiết bi, dụng cụ và hóa chất sử dụng 14

3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 14

3.2.2.2 Hóa chất 15

3.3 Nội dung nghiên cứu 15

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm 15

3.4.1.1 Mô tả thí nghiệm 15

3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm 16

3.4.1.3 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 16

3.4.1.4 Quy trình kỹ thuật 16

3.4.2 Thí nghiệm 2: Cải tiến hệ thống bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên giống đậu xanh APN 208 17

3.4.2.1 Hệ thống dùng trong bioassay 17

3.4.2.2 Mô tả thí nghiệm 18

3.4.2.3 Bố trí thí nghiệm 18

3.4.2.4 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 19

3.4.2.5 Quy trình kỹ thuật 19

3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm trên giống đậu xanh APN 208 19

3.4.3.1 Bố trí nghiệm 19

3.4.3.2 Cách lấy chỉ chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 20

3.4.3.3 Quy trình kỹ thuật 20

3.5 Xử lý số liệu 21

Chương 4 Kết quả và thảo luận 22

4.1 Kết quả 22

4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm 22

4.1.2 Thí nghiệm 2: Cải tiến hệ thống bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên giống đậu xanh APN 208 35

4.1.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm trên giống đậu xanh APN 208 49

4.2 Thảo luận 50

Chương 5 Kết luận và đề nghị 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 53

Tài liệu tham khảo 55

Phụ lục 58

DANH SÁCH CÁC BẢNG, DANH SÁCH CÁC HÌNH

Danh sách các bảng

Bảng 4.1: Số chủng vi khuẩn phân lập và nguồn gốc mẫu 22

Bảng 4.2: Chiều cao cây đậu xanh qua các lần theo dõi 25

Bảng 4.3: Chiều dài rễ đậu xanh qua các lần theo dõi 27

Bảng 4.4: Quan hệ cộng sinh của 12 chủng vi khuẩn với rễ cây đậu xanh 29

Bảng 4.5: Số nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra 33

Bảng 4.6: Đường kính nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra 34

Bảng 4.7: Chiều cao trụ hạ diệp qua các ngày theo dõi 38

Bảng 4.8: Chiều dài rễ đậu xanh 9 ngày sau gieo 39

Bảng 4.9: Chiều cao cây đậu xanh qua các lần điều tra 40

Bảng 4.10: Chiều dài rễ đậu xanh qua các lần điều tra 41

Bảng 4.11: Nốt sần hữu hiệu qua các lần điều tra 46

Bảng 4.12: Đường kính nốt sần hữu hiệu 49

Danh sách các hình Hình 3.1: Hệ thống trồng đậu xanh 18

Hình 4.1: Hình dạng, màu sắc của một số khuẩn lạc sau khi cấy 24 giờ 23

Hình 4.2: Chiều cao cây đậu xanh qua các ngày theo dõi 24

Hình 4.3: Chiều dài rễ đậu xanh tại 14 ngày sau gieo 28

Hình 4.4: Nốt sần hữu hiệu tại 7 ngày sau gieo 30

Hình 4.5: Nốt sần hữu hiệu tại 14 ngày sau gieo 31

Hình 4.6: Nốt sần hữu hiệu tại 21 ngày sau gieo 32

Hình 4.7: Quá trình gieo hạt giống 35

Hình 4.8: Sự phát triển của cây đậu xanh vào thời điểm 4 ngày sau gieo 36

Hình 4.9: Sự phát triển rễ đậu xanh của nghiệm thức 3 qua các lần điều tra 37

Hình 4.10: Nốt sần hữu hiệu lúc chưa nhuộm 43

Hình 4.11: Nốt sần hữu hiệu tại 9 ngày sau gieo (đã nhuộm) 44

Hình 4.12: Nốt sần hữu hiệu tại 11 ngày sau gieo (đã nhuộm) 45

Hình 4.13: Đường kính nốt sần hữu hiệu nhìn dưới kính hiển vi (vật kính 10) thời điểm

12 ngày sau gieo 47

Hình 4.14: Đường kính nốt sần qua các ngày theo dõi 48

DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1 Mẫu phân lập 58

Phụ lục 2 Môi trường phân lập 58

Phụ lục 3 Dung dịch nhuộm rễ 59

Phụ lục 4 Phương pháp nhuộm rễ 59

Phụ lục 5 Số liệu qua các lần điều tra khi phân lập các chủng vi khuẩn 60

Phụ lục 6 Số liệu qua các lần điều tra khi cải tiến mô hình bioassay 79

Phụ lục 7 Số liệu qua các lần điều tra khi chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3 83

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CV: Coefficient of Variation (Hệ số biến động)

NSG: Ngày sau gieo

NT: Nghiệm thức

N: nitơ

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Khi canh tác con người luôn tìm mọi cách nhằm để đưa năng suất cây trồng lên cao nhất bằng nhiều biện pháp khác nhau như cải tiến giống, nâng cao các kỹ thuật thâm canh, sử dụng phân bón, … Trong những biện pháp đó, con người đã lạm dụng quá mức vào phân bón hóa học, đặc biệt là phân đạm để tăng năng suất

Vì thế, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu sản xuất ra một chế phẩm vi sinh dùng để hỗ trợ cho việc sử dụng phân đạm hóa học Ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất, việc sử dụng phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững

Chúng ta đã biết những cây họ đậu có một khả năng đặc biệt là sản xuất ra nitơ cho chính bản thân nó thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi sinh vật đất hay còn gọi là vi khuẩn nốt sần Vi khuẩn này xâm nhập vào tế bào rễ thực vật và bắt đầu hàng loạt các thay đổi phát triển phức tạp dẫn đến sự tạo thành nốt sần Các vi khuẩn này được cây nuôi sống và cố định hay là biến đổi khí nitơ tự do trong bầu khí quyển thành hợp chất nitơ mà cây có thể sử dụng giúp cho cây sinh trưởng và phát triển

Tuy nhiên, với số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp ứng đủ đối với nhu cầu của cây Vì vậy, việc phân lập ra những dòng vi khuẩn cố định đạm là cần thiết và phục vụ cho sự phát triển của nền nông nghiệp nước nhà ngày càng giàu mạnh

