KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiataL. Wilczek) TỪ RỄ in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiataL Wilczek) TỪ RỄ in vitro Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : MAI THỊ THÚY TÌNH Niên khóa : 2009 – 2013 Tháng 6/2013   BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN Q TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiataL Wilczek) TỪ RỄ in vitro Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TƠN BẢO LINH MAI THỊ THÚY TÌNH Tháng 6/2013   TÓM TẮT Cây đậu xanh loại đậu đỗ quan trọng nông nghiệp Đậu xanh chủ yếu trồng lấy hạt để chế biến thức ăn, ngồi đậu xanh coi thứ dược liệu có lợi cho sức khỏe người Đậu xanh trồng từ lâu đờinhưng bị xem trồng phụ tận dụng đất đai, lao động nên suất khiêm tốn Bên cạnh đó, giống đậu xanh trồng Việt Nam chủ yếu giống có khả chịu hạn thường bị nhiễm bệnh Hiện nay, công nghệ gen sử dụng để tạo giống đậu xanh có suất, chất lượng tốt, chống chịu điều kiện thời tiết khắc nghiệt phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium Vì cần có hệ thống tái sinh để tạo trồng chuyển gen, đặc biệt chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Nội dung nghiên cứu thực thơng qua ni cấy chóp rễ, qua trình cảm ứng tạo sẹo khảo sát chất kích thích tăng trưởng lên q trình tạo chồi.Hạt đậu xanh nuôi cấy môi trường MS bản, thu mẫu chóp rễ đoạn rễ in vitro ngày tuổivà sử dụng cho trình cảm ứng tạo mô sẹo môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l 2,4D kết hợp với 0,5 mg/l kinetin Mô sẹo phát sinh sau tuần nuôi cấy điều kiện tối hồn tồn Sau chuyển mơ sẹo sang mơi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng với nồng độ khác để tạo chồi i   SUMMARY Mung bean is an important legume crop of agriculture The mung beanis grown primarily for processing grain foods, besides thatmung bean is considered as a valuable herb for health Mung beans have been grown for a long time but were considered secondary crops so that save land and labor productivity should be very modest Besides, mung bean varieties grown in Vietnam is mainly the same low drought tolerant and often become infected To day, gene engenering be used to created mung bean genus with high yield, good quality, can withstand harsh weather conditions by means of gene transfer by Agrobacterium So the regeneration system is need for gene modiflied plant, specialy in gene modifly by using Agrobacterium rhizogenes The study is about root tip culture, processing of callus induction and surveyeffect of plant growth regulators on the shoot formation of mung bean Mung bean were grown onMS medium, root tip samplesin vitro is used for callus induction Samples were cultured on MS medium supplemented 2,4D 0.2 mg/l+ kinetin 0.5 mg/l Callus inducted from samples after weeks in dark conditions Then, callus were cultured on the medium which supplementwith BA, NAA in different concentrations for shoot formation Keywords: Mung bean,Vigna radiata L Wilczek, root-tip, callus induction ii   MỤC LỤC Trang Tóm tắt i Summary ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình vii Chương MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 Vật liệu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2.2Hóa