Mặt khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm khác nhau và chuyên biệt đối với từng giống đậu khác nhau Vì vậy, để tuyển chọn ra được

các chủng vi khuẩn thích hợp thì công việc bước đầu không kém phần quan trọng là phải cải tiến thành công bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn đó trên cây đậu

Trong các loại cây họ đậu, đậu xanh là cây trồng khá phổ biến, được trồng rộng rãi ở nước ta Đậu xanh đóng một vai trò quan trọng trong đời sống vừa là thức ăn trực tiếp của con người và động vật, cũng như một số chức năng chữa bệnh hữu hiệu mà nó mang lại

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã đăng ký thực hiện đề tài: “Chọn lọc vi khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh”

1.2 Mục đích của đề tài

Sử dụng mô hình bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn cố định đạm trên đậu xanh và tiến hành chọn lọc các chủng vi khuẩn nốt sần đã phân lập dựa vào mô hình đã thiết lập, sản xuất chế phẩm từ các dòng vi khuẩn đã chọn lọc được

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập, tạo dòng thuần và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của rễ cây đậu xanh, đậu đen, đậu phụng

- Cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên đậu xanh

- Đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn đã phân lập trên giống đậu xanh APN –

208 nhờ vào mô hình bioassay

1.4 Giới hạn của đề tài:

Đề tài đã được thực hiện từ ngày 13/02 đến ngày 13/06 với việc phân lập, đánh giá các chủng vi khuẩn nốt sần trên cây họ đậu, cải tiến hệ thống bioassay và chọn lọc các chủng vi khuẩn thích hợp trên giống đậu xanh APN 208 trong phòng thí nghiệm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật

Đạm có vai trò rất quan trọng đối với cây trồng, nhu cầu N của hầu hết các loại cây trồng là rất cao Trong sản xuất, phân N thường là yếu tố dinh dưỡng giới hạn năng suất Cây trồng hấp thụ N để hình thành các Amino acids, amides, amines, các cấu trúc khung, các hợp chất trung gian như Proteins, chlorophyll, nucleic acids, proteins/enzymes điều hòa các phản ứng sinh hóa, đây là những chất quan trọng bật nhất trong việc xây dựng và điều tiết sự phát triển của thực vật (Lê Văn Hưng, Nguyễn Xuân Thành, Phạm Văn Toản, 2003)

Đạm là thành phần tổng hợp cấu trúc diệp lục tố Nó cũng là thành phần của DNA, RNA

2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh

2.2.1 Khóa phân loại

Bộ: Fabales

Họ: Fabaceae Phân họ: Faboideae Tông: Phaseoleae Phân tông: Phaseolinae

Chi: Vigna Tên khoa học: Vigna radiata (L.) Tên đồng nghĩa: Phaseolus aureus Roxb

2.2.2 Đặc điểm

Đậu xanh hay đỗ xanh có kích thước hạt nhỏ (đường kính khoảng 2–2,5 mm)

Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử dụng để làm xôi, làm các loại bánh khọt, bánh đậu xanh, bánh ngọt, hoặc được ủ cho lên mầm để làm thức ăn (giá đỗ)

Đậu xanh thuộc loại cây thân thảo mọc đứng Lá mọc kép ba chia, có lông hai mặt Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số lượng nhiều,

có lông, trong chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng,

có mầm ở giữa, (http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_xanh)

Một đặc trưng nổi bật của cây đậu xanh: chúng là các loại cây chủ cho nhiều loài vi khuẩn trên rễ của chúng Các loài vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ, có khả năng lấy khí nitơ (N2) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH3) Hoạt động này được gọi là cố định đạm Cây đậu với vai trò là cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ với vai trò là nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra mối quan hệ cộng sinh

2.3 Các nguồn cung cấp đạm trong đất và quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh

2.3.1 C ác nguồn cung cấp đạm trong đất

- Quá trình khoáng hóa các chất hữu cơ: qua quá trình này các nguyên tố dinh dưỡng nằm trong cấu trúc sinh hóa của các chất hữu cơ bị phân giải và chuyển sang dạng hữu dụng mà cây trồng có thể hấp thụ được, thực hiện do hầu hết các vi sinh vật đất như vi khuẩn, nấm dị dưỡng

- Cố định N sinh học Gồm cố định sinh học do vi sinh vật cộng sinh và không cộng sinh

- Cố định N trong khí quyển: Sấm sét và cố định công nghiệp

- Phân hóa học, phân hữu cơ, chất thải rắn sinh học

2.3.2 Quá trình cố định đạm trên cây đậu xanh

2.3.2.1 Khái niệm chung về quá trình cố định đạm

Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ đối với cây trồng, mà ngay

cả đối với vi sinh vật Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng trong không khí nitơ chiếm khoảng 78,16 % thể tích Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên một héc ta đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể cung cấp cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng

Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.105 tỷ tấn nitơ Nhưng tất cả các nguồn nitơ trên cây trồng không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật Thông qua hoạt động sống của các loài vi sinh vật, nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa thành dạng dễ tiêu cho cây trồng

Trong đó, cố định đạm là tiến trình chuyển hóa nitrogen trong khí quyển thành đạm amôn mà cây có thể hấp thụ dưới tác dụng của nhóm vi sinh vật có hoạt tính Nitrogenaza Trên cây họ đậu cũng như trên đậu xanh quá trình này được thực hiện

nhờ vi khuẩn thuộc chi Rhizobium hoặc chi Bradyrhizobium, chúng sống trong nốt sần

rễ cây họ đậu, có khả năng hút và chuyển hóa nitơ tự nhiên trong không khí thành N cung cấp cho cây, sau khi cây chết và bị phân giải, sẽ cung cấp và làm gia tăng lượng

N trong đất

Sự cố định N sinh học có thể xảy ra nhờ các vi khuẩn sống tự do thuộc các chi

như: Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, vi khuẩn lam sống tự do, vi khuẩn lam

cộng sinh trên bèo hoa dâu…nhưng chưa có ý nghĩa trong nông nghiệp Trong khi đó

vi khuẩn nốt sần trong cây họ Đậu có thể cố định được từ 55 – 144 kg N/ha/vụ (Đường Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, 1979)