chất thiết bị sử dụng cho thí nghiệm 2.2.3 Môi trường nuôi cấy 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tạo đậu xanh in vitro 2.3.2Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mơ sẹo từ chóp rễ đoạn rễ đậu xanhin vitro 2.3.3Thí nghiệm Khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả năngtái sinh chồitừ mơ sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro 2.3.4 Xử lý số liệu Chương Kết thảo luận 3.1 Kết tạo đậu xanh in vitro 3.2 Kết thu khảo sát ảnh hưởng 2,4Dvà kinetin đến cảm ứng tạo mô sẹo từ chóp rễ đoạn rễ đậu xanhin vitro 3.3 Kết thu khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả năngtái sinh chồitừ mô sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro 14 iii   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 17 4.1 Kết luận 17 4.2 Đề nghị 17 iv   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT MS : Murashige Skoog 2,4 – D : 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid Kinetin : – furfurylaminopurine BA : N6– Benzyladenine NAA : α–Naphthalene acetic acid Cs : Cộng v   DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mơ sẹo chóp rễ đậu xanhin vitro Bảng 2.2Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mô sẹo đoạn rễ đậu xanhin vitro Bảng 2.3Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro Bảng3.1 Kết tạo đậu xanh in vitro Bảng 3.2 Sự đáp ứng mẫu chóp rễ mơi trường ni cấy theo thời gian điều kiện tối hoàn toàn Bảng 3.3 Sự đáp ứng mẫu đoạn rễ môi trường nuôi cấy theo thời gian điều kiện tối hoàn toàn 10 Bảng 3.4Ảnh hưởng 2,4D kinetin đến số lượng đường kính (ĐK) mơ sẹo mẫu chóp rễ đậu xanh 12 Bảng 3.5Ảnh hưởng 2,4D kinetin đến số lượng đường kính mơ sẹo mẫu đoạn rễ đậu xanh 13   vi   DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1Hạt đậu xanh Hình 3.1 Hạt đậu xanh đậu xanhin vitro Hình 3.2 Các loại mơ sẹo Hình 3.3Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 20 ngày nuôi cấy nghiệm thức Hình 3.4Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 14 ngày nuôi cấy nghiệm thức 10 Hình 3.5Mơ sẹo mẫu đoạn rễ sau 14 ngày ni cấy nghiệm thức 11 Hình 3.6Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 30 ngày ni cấy môi trường tạo chồi 16 vii   Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) loại đậu đỗ quan trọng nông nghiệp Châu Á Cây đậu xanh chủ yếu trồng lấy hạt để chế biến thức ăn giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu xanh Bên cạnh đậu xanh coi thứ dược liệu có tác dụng giải độc nhiệt, bớt sưng phù, điều hòa ngũ tạng chữa bệnh cho người Hạt đậu xanh mặt hàng nơng sản có giá trị xuất Ngoài hạt, non đậu xanh làm rau, muối dưa; thân xanh làm thức ăn chăn nuôi Trồng đậu xanh có tác dụng chống xói mòn cải tạo đất Ở  Việt Nam, đậu xanh trồng lâu đời, khắp nơi nước, bị xem trồng phụ tận dụng đất đai, lao động nên suất khiêm tốn Chỉ thời gian gần đậu xanh quan tâm phát triển Tuy nhiên, giống đậu xanh trồng Việt Nam chủ yếu giống có khả chịu hạn thường bị nhiễm số bệnh Hiện nay, công nghệ gen sử dụng để tạo giống đậu xanhcó chất lượng tốt, suất cao ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả chống chịu hạn, úng, sâu bệnh tốt chịu thâm canh phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.Vì