2.3.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm

Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định đạm là một bí ẩn đầy hấp dẫn trong tự nhiên Trong khi con người phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất cao, rất tốn kém (400 ÷ 5000C, 200 ÷ 1000 atm với những chất xúc tác rất đắt tiền) để phá vở mối liên kết 3 của phân tử nitơ để có phân đạm hóa học, bằng cách tổng hợp từ:

NH3 + CO2 xúc tác CO(NH2)2Trong khi vi sinh vật với sự giúp đỡ của hoạt tính Nitrogenaza lại phá vở mối liên kết ba của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện rất bình thường về nhiệt độ và áp suất

Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của Nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt như sau:

N2 + 6e + 12ATP + H2O 2NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+Nitrogenaza được cấu tạo bởi hai phần:

• Fc– protein có trọng lượng phân tử khoảng 6.104

Hai năm sau (1888) nhà khoa học Hà Lan Bâyêrinh (M W.Beijerinck) đã phân lập được loại vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ Đậu (đậu Hòa lan, đậu cove, đậu tằm, đậu lotus…) Ông đặt tên cho loại vi khuẩn này là

Nitrogenaza

Bacillus radicicola Năm 1889, Frank đề nghị xếp vi khuẩn này vào một chi riêng là

chi Rhizobium (B Frank, 1889)

2.4.2 Đặc điểm

Căn cứ vào tài liệu hiện có thì vi khuẩn nốt sần là loại vi khuẩn gram âm, khi còn non có tế bào hình que, kích thước vào khoảng 0,5 - 1,2 x 2,0 - 3,5 𝜇𝜇m, bắt màu đồng đều và có khả năng di động nhờ tiên mao Vi khuẩn có nốt sần có loại đơn mao,

có loại chu mao và cũng có loại tiên mao mọc thành chùm ở gần đầu

Khi già vi khuẩn nốt sần trở nên bất động Lúc đó tế bào trở nên bắt màu từng đoạn khi nhuộm bằng thuốc nhuộm aniline (có thể do xuất hiện các thể ẩn nhập giàu lipít) Có lúc vi khuẩn nốt sần tạo thành những dạng hình cầu di động hoặc không di động Có tài liệu cho biết trong đất vi khuẩn nốt sần thường có dạng hình cầu, cũng có khi chúng tạo thành những quả thể lọc Khi gặp điều kiện bình thường những quả thể lọc này lại có thể phát triển thành các tế bào bình thường

Trên môi trường nhân tạo cũng như trong nốt sần người ta thường gặp những tế bào gọi là thể giả khuẩn (bacteroides) So với các tế bào hình que bình thường thì thể giả khuẩn có kích thước lớn hơn, thường phân nhánh (tạo thành các hình giống như chữ X, V, Y, …) chứa nhiều glycogen, volutin và lipoprotein hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Trên môi trường đặc vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy lồi, màu trắng trong hoặc trắng đục Chất nhầy do vi khuẩn nốt sần sinh ra thuộc một loại polisaccarit cấu tạo bởi hexozơ, pentozơ và axit uronic (Phan Thị Huyền, 2006)

Vi khuẩn nốt sần có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau (đường đơn, đường kép, axit hữu cơ, rượu bậc thấp, dextrin, glycogen, …) Khoảng 30% lượng đường do vi khuẩn nốt sần đồng hóa được dùng để tạo chất nhầy của chúng Vi khuẩn nốt sần có thể phát triển được trên môi trường rất nghèo nitơ Tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có ai xác định được là chúng có khả năng cố định nitơ khi phát triển trên các môi trường dinh dưỡng (phát triển bên ngoài nốt sần) Còn có ý kiến cho rằng khả năng cố định nitơ chưa chắc đã thuộc về vi khuẩn nốt sần mà có thể là thuộc về cây họ đậu Vi khuẩn nốt sần chỉ có tác dụng kích thích cho việc thực hiện quá trình này

Vi khuẩn nốt sần có thể đồng hóa tốt nhiều loại axit amin, một số nòi có thể đồng hóa được pepton Khả năng sử dụng các protein phân tử lớn nói chung là rất ít Ngược lại, vi khuẩn nốt sần có thể sử dụng dễ dàng các muối amon, nitrat và các gốc kiềm purin, pirimidin Chúng còn có thể sử dụng được ure hoặc biure

Việc nuôi cấy vi khuẩn nốt sần trên môi trường với nồng độ các hợp chất nitơ cao có thể làm mất khả năng xâm nhiễm cũng như khả năng tạo thành nốt sần trên cây

bộ đậu Chính vì vậy cho nên người ta thường sử dụng các loại môi trường chứa nước chiết thực vật để nuôi cấy vi khuẩn nốt sần Nhu cầu vitamin thay đổi đối với tùy từng nòi vi khuẩn nốt sần Nói chung nhiều loại vi khuẩn nốt sần có khả năng tự tổng hợp khá nhiều loại vitamin (B1, B2, B12, …) Nhiều vi khuẩn nốt sần còn có khả năng tổng

hợp các chất sinh trường thực vật (như gibberellins, axit 𝛽𝛽-indonaxetic, …)

Để nuôi cấy vi khuẩn nốt sần, người ta thường sử dụng các môi trường chứa đường kính hoặc mannitol, một số muối khoáng và một ít cao nấm men (các môi trường Harrison, 1915; Fred và Waksman, 1928; Matchette, 1933; Bond, 1910; Hendrickson, 1942; Van Schreven, 1953; Burton, 196) Để nhân giống vi khuẩn nốt sần trong điều kiện các hợp tác xã nông nghiệp cũng có thể sử dụng cả những môi trường rất đơn giản chứa đường kính hoặc đường đen với tỷ lệ 1% trong nước chiết của loại đậu tương ứng (50 g/lít)

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hiếu khí Tuy nhiên chúng vẫn có thể phát triển được ngay cả trong trường hợp chỉ có một áp lực oxi rất thấp, khoảng 0,01 atm Đa số các loài vi khuẩn nốt sần thích hợp phát triển ở pH = 6,5 - 7,5 Sự sinh trưởng của chúng bị cản trở khi pH hạ thấp đến 4,5 - 5,0 hoặc nâng lên đến 8,0 Nhiệt độ thích hợp đối với nhiều loại vi khuẩn nốt sần là 24 - 260C Ở nhiệt độ 370C sự phát triển của chúng bị cản trở rõ rệt

Mỗi loài vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm được trên một nhóm cây nhất định trong bộ đậu Ví dụ các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết vi khuẩn nốt sần Điền thanh

hoa vàng (S cannnabana ) có thể tạo được nốt sần trên Điền thanh hạt tròn (S

đậu khác (đậu tương, đậu đen, đậu xanh, đậu đũa, lạc)

Cũng có trường hợp vi khuẩn nốt sần xâm nhập được vào những loại đậu không đặc biệt đối với chúng, khi đó chúng chỉ có thể tạo ra rất ít nốt sần và cố định nitơ rất yếu Một đặc tính quan trọng của vi khuẩn nốt sần là tính hữu hiệu của chúng tức là hoạt tính đồng hóa N2 khi cộng sinh với cây bộ đậu Sự tồn tại trong thiên nhiên các nòi vi khuẩn hữu hiệu và vô hiệu đã được phát hiện từ năm 1904 và từ đó đến nay đã

có rất nhiều nghiên cứu được đề cập tới

Vi khuẩn nốt sần hữu hiệu thường tạo nên những nốt sần lớn và tập trung trên

rễ cái của cây họ đậu Còn vi khuẩn vô hiệu thì thường tạo nên những nốt sần nhỏ phân tán trên khắp bộ rễ Nhiều nghiên cứu cho biết nốt sần tạo nên bởi các vi khuẩn hữu hiệu thường có màu hồng Sắc tố hồng thuộc loại hemin Người ta đã tách được sắc tố hồng ở dạng tinh khiết từ nốt sần của cây đậu tương và gọi là leghemoglobin Sắc tố này thường tồn tại trong không bào của tế bào thực vật chứ không phải tồn tại trong tế bào vi khuẩn Ở nhiều loại đậu, trong mỗi gam nốt sần có chứa tới 1,09 - 3,25mg leghemoglobin Ở các cây họ đậu một năm khi đã kết thúc quá trình cố định nitơ, người ta nhận thấy màu hồng của nốt sần chuyển thành màu lục Rất nhiều nghiên cứu cho phép khẳng định được rằng leghemoglobin đóng vai trò xúc tác trong quá trình cố định nitơ phân tử

2.4.3 Phân loại

Khi theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nốt sần trên các môi trường dinh dưỡng nhân tạo người ta thường chia chúng ra thành hai nhóm:

- Nhóm mọc nhanh, phản ứng axit màu vàng trên môi trường Bromthymol Blue,

có thời gian thế hệ nhỏ hơn 4 giờ, có khuẩn lạc 2 - 4 mm đường kính xuất hiện sau 3 -

5 ngày (vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá, đậu Côve, mục túc…) Nhóm này thuộc chi

Rhizobium

- Nhóm mọc chậm, phản ứng axit màu xanh trên môi trường Bromthymol Blue,

có thời gian thế hệ lớn hơn 8 giờ, khuẩn lạc không quá 1 mm sau 5 - 7 ngày (vi khuẩn

nốt sần đậu tương lạc, đậu đũa, đậu xanh…) Nhóm này thuộc chi Bradyrhizobium

(Somasegaran và Hoben, 1985)

2.5 Quá trình hình thành nốt sần

Vi khuẩn nốt sần thường xâm nhập vào rễ cây bộ đậu thông qua các lông hút, đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ Một loại cây thuộc bộ đậu thường tiết ra chung quanh rễ của mình những chất có tác dụng kích thích sự phát triển của các vi khuẩn nốt sần thuộc loại tương ướng với nhóm cây đó Chẳng hạn khi trộn vi khuẩn nốt sần

cỏ ba lá với vi khuẩn nốt sần mục túc rồi đưa vào bộ rễ của cỏ ba lá, sau ba tuần lễ người ta lấy đất để kiểm tra và nhận thấy số lượng vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá tăng lên hàng triệu lần trong khi đó vi khuẩn nốt sần cỏ mục túc hầu như không phát triển

Người ta nhận thấy muốn xâm nhập tốt vào thực vật thì vi khuẩn nốt sần cần đạt tới mật độ 104 tế bào/g đất Theo O.N Allen (1966) thì đối với loại hạt đậu nhỏ trên mỗi hạt cần nhiễm 500 - 1000 tế bào vi khuẩn nốt sần, còn đối với các loại hạt đậu lớn thì cần nhiễm khoảng 70.000 tế bào vi khuẩn nốt sần Khi đó cây đậu sẽ tạo thành khá nhiều nốt sần và hoạt động cố định nitơ sẽ được tăng lên nhiều

Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn nốt sần, rễ cây họ đậu sẽ tiết ra enzyme poligalacturonaza, enzyme này sẽ làm phân hủy thành lông hút và giúp cho vi khuẩn nốt sần có điều kiện xâm nhập vào rễ Trong lông hút vi khuẩn nốt sần sẽ hình thành một cái gọi là dây xâm nhập Đó là một khối chất nhầy dạng sợi, bên trong chứa đầy các vi khuẩn hình que ở trạng thái phát triển nhanh chóng Dây xâm nhập đi dần vào bên trong rễ với tốc độ khoảng 5-8 µm/s Sự vận động của dây xâm nhập được thực hiện dưới áp lực sinh ra do sự phát triển của các vi khuẩn bên trong dây

Một số dây xâm nhập sẽ tiếp tục phát triển và lọt được vào đến lớp nhu mô Ở đây vi khuẩn nốt sần sẽ kích thích các tế bào thực vật bị chúng xâm nhiễm cũng như các tế bào lân cận Kết quả làm cho chúng phân chia nhanh chóng thành rất nhiều tế bào mới Vi khuẩn sẽ thoát ra khỏi dây xâm nhập và đi vào trong tế bào chất Ở đó chúng sẽ lớn lên và phân cắt thành nhiều tế bào mới Chúng sẽ chuyển sang trạng thái thể giả khuẩn Thể giả khuẩn không có khả năng phân cắt nhưng có khả năng tăng kích thước đến một mức độ nhất định Trong các nốt sần vô hiệu người ta không thấy các thể giả khuẩn mà chỉ thấy toàn vi khuẩn hình que Người ta còn nhận thấy khi màu hồng của nốt sần hữu hiệu chuyển sang màu lục thì cũng là lúc thể giả khuẩn bị dung

giải Những điều đó cho phép người ta tin rằng việc tạo thành thể giả khuẩn có liên quan mật thiết đối với quá trình cố định nitơ