cần có hệ thống tái sinh để tạo trồng chuyển gen, đặc biệt chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vi khuẩn có khả tạo rễ tóc biến đổi gen dễ sử dụng Agrobacteriumtumefaciens Do đó, nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng số chất kích thích tăng trưởng lên trình tái sinh đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) từ rễ in vitro” thực sở đểtiến hành trình chuyển gen đậu xanh thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogeneses 1.2 Yêu cầu đề tài Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng vị trí lấy mẫu tốt cho cảm ứng tạo sẹo từ chóp rễ đậu xanh in vitro Xác định môi trường tối ưu cho trình phát sinh phơi vơ tính tái sinh chồi từ mô sẹo   Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Đề tài thực từ tháng 12 năm 2012 đến hết tháng năm 2013 Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật, Bộ môn Công Nghệ sinh học, Trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 2.2 Vật liệu 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu Hạt giống đậu xanh TN 182 sản xuất Công ty TNHH– TM Trang Nơng, Bình Chánh, TP.HCM sử dụng hạt to, tròn, đẹp, có kích thước tương đối để thực đề tài Hình 2.1 Hạt đậu xanh 2.2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng cho thí nghiệm Hóa chất: Mơi trường MS, 2,4D, NAA, BA, kinetin, khoáng chất đa lượng, vi lượng, vitamine, ethanol, Javen, xà phòng nhiều hóa chất thơng dụng khác Thiết bị: Nồi hấp (Tomy, Nhật Bản), tủ cấy vô trùng (Thiên Trường, Việt Nam), máy đo pH (HANA Instruments), cân điện tử (XT 220 – Precisa, Thụy Sỹ), tủ sấy (Memmert, Đức), tủ lạnh (Toshiba, Nhật Bản) nhiều dụng cụ khác 2.2.3 Môi trường nuôi cấy Mơi trường sử dụng thí nghiệm mơi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) (thành phần môi trường xem phụ lục) có bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar Trong thí nghiệm khác nhau, tùy vào mục đích mà mơi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (2,4D, kinetin, BA NAA) nồng độ khác Môi trường nuôi cấy chứa chai thủy tinh loại 500ml,   250ml(thể tích mơi trường 50ml, 25 ml) Môi trường điều chỉnh đến pH 5,8 NaOH 1N HCl 10% trước hấp khử trùng autoclave nhiệt độ 121oC, áp suất atm 25 phút Các mẫu cấy môi trường đặt phòng tăng trưởng với nhiệt độ trung bình ln ổn định khoảng 25 + 2oC, cường độ chiếu sáng 2000 – 3000 lux thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Tạo đậu xanh in vitro Giai đoạn vơ mẫu thực theo qui trình củaNguyễn Thị Luyện(2009) Khử trùng ngồi phòng cấy: Hạt đậu xanh rửa nước máy, sau rửa xà phòng, cuối tráng lại nhiều lần nước cất xà phòng Khử trùng phòng cấy: Hạt đậu xanh khử trùng điều kiện vô trùng cồn 70% thời gian phút, tráng lại nước cất khử trùng đến lần Thêm dung dịch Javen60% lắc 20 – 25 phút, sau rửa nước cất khử trùng đến lần Ngâm hạt khử trùng nước cất vô trùng thời gian Sau giờ, lấy hạt đậu xanh cấy vào chai thủy tinh chứa sẵn môi trường nuôi cấy MS Chỉ tiêu theo dõi: - Tỉ lệ (%) mẫu sống: tỉ lệ phần trăm hạt nuôi cấy nảy mầm thành không bị nhiễm nấm, khuẩn sau thời gian nuôi cấy so với tổng số hạt cấy ban đầu Tỉ lệ mẫu sống = - Tổng số hạt nảy mầm không bị nhiễm x 100 Tổng số hạt thí nghiệm Tỉ lệ (%) mẫu