Khi hình thành thể giả khuẩn thì ti thể và lạp thể của tế bào sẽ bị dồn sát vào thành tế bào và phân bố dọc theo thành Khi đó trong tế bào sẽ bắt đầu xuất hiện leghemoglobin và số lượng riboxom cũng đồng thời tăng lên khá nhiều Ở những nốt sần trưởng thành, người ta có thể thấy rõ ba vùng sau đây:

a) Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm Những tế bào này thường có kích thước nhỏ hơn tế bào vỏ rễ Sau khi hình thành vỏ nốt sần phần vỏ

rễ sẽ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần

b) Vùng phân cắt mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâm nhiễm, nằm bên dưới lớp vỏ nốt sần Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phân hóa và tạo thành các tế bào vỏ nốt sần, các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bào mạch dẫn

c) Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩn nằm xen lẫn với các tế bào không chứa vi khuẩn Thể tích của mỗi tế bào chứa vi khuẩn có thể lớn đến gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn

d) Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần bắt đầu phát triển, một số tế bào nằm giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hóa và phân cắt thành các

tế bào mạch dẫn của nốt sần Về sau các mạch dẫn này sẽ liên kết với hệ thống mạch dẫn của rễ cây Số bó mạch trong mỗi nốt sần tùy loại cây mà thay đổi trong khoảng 1-

12

2.6 Vi khuẩn chi Rhizobium

2.6.1 Lịch sử phát triển

Beijerinck ở Holland lần đầu tiên đã phân lập và nuôi cấy một vi sinh vật từ nốt

sần của những cây họ Đậu (năm 1888) và ông ta đã đặt tên cho nó là Bacillus

(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)

Loài đầu tiên của chi Rhizobium là R leguminosarum, đã được nhận diện vào

1889, và tất cả những loài tìm thấy sau này ban đầu đều đưa vào trong chi Rhizobium

Tuy nhiên, với các phương pháp phân tích hiện đại đã xem xét lại sự phân loại này và hiện nay đã xếp vào trong nhiều chi khác nhau Tất cả các nghiên cứu đều thực hiện trên những cây họ đậu như cỏ ba lá, cỏ đinh lăng, những cây đậu

Một số loài hiện nay: Rhizobium arachis; Rhizobium daejeonense; Rhizobium

etli; Rhizobium galegae; Rhizobium gallicum; Rhizobium giardinii; Rhizobium

leguminosarum; Rhizobium loessense; Rhizobium lupini; Rhizobium mongolense; Rhizobium phaseoli; Rhizobium sullae; Rhizobium tropici; Rhizobium undicola; Rhizobium yangligense; Rhizobium sp

2.6.3 Đặc điểm

Chi Rhizobium gồm những loài vi khuẩn Gram âm, hô hấp hiếu khí, ưa pH trung tính hay kiềm không sinh bào tử, chuyển động nhờ nhung mao và tiêm mao, kích thước 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3 µm Chúng là những vi sinh vật sống trong đất, có khả năng cộng sinh với cây họ đậu để cố định nitơ của khí quyển thành những hợp chất nitơ mà cây trồng có thể sử dụng được Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa đường pentose như là một nguồn carbon để tăng trưởng, thủy phân được hydrogen peroxide (H2O2), sinh khí H2S trong điều kiện kỵ khí, không thủy phân được urea, có khả năng

oxy hóa đường glucose thành axít pyvuric nhưng không chuyển hóa thành axít hữu cơ

mà thành hợp chất acetone, có khả năng phân giải gelatine

2.7 Vi khuẩn chi Bradyrhizobium

Một số loài trong chi Bradyrhizobium : Bradyrhizobium betae; Bradyrhizobrium

canariense; Bradyrhizobium elkanii; Bradyrhizobium genosp.; Bradyrhizobium

japonicum; Bradyrhizobium liaonigense; Bradyrhizobium lupini; Bradyrhizobium yuanmingense; Bradyrhizobium pachyrhizi.

Chương 3 NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện từ ngày 13/02/2012 đến ngày 13/06/2012 nhằm chọn

lọc vi khuẩn nốt sần trên cây đậu xanh

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Việc nghiên cứu đã được thực hiện tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và

Môi trường thuộc Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu thí nghiệm

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn cố định đạm được phân lập trên rễ cây đậu xanh

- Giống đậu xanh: APN 208

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng

3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ

- Tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp, đĩa petri, pipet, micropipet

- Máy nước cất, máy lắc, máy trộn vortex, máy ly tâm, cân, kính hiển vi

- Ống nghiệm, đèn cồn, cốc thủy tinh, bình tam giác, các loại ống đong

- Que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy trang

3.2.2.2 Hoá chất

- Manitol, K2HPO4, Mg.SO4.H2O, NaCl, cao nấm men, nước cất, Agar

- Dinh dưỡng cho lan dạng bột màu tím

- Dung dịch nhuộm rễ: chuẩn bị 0,35 g axit Fuchsin với 25 ml axit acetic và 75 ml nước cất, hòa vào nhau, được dung dịch Fuchsin Glycerol được làm chua bằng axit HCl: chuẩn bị 2 ml HCl hòa vào 300 ml nước cất, sau đó cho 700 ml glycerol vào, được dung dịch glycerol đã được làm chua bằng axit HCl

- Nước tẩy Javen

3.3 Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm

- Sử dụng bioassay (Thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên cây đậu xanh

- So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm trên giống đậu xanh APN 208