chết: tỉ lệ phần trăm hạt nuôi cấy không nảy mầm, chếthoặc bị nhiễm nấm, khuẩn sau thời gian nuôi cấy so với tổng số hạt cấy ban đầu Tỉ lệ mẫu chết = Tổng số hạt không nảy mầm, chết x 100 Tổng số hạt thí nghiệm   2.3.2Thí nghiệm 1Khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mô sẹo từ chóp rễ đoạn rễ đậu xanhin vitro Mẫu chóp rễ mẫu đoạn rễ đậu xanh in vitro sau nuôi cấy5 ngày sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm Chóp rễ cắt với kích thước 0,5 –1 cm, mẫu đoạn rễ cắt tiếp sau cắt xong chóp rễ với kích thước – 1,5 cm Các mẫu ni cấy mơi trường MS có bổ sung 2,4D kinetin với nồng độ nêu ởbảng 2.1 bảng 2.2 Bảng 2.1Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mơ sẹo chóp rễ đậu xanhin vitro  Nghiệm thức Môi trường 2,4D (mg/l) Kinetin (mg/l) Số mẫu/chai Tổng mẫu DKC MS 0 12  DK0.3C MS  0,2 0,3 4  12  DK0.5C MS  0,2  0,5 4  12  DK0.7C MS  0,2  0,7 4  12  DK1C MS  0,2  1,0 4  12    Bảng 2.2Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mô sẹo đoạn rễ đậu xanhin vitro Nghiệm thức Môi trường 2,4D (mg/l) Kinetin (mg/l) Số mẫu/chai Tổng mẫu DKR MS 0 12  DK0.3R MS  0,2 0,3 4  12  DK0.5R MS  0,2  0,5 4  12  DK0.7R MS  0,2  0,7 4  12  DK1R MS  0,2  1,0 4  12  Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, lần lặp lại gồm 12 mẫu cho nghiệm thức Các mẫu cấy ni với điều kiện nhiệt độ tối hồn tồn 25 + 2oCtrong thời gian tuần để cảm ứng tạo mơ sẹo, sau chuyển mơ sẹo sang ni cấy ánh sáng trắng thời gian tuần để tái sinh hình thái từ mơ sẹo Chỉ tiêu theo dõi gồm: đáp ứng tạo sẹo mẫu chóp rễ mẫu đoạn rễ mơi trường ni cấy, số mẫu tạo sẹo, đường kính mơ sẹo (mm, đường kính   trung bình mơ sẹo), màu sắc hình thái mơ sẹo.So sánh cảm ứng tạo mơ sẹo từ mẫu chóp rễ mẫu đoạn rễ 2.3.3Thí nghiệm 2Khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả năngtái sinh chồitừ mô sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro Bảng 2.3Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả tái sinh chồi từ mơ sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) NAA (mg/l) Số mẫu/chai Tổng mẫu BN MS 0,0 0,0 4  12 B0.5N0 B0.5N0.3 MS 0,5 0,0 4  12 MS 0,5 0,3 4  12 B0.5N0.5 MS 0,5 0,5 4  12 B0.5N1 MS 0,5 1,0 4  12 B1N0 B1N0.3 MS 1,0 0,0 4  12 MS 1,0 0,3 4  12 B1N0.5 MS 1,0 0,5 4  12 B1N1 MS 1,0 1,0 4  12 Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, lần lặp lại gồm 12 mẫu cho nghiệm thức Vật liệu dùng cho thí nghiệm mẫu cảm ứng mơ sẹo từ nghiệm thức cho kết tốt thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi gồm: Sự phát sinh chồi từ mơ sẹo; tỉ lệ (%) mẫu hình thành chồi sau thời gian nuôi cấy; số rễ, chiều dài rễ chiều cao chồi (cm) 2.4 Xử lý số liệu Số liệu thu thập, mã hố phần mềm Excel xử lí thống kê phần mềm MSTATC, trắc nghiệm phân hạng kiểu LSD phân tích kết dựa vào kết từ bảng ANOVA   Chương 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1Kết tạo đậu xanh in vitro Hạt đậu xanh chọn lựa với kích thước tương đối (hình 3.1a), sau khử trùng tiến hành nuôi cấy môi trường MS (thành phần phụ lục), tạo thành đậu xanhin vitro (hình 3.1b) thu kết bảng 3.1 (a) (b) Hình 3.1 Hạt đậu xanh (a), đậu xanhin vitro sau ngày nuôi cấy(b) Bảng3.1 Kết tạo đậu xanh in vitro Tổng số mẫu Số mẫu sống Số mẫu chết Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) 200 191 95,5 4,5 Kết vô mẫu tạo đậu xanh in vitrođược ghi nhận bảng 3.1 Kết cho thấy số mẫu sống cao (191/200 hạt nảy mầm tạo thành không bị nhiễm), đạt tỉ lệ 95,5% Số mẫu chết thấp (9/200 hạt không nảy mầm nhiễm nấm),chỉ đạt tỉ lệ 4,5% Các bước khử trùng cho q trình vơ mẫu hạt tạo đậu xanh in vitro thực theo quy trình Nguyễn Thị Luyện (2009) Theo nghiên cứu tác giả cồn 70% javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả bị nhiễm bị thối thấp Do đó, thức theo thời gian nồng độ cho kết tạo đậu xanh tốt (bảng 3.1) Tuy nhiên, trình thực khử trùng hạt ngồi phòng cấy di chuyển vào phòng cấy, ngồi thao tác thực chưa tốt nên có hạt bị nhiễm chết, tỉ lệ thấp (chỉ 4,5%)   3.2Kết thu khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mô sẹo từ chóp rễ đoạn rễ đậu xanhin vitro Mẫu chóp rễ mẫu đoạn rễ đậu xanh in vitro sau nuôi cấy ngày đượcsử dụng tiến hành nuôi cấy môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác Trong q trình ni cấy điều kiện tối, loại mô phản ứng đáp ứng khác với mơi trường khác loại mơ sẹo hình thành khác Loại mơ sẹo tốt (hình 3.2a) mơ sẹo có kích thước lớn, sẹo lan rộng hết tồn mẫu chóp rễ mẫu đoạn rễ Loại mơ sẹo xấu (hình 3.2b) mơ sẹo có kích thước nhỏ, sẹo xuất đầu vết cắt phần nhỏ mẫu Cuối mô sẹo chết (hình 3.2c), mẫu có cảm ứng tạo sẹo sau thời gian (sau tuần) hóa nâu chết dần (b) (a) (c) Hình 3.2 Mơ sẹo tốt (a), Mô sẹo xấu (b), mô sẹo chết (c) Sau 10 ngày nuôi cấy điều kiện tối hồn tồn, mẫu chóp rễ có tượng phình lên cảm ứng tạo mô sẹo phần vết cắt sau lan dần đến vùng giữa.Ở phần chóp rễngồi tượng phần vết cắt thấy chóp rễ dài thêm từ 0,5 – 1,5 mm, có màu trắng đục, rõ rệt nghiệm thức DK0.3C (hình 3.3a) DK0.7C (hình 3.3b) Các mơ sẹo tiếp tục phát triển, tăng trưởng có màu vàng tuần nuôi cấy điều kiện tối a) b) Hình 3.3Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 20 ngày nuôi cấy nghiệm thức (a)Nghiệm thức DK0.3C: MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin; (b) Nghiệm thức DK0.7C MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin   Cũng mẫu chóp rễ, mẫu đoạn rễ sau 12 ngày có tượng phình lên cảm ứng tạo mơ sẹo hai đầu vết cắt sau lan đến vùng Tuy nhiên, mẫu đoạn rễ cảm ứng tạo mô sẹo chậm có kích thước nhỏ mẫu chóp rễ Ở tuần mô sẹo tiếp tục phát triển tăng trưởng Khi tiếp tục theo dõi thêm từ tuần trở đi, mô sẹo chuyển sang màu nâu vết cắt sau màu nâu dần chiếm vào phần đoạn rễ, làm cho đoạn rễ hóa nâu chết dần theo thời gian nuôi cấy So với nghiên cứu Đỗ Ngọc Thanh Mai (2012) chóp rễ tỏi ta (Allium sativum L.) có khác biệt rõ ràng Trên chóp rễ tỏi ta có tượng cảm ứng tạo mô sẹo nhiên đoạn rễ khơng có tượng Hai đầu vết cắt mẫu đoạn rễ chuyển sang màu nâu lan dần vào đoạn rễ theo thời gian mẫu chết dần Bảng 3.2 Sự đáp ứng mẫu chóp rễ mơi trường ni cấy theo thời gian điều kiện tối hoàn toàn Nghiệm thức Trạng thái mẫu chóp rễ sau thời gian ni cấy tuần Phần chóp kéo dài, có màu trắng đục, phần vết cắt có màu vàng DKC nâu, mọc thêm nhiều rễ nhỏ dọc theo chiều dài mẫu cấy DK0.3C DK0.5C DK0.7C DK1C chia rễ thành màu khác Phần chóp màu trắng đục, phần vết cắt có dấu hiệu chết hóa nâu Chóp rễ phình lên, dài ra, tạo sẹo, Chóp