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm

3.4.1.1 Mô tả thí nghiệm:

Từ những mẫu nốt sần được lấy trên cây họ đậu ngoài đồng, tiến hành phân lập bằng cách cấy trang trên môi trường YMA, sau đó chọn những khuẩn lạc có hình dạng điển hình cấy tăng sinh và chủng trên giống đậu xanh APN 208, chủng vi khuẩn nào thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh tạo được nốt sần hữu hiệu thì kết luận chủng vi khuẩn đó là chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với rễ cây đậu xanh

và tiến hành tăng sinh khối chủng invitro các chủng vi khuẩn vừa phân lập được trên đậu xanh Thí nghiệm đơn yếu tố, đó là các chủng vi khuẩn cần phân lập Thí nghiệm được đặt trong nhà để tránh nước mưa làm ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm

3.4 1.2 Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm đơn yếu tố là các chủng vi khuẩn cần phân lập

- Số nghiệm thức: 13 nghiệm thức, trong đó: NT 1: X4; NT 2: H1; NT 3: H3; NT 4: A3I; NT 5: X5; NT 6: X6; NT 7: Đ7; NT 8: A3II; NT 9: Đ5.1; NT 10: Đ6; NT 11: P4.1; NT 12: ĐP4; NT 13: đối chứng không có vi khuẩn

- Số lần lặp lại , 3 lần, trong mỗi lần lặp lại trồng 3 cây

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

3.4.1.3 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:

- Cách lấy chỉ tiêu:

+ Đo chiều cao thân cây: tiến hành đo chiều cao thân ba cây của mỗi lần lặp lại của

13 NT Đo chiều cao cây từ mặt đất đến đỉnh sinh trưởng của mỗi cây

+ Đo chiều dài bộ rễ cây: cho nước vào trong mỗi ly nhựa trồng đậu xanh để đất và tro trấu tách khỏi rễ sao cho rễ không bi đứt, tiến hành đo chiều dài rễ cây

+ Đếm số nốt sần hữu hiệu trên rễ cây: cho toàn bộ rễ vào trong chậu nước to để đất

và tro trấu tách khỏi rễ nhằm dễ dàng trong việc đếm số nốt sần hữu hiệu trên mỗi bộ

ba tuần thì dừng thí nghiệm Mỗi tuần nhổ một cây đậu xanh trong một lần lặp lại của

13 NT để thu số liệu

3.4.1.4 Quy trình kỹ thuật

Giai đoạn tiền thí nghiệm:

- Lấy mẫu: lấy các nốt sần hữu hiệu trên rễ cây đậu xanh, đậu đen và đậu phụng rửa sạch bằng cồn và nước cất và cho vào lọ vô trùng

- Thu dịch mẫu: cắt những nốt sần sau khi rửa sạch trong cồn và nước cất cho vào nghiền trong ống ependofe Hút dịch sau ly tâm cho vào ống ependofe khác, thêm nước cho được 1 ml

- Phân lập và làm thuần : pha loãng liên tiếp bậc 10 dịch chứa vi khuẩn thành các mức pha loãng khác nhau và chuyển 100 µl dịch khuẩn ở các mức pha loãng lên bề mặt đĩa môi trường yeast mannitol agar (môi trường YMA) Cấy trang 12 mẫu, mỗi mẫu cấy ra hai đĩa petri

- Dựa vào hình dạng, màu sắc, đặc điểm khuẩn lạc để tiến hành chọn những khuẩn lạc thích hợp và nuôi cấy chúng trên môi trường YMA Để sau 24h tiến hành cấy tăng sinh khối và chủng vào đậu xanh được trồng trong các chậu đất đã được hấp ở 1210

C

Giai đoạn thí nghiệm:

- Lựa chọn những hạt giống đủ tiêu chuẩn, ngâm hạt trong mười giờ đến khi các hạt đậu xanh vừa nứt vỏ

- Cho hạt vào ependofe chứa dịch khuẩn đã được tăng sinh khối, lắc khoảng một đến hai phút Tiến hành gieo vào đất đã được hấp trước đó Mỗi nghiệm thức trồng trong một ly nhựa cao 14 cm chứa đất đã được hấp, tỷ lệ đất : tro trấu là 2:1

3.4.2 Thí nghiệm 2: Cải tiến bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên giống đậu xanh

3.4.2.1 Hệ thống dùng trong bioassay

- Mô tả hệ thống: Hệ thống gồm những bịch kính có kích thước 22 x 30 cm, trong có chứa giấy mỏng thấm nước dùng để gieo hạt Những bịch này được cố định bằng giấy bìa cứng và dựng đứng trên những dây kẽm nằm ngang Những dây kẽm này được cột trên những thanh sắt to nằm dọc tủ, kích thước tủ: dài 1,3 mét, rộng 0,7 mét, cao 2 mét, bao quanh tủ là một tấm vải to màu đen Hệ thống gồm có hai tầng dùng để trồng đậu xanh, mỗi tầng được lắp bốn bóng đèn huỳnh quang dài 1,2 mét, 40W Các bóng đèn được lắp ở bốn độ cao khác nhau theo một khoảng cách cố định sao cho không làm héo đậu xanh Sau đó, mỗi ngày ta tiến hành kéo đèn lên cao hơn

tương ứng với sự phát triển của đậu xanh mỗi ngày

- Yêu cầu của hệ thống:

+ Không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

+ Thao tác thực hiện thí nghiệm dễ dàng

+ Đo được chiều dài rễ, đếm số nốt sần một cách dễ dàng

+ Cây phát triển bình thường, khỏe mạnh

Hình 3.1: Hệ thống trồng đậu xanh (bioassay)

3.4.2.2 Mô tả thí nghiệm

Thí nghiệm thể hiện các mức khoảng cách giữa các hạt đậu xanh khi trồng trên

hệ thống là 2 cm, 3 cm, 4 cm, 5 cm, còn các yếu tố khác là hoàn toàn đồng nhất Nhằm xác định khoảng cách nào mà khi trồng cây vừa có thể phát triển bình thường khỏe mạnh, có thể đo được chiều dài rễ, đếm số nốt sần một cách chính xác, vừa tiết kiệm được số lượng hạt khi làm thí nghiệm Thí nghiệm được đặt tại vị trí sao cho các điều kiện môi trường xung quanh không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của cây

3.4.2.4 Các h lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

- Cách lấy chỉ tiêu: Trừ những cây ngoài cùng, tiến hành đo 3 cây chính giữa trên

từng nghiệm thức (NT)

+ Đo chiều cao của trụ hạ diệp để từ đó xác định tốc độ tăng trưởng của cây

+ Đo chiều dài của rễ để từ đó xác định tốc độ tăng trưởng của rễ, trên mỗi bịch kính của NT tiến hành chia vạch từ 0 đến 30 (đơn vị đo là cm), khi rễ mọc dài đến đâu

thì chỉ cần nhìn vào thước đã chia vạch sẵn và ghi số liệu

- Phương pháp theo dõi: Sau khi gieo hạt ba ngày tiến hành thu số liệu, mỗi ngày

đo một lần, cho đến khi rễ đụng đáy bịch kính thì dừng thí nghiệm

3.4.2.5 Quy trình kỹ thuật

- Lựa chọn hạt giống đủ tiêu chuẩn, có kích thước đồng nhất

- Ngâm ủ hạt giống: Ngâm khoảng 8 giờ trong nước lạnh, sau đó ủ trong giấy ẩm

khoảng 12 giờ

- Cho 100 ml nước vào bịch để thấm đều giấy ẩm

- Tiến hành gieo hạt ở độ sâu 2 cm

3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và chọn lọc các chủng vi khuẩn cố định đạm trên giống đậu xanh APN 208

3.4.3.1 Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm đơn yếu tố, đó chính là các chủng vi khuẩn đã phân lập được trên thí nghiệm 1

- Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức (NT), gồm: NT 1: X4; NT 2: H1; NT 3: H3; NT 4: A3I và NT 5: Đối chứng không có vi khuẩn

- Số lần lặp lại: 4 lần

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

3.4.3.2 Cách lấy chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

- Các lấy chỉ tiêu: Tiến hành đo chiều cao tất cả các cây trên từng nghiệm thức Đến ngày thứ bảy sau khi gieo, khi nốt sần đã xuất hiện, nhổ đậu xanh để nhuộm rễ, mỗi lần nhuộm, nhổ một cây đậu xanh trên mỗi NT cho đến ngày thứ mười bốn thì dừng lại

+ Đo chiều cao cây: đo từ phần thân cây nhô lên ở miệng bịch kính đến đỉnh sinh trưởng của cây

+ Đo chiều dài rễ cây: chia vạch thước có độ dài 30 cm lên dọc bịch kính, khi rễ mọc dài đến đâu thì nhìn vào thước để ghi nhận số liệu

+ Đếm số nốt sần hữu hiệu trên rễ: tiến hành nhuộm rễ bằng dung dịch axit

fuchsin, sau đó đếm số nốt sần bắt màu hồng của axit fuchsin

+ Đo đường kính nốt sần hữu hiệu: sau khi đếm số nốt sần xong, lựa chọn năm nốt sần hữu hiệu có kích thước tiêu biểu khác nhau, dùng nhíp nhọn gấp nốt sần đặt lên lam kính, tiến hành quan sát và ghi nhận số liệu đường kính nốt sần trên kính hiển

vi dưới vật kính 10

+ Xác định thời gian xuất hiện nốt sần trên rễ cây đậu xanh

- Phương pháp theo dõi: Sau khi gieo hạt bốn ngày tiến hành thu số liệu, ba ngày

đo chiều cao cây và đo rễ một lần Đến ngày thứ tám sau gieo, tiến hành nhổ đậu xanh

để nhuộm rễ nhằm quan sát và đo, đếm số nốt sần hữu hiệu Mỗi ngày nhổ cây đậu xanh một lần

3.4.3.3 Quy trình kỹ thuật

Giai đoạn tiền thí nghiệm: chuẩn bị dịch khuẩn để chủng

- Cấy khuẩn lạc vào trong trong bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường YM

(bằng que tăm)

- Tiến hành lắc bình tam giác ở 150 vòng/phút, trong 24 giờ ở 370

C

Giai đoạn thí nghiệm

- Lựa chọn hạt giống đủ tiêu chuẩn, có kích thước đồng nhất

- Ngâm ủ hạt giống: Ngâm khoảng 10 giờ trong nước lạnh cho đến khi hạt đậu vừa nứt vỏ

- Cho 100 ml nước vào bịch để thấm đều giấy ẩm Cho đậu xanh đã ngâm nứt vỏ vào trong bình tam giác chứa dịch khuẩn, lắc đều trong khoảng một đến hai phút

- Tiến hành gieo hạt theo kích thước đã xác định trong thí nghiệm 2, với độ sâu 2cm

- Bảy ngày sau gieo tưới dung dịch dinh dưỡng cho đậu xanh, 0,5 g bột dinh dưỡng hòa vào 1 lít nước

3.5 Xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2007 và phần mềm MSTATC

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm

Trong nghiên cứu này, 12 chủng vi khuẩn đã được phân lập từ nốt sần của rễ cây đậu xanh, đậu phụng và đậu đen trên môi trường yeast mannitol agar (YMA) (Bảng 4.1) Mười hai chủng vi khuẩn này cho khuẩn lạc có màu sắc, hình dạng và đặc điểm đặc trưng là những khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, lồi và có màu trắng trong hay

trắng đục trên môi trường phân lập

Bảng 4.1: Số chủng vi khuẩn phân lập và nguồn gốc mẫu Tên chủng vi

Hình 4.1: Hình dạng, màu sắc của một số khuẩn lạc sau khi cấy 24 giờ

a) Chủng vi khuẩn X4; b) Chủng vi khuẩn A3I

Kết quả giai đoạn thí nghiệm:

Hình 4.2 Chiều cao cây đậu xanh qua các ngày theo dõi a) và c) Chiều cao cây đậu xanh tại 8 NSG

b) Chiều cao cây đậu xanh tại 14 NSG

d) Chiều cao cây tại 17 NSG

Bảng 4.2: Chiều cao cây đậu xanh qua các lần theo dõi Nghiệm

26,3±1,18

ab

27,7±1,0 abc

27,2±1,0 abc

23,7±1,26

bc

25,4±0,74 bcd

24,7±0,58 abc

25,70,46 abd

27,7±0,5 abc

3,87 (**)

3,65 (**)

3,24 (**)

2,84 (**)

3,30 (**) Ghi chú:

(**): sự khác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa thống kê (mức 0,01)