rễ phình lên, có cảm ứng có màu vàng nhạt tạo sẹo chóp rễ  Chóp rễ phình lên, tạo sẹo, có Chóp rễ phình lên, có cảm ứng màu vàng sáng tạo sẹo, có màu nâu vàng  Chóp rễ phình lên, dài ra, tạo sẹo, Chóp rễ phình lên, có cảm ứng có màu vàng nhạt tạo sẹo, có màu nâu vàng  Chóp rễ phình lên, tạo sẹo, có Chóp rễ phình lên, có cảm ứng màu vàng nhạt tạo sẹo ít    tuần Phần chóp rễ tiếp tục kéo dài, Hình 3.4Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 14 ngày nuôi cấy nghiệm thức (a)Nghiệm thức đối chứng ĐK: MS + mg/l 2,4D + mg/l kinetin; (b) Nghiệm thức DK0.3C:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin; (c) Nghiệm thức DK0.5C:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin; (d) Nghiệm thức DK0.7C:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin;(e) Nghiệm thức DK1C: MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin Bảng 3.3 Sự đáp ứng mẫu đoạn rễ môi trường nuôi cấy theo thời gian điều kiện tối hoàn toàn Nghiệm thức Trạng thái mẫu đoạn rễ sau thời gian nuôi cấy tuần Chiều dài đoạn rễ không thay đổi, DKR mọc thêm rễ nhỏ dọc theo chiều dài mẫu cấy, hai đầu vết cắt chuyển sang màu nâu DK0.3R DK0.5R DK0.7R DK1R Chiều dài đoạn rễ không thay đổi, tồn đoạn rễ hóa nâu có dấu hiệu chết Đoạn rễ phình lên, cảm ứng tạo Mơ sẹo hóa nâu, có dấu hiệu sẹo, có màu nâu  chết  Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mơ sẹo hóa nâu, có dấu hiệu sẹo, có màu nâu vàng  chết  Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mơ sẹo hóa nâu, có dấu hiệu sẹo, có màu nâu vàng  chết  Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mơ sẹo hóa nâu, có dấu hiệu sẹo ít, có màu nâu vàng  chết nhiều  10   tuần Hình 3.5Mơ sẹo mẫu đoạn rễ sau 14 ngày nuôi cấy nghiệm thức (a) Nghiệm thức đối chứng DR: MS + mg/l 2,4D + mg/l kinetin; (b) Nghiệm thức D0.3R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin; (c)Nghiệm thức D0.5R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin;(d) Nghiệm thức D0.7R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin; (e) Nghiệm thức D01R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin Đường kính mơ sẹo số lượng mẫu tạo sẹo nghiệm thức mẫu chóp rễ khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức p < 0,01(Bảng 3.4) Trên môi trường có bổ sung 0,2 mg/l 2,4Dvà kinetin với mức nồng độ từ 0,3 đến 0,5 mg/l đường kính số lượng mơ sẹo mẫu chóp rễ tăng tiếp tục gia tăng nồng độ kinetin lên 0,7 mg/l đường kính số lượng mơ sẹo giảm (tuy khơng có khác biệt mặt thống kê hai nghiệm thức 0,5 0,7 mg/l) tiếp tục giảm nồng độ kinetin mg/l Đường kính trung bình lớn nghiệm thức DK0.5C (3,5 mm) nghiệm thức DK0.7C (3,2 mm), đường kính trung bình nhỏ nghiệm thức DK0.3C (2,9 mm) nhỏ nghiệm thức DK1C (2,7 mm) Theo kết thí nghiệm từ bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức DK0.3C (0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin) cho số lượng mẫu tạo sẹo tương đối nhiều (9,3/12 mẫu cấy), đạt tỉ lệ 77,5% Ở nghiệm thứcDK0.5C (0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin) số lượng mẫu tạo sẹo nhiều (11/12 mẫu cấy), đạt tỉ lệ 91,67% Đối với nghiệm thức DK0.7C (0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin) số lượng mẫu tạo sẹo 10,3/12 mẫu cấy, đạt tỉ lệ 85,8% Do chênh lệch khơng đáng kể nên khơng có khác biệt mặt thống kê hai nghiệm thứcDK0.5C DK0.7C Ở nghiệm thức DK1C (0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin) số lượng mẫu tạo sẹo với nghiêm thức DK0.3C (9,3/12 mẫu cấy), đạt tỉ lệ 77,5% 11   Như vậy, từ kết bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức DK0.5C (0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin) vàDK0.7C (0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin)có số lượng mẫu tạo sẹo nhiều đường kính lớn Nghiệm thức có số lượng tạo sẹo thấp nhất, đường kính nhỏ DK0.3C (0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin) DK1C (0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin) Bảng 3.4Ảnh hưởng 2,4D kinetin đến số lượng đường kính (ĐK) mơ sẹo mẫu chóp rễ đậu xanh Nghiệm thức DK0.3C DK0.5C DK0.7C DK1C ANOVA CV (%) Kích thích tăng trưởng (mg/l) 2,4D Kinetin 0,2 0,3 0,2 0,5 0,2 0,7 0,2 1,0 ĐK mô sẹo (mm) 2,9b ± 0,2 3,5a ± 0,3 3,2ab ± 0,2 2,7b ± 0,1 ** 6,8 Số lượng mẫu tạo sẹo+ SD 9,3b ± 0,6 11,0a ± 0,00 10,3ab ± 0,6 9,3b ± 0,6 ** 5,0 **: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01 Trong cột, giá trị trung bình có kí tự giống khơng có khác biệt mặt thống kê Đường kính mơ sẹo số lượng mẫu tạo sẹo nghiệm thức mẫu đoạn rễ khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức p < 0,01(Bảng 3.5) Trên mơi trường có bổ sung 0,2 mg/l 2,4Dvà kinetin với mức nồng độ từ 0,3 đến 0,5 mg/l đường kính số lượng mô sẹo mẫu đoạn rễ tăng tiếp tục gia tăng nồng độ kinetin lên 0,7 mg/l đường kính số lượng mơ sẹo giảm tiếp tục giảm nồng độ kinetin mg/l Đường kính trung bình lớn nghiệm thức DK0.5R (2,8 mm), nhỏ nghiệm thức DK0.3R (1,9 mm) DK0.7R (2,0 mm) nhỏ nghiệm thức DK1R (1,2 mm) Theo kết thí nghiệm từ bảng 3.5 cho thấy nghiệm thức DK0.5R (0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin) có số lượng mẫu tạo mơ sẹo tương đối nhiều (9/12 mẫu cấy) đạt tỉ lệ 75% Số lượng mẫu tạo sẹo nghiệm thức DK0.3R (0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin) với 7/12 mẫu cấy đạt tỉ lệ 58,3% nghiệm thức DK0.7R (0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin) với 6,7/12 mẫu cấy đạt tỉ lệ 55,8% Tuy nhiên khơng có khác biệt mặt thống kê hai nghiệm thức Nghiệm thức có số lượng mẫu tạo mơ sẹothấp (4,7/12 mẫu cấy) DK1R (0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin), đạt 39,2% 12   Như vậy, nghiệm thức DK0.5R có số lượng mẫu tạo sẹo nhiều đường kính lớn Nghiệm thức có số lượng tạo sẹo thấp đường kính nhỏ DK1R (bảng 3.5) Bảng 3.5Ảnh hưởng 2,4D kinetin đến số lượng đường kính mơ sẹo mẫu đoạn rễ đậu xanh Nghiệm thức DK0.3R DK0.5R DK0.7R DK1R ANOVA CV (%) Kích thích tăng trưởng (mg/l) 2,4D Kinetin 0,2 0,3 0,2 0,5 0,2 0,7 0,2 1,0 ĐK mô sẹo (mm) 1,9b± 0,1 2,8a ± 0,1 2,0b ± 0,1 1,2c ± 0,2 ** 6,3 Số lượng mẫu tạo sẹo+ SD 7,0b ± 0,0 9,0a ± 0,0 6,7b ± 0,6 4,7c ± 0,6 ** 6,0 **: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01 Trong cột, giá trị trung bình có kí tự giống khơng có khác biệt mặt thống kê Như vậy, từ kết bảng 3.4 bảng 3.5 với nồng độ tương ứng với nghiệm thức đường kính mơ sẹo mẫu chóp rễ (đường kính lớn nghiệm thức DK0.5C 3,5 mm) lớn so với mẫu đoạn rễ (2,8 mm nghiệm thức DK0.5R) Bên cạnh số