Dựa vào bảng số liệu ta thấy chiều cao cây qua các lần điều tra từ ngày 5 đến ngày 20 khác biệt rất có ý nghĩa thống kê (mức 0,01)

Năm ngày sau gieo, bốn nghiệm thức khác biệt rất có ý nghĩa, được sắp xếp theo

a, b, c, d, trong đó, nhóm a: giữa các nghiệm thức X4 và H3 thì sự khác biệt không có

ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự a và đều khác biệt với các nghiệm thức còn lại Nhóm b: giữa các nghiệm thức H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, P4.1 thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự b Nhóm c: giữa các nghiệm thức H1, A3I, X5, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, P4.1, ĐP4 thì sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự c và đều khác biệt với nghiệm thức X4 Nhóm d: giữa các nghiệm thức H1, A3I, A3II, Đ5.1, ĐP4 và đối chứng thì sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự d Các nghiệm thức H1, H3, X5, X6, A3I, A3II, Đ6, Đ7, Đ5.1 là những nghiệm thức trung gian vì chúng thuộc cả ba nhóm

Tám ngày sau gieo sự khác biệt giữa NT A3II, ĐP4, đối chứng; X5, ĐP4 và nghiệm thức đối chứng là có ý nghĩa thống kê, các NT còn lại thuộc nhóm NT trung gian

Mười một ngày sau gieo sự khác biệt giữa NT X4, A3II,ĐP4; H3 và NT đối chứng là có ý nghĩa còn các NT còn lại thuộc nhóm NT trung gian

Mười bốn ngày sau gieo, có sáu nhóm nghiệm thức khác biệt rất có ý nghĩa được sắp xếp theo a, b, c, d, e, f, trong đó, nhóm a: giữa các nghiệm thức X4, H1, A3I, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6 sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự a Nhóm b: H1, A3I, X5, X6, Đ7, Đ5.1, Đ6 thì sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự b Nhóm c: giữa các nghiệm thức H3, X5, X6, Đ7 sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự c Nhóm d: giữa các nghiệm thức H3, X5, X6, P4.1 sự khác biệt giữa các nghiệm thức không có

ý nghĩa thống kê Nhóm e: giữa các nghiệm thức P4.1, ĐP4 thì sự khác biệt giữa hai nghiệm thức là không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự e và khác biệt với các nghiệm thức còn lại Nhóm f: NT ĐP4 và nghiệm thức đối chứng sự khác biệt giữa hai NT không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự f và đều khác biệt với các nghiệm thức còn lại

Hai mươi ngày sau gieo có sáu nhóm NT khác biệt rất có ý nghĩa, được sắp xếp theo a, b, c, d, e, f, trong đó NT X4 thuộc nhóm a và NT đối chứng thuộc nhóm f là có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê và khác biệt so với các NT còn lại

Như vậy, qua các ngày theo dõi thì có sự khác biệt về chiều cao giữa 13 NT Trong đó, NT X4, H1, H3 và A3I là có chiều cao cao nhất trong 13 NT NT đối chứng

có chiều cao thấp nhất trong số 13 NT NT X4 có chiều cao cao nhất

Bảy ngày sau gieo có ba nhóm NT khác biệt rất có ý nghĩa, được sắp xếp theo a,

b, c, trong đó, nhóm a: giữa các NT X4, H1, H3, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, P4.1, ĐP4 thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự a Nhóm b: giữa các NT H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7, A3II, Đ5.1, Đ6, P4.1, ĐP4 sự khác biệt giữa các NT không

có ý thống kê vì có chung ký tự b Nhóm c: giữa các NT H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7,Đ6, Đ5.1, P4.1, ĐP4 sự khác biệt không có ý nghĩa vì có chung ký tự c Các NT H1, H3, X5, X6, A3I, A3II, Đ5.1, ĐP4, P4.1, Đ6, Đ7 là các NT thuộc nhóm trung gian

Mười bốn ngày sau gieo, có hai nhóm NT khác biệt rất có ý nghĩa được xếp theo

a, b, trong đó, nhóm a: giữa các NT X4, H1, H3, Đ7, A3II, Đ5.1, P4.1, ĐP4 sự khác biệt giữa các NT không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự a Nhóm b: giữa các NT H1, H3, A3I, X5, X6, Đ7,Đ6, Đ5.1, P4.1, ĐP4 và đối chứng thì sự khác biệt giữa các

NT không có ý nghĩa thống kê vì có chung ký tự b Các NT H1, H3, Đ 7, Đ 5.1, A3II, P4.1, Đ P4 là các NT trung gian vì thuộc cả hai nhóm

Hai mươi mốt ngày sau gieo có ba nhóm NT khác biệt rất có ý nghĩa được xếp theo thứ tự a, b, c Trong đó NT X4 và đối chứng là có sự khác biệt với nhau rất có ý nghĩa thống kê Các NT còn lại là NT trung gian vì thuộc cả hai nhóm a và b

Hình 4.3: Chiều dài rễ đậu xanh tại 14 ngày sau gieo

Sau khi chủng 12 chủng vi khuẩn lên giống đậu xanh APN 208 ở trong đất thì kết quả có bốn chủng vi khuẩn thiết lập mối quan hệ cộng sinh với rễ cây đậu xanh, cả

bốn chủng vi khuẩn: X4, H1, H3, A3I đều thuộc chi Bradyrhizobium, bắt màu xanh

trên môi trường Bromthymol Blue Tám chủng vi khuẩn không thiết lập quan hệ cộng

sinh với rễ cây đậu xanh thuộc chi Rhizobium, bắt màu vàng trên môi trường

Bromthymol Blue (Bảng 4.4) và ở nghiệm thức đối chứng cũng không có nốt sần

Bảng 4.4: Quan hệ cộng sinh của 12 chủng vi khuẩn với rễ cây đậu xanh

Tên chủng vi khuẩn (VK) Quan hệ cộng sinh với rễ đậu xanh

Hình 4.4: Nốt sần hữu hiệu tại 7 ngày sau gieo a) Chủng vi khuẩn X4; b) Chủng vi khuẩn H1

c) Chủng vi khuẩn H3; d) Chủng vi khuẩn A3I