lượng mẫu tạo sẹo nghiệm thức DK0.5C 11/12 mẫu cấy từ chóp rễ nhiều so với mẫu đoạn rễ 9/12 mẫu cấy nghiệm thức DK0.5R Ngoài ra, chất lượng sẹo chóp rễ tốt so với mẫu đoạn rễ Cytokinin có tác dụng kích thích phân chia tế bào, nhiên, cytokinin lại dễ bịphân giải hoạt động enzyme cytokinin oxydase Để khắc phục, cytokinin cần kết hợp với auxin hình thành tăng sinh mơ sẹo, auxin có tác dụng giúp phân chia tế bào giảm hoạt tính enzyme cytokinin oxydase (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2010) Rao cs (2005) sử dụng 2,4D kết hợp kinetine với nồng độ 9,05 + 4,60 µM/lcho cảm ứng tạo mô sẹo trụ mầm đậu xanh cho kết tốt Do đó, việc kết hợp 2,4D kinetin thí nghiệm giúp việc hình thành mơ sẹo tốt Tuy nhiên, Mai Trần Ngọc Tiếng (2001) cho tăng trưởng tế bào chậm dần ngưng tăng trưởng thường yếu tố cần thiết môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt môi trường có chứa thành phần trở thành độc tố tế bào Trong thí nghịêm này, kinetin bổ sung giai đoạn đầu có tác 13   dụng kích thích tế bào phân chia hình thành mơ sẹo, nhiên thời gian cảm ứng lâu nồng độ cytokinin cao quay lại ức chế tăng trưởng.Mặt khác, Gaspar cs (1996) cho auxin diện mức độ làm giảm tích lũy cytokinin, ngược lại cytokinin ức chế vài hoạt tính auxin Điều giải thích cho việc tăng nồng độ Kinetin lên 0,7 1,0 mg/l đường kính mơ sẹo lại giảm Như vậy, từ bảng 3.4 bảng 3.5 cho thấy mẫu chóp rễ cảm ứng tạo mơ sẹo tốt hơn, theo thời gian nuôi cấy mô sẹo tăng trưởng nhiều Trong mẫu đoạn rễ cảm ứng tạo mơ sẹo sau thời gian ni cấy (sau tuần) mơ sẹo chuyển sang màu nâu chết dần Do đó, lấy mẫu chóp rễ có nồng độ 0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin (nghiệm thức DK0.5C) để tiến hành thí nghiệm 3.3 Kết thu khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến khả năngtái sinh chồitừ mô sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro Thí nghiệm thực với vật liệu mẫu mô sẹo ni cấy thí nghiệm Các mơ sẹo sau nuôi cấy môi trường MS + 0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin chuyển sang môi trường nuôi cấy tạo chồi Sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy mô sẹo tất nghiệm thức (hình 3.6) tiếp tục phát triển tăng sinh tạo thêm lượng mô sẹo (riêng với nghiệm thức đối chứng BN mô sẹo không tăng sinh chết dần) Cụ thể, nghiệm thức B0.5N0 mô sẹo tiếp tục phát triển tăng sinh sau tuần mơ sẹo bắt đầu hóa nâu, có mô sẹo tạo rễ màu trắng Cũng giống nghiệm thức B0.5N0, mô sẹo B0.5N0.3 tiếp tục tăng sinh hóa nâu nhiều theo thời gian ni cấy, có tạo rễ, hóa nâu phần mô sẹo làm mẫu phát triển Ở nghiệm thức B0.5N0.5 B0.5N1 mô sẹo tăng sinh tiếp tục phát triển, mô sẹo nghiệm thức có màu xanh, bóng khơng có khả cảm ứng tạo chồi Mơ sẹo tăng sinh, có màu xanh, xốp, phần hóa nâu nghiệm thức B1N0, làm cho mô sẹo nghiệm thức phát triển Với nghiệm thức B1N0.3, mơ sẹo có tăng sinh hóa nâu gần hết mẫu chết dần, nên khơng có khả tái sinh Nghiệm thức B1N0.5, mơ sẹo tiếp tục tăng sinh, có màu xanh, bóng mơ sẹo tiếp tục tăng sinh khơng có khả tái sinh Ở nghiệm thức B1N1, mô sẹo tăng sinh hóa nâu gần hết mẫu dẫn đến mơ sẹo có khả chết khơng thể tái sinh Kết từ thí nghiệm nhận thấy ni cấy mơ sẹo từ chóp rễ đậu xanh in vitro môi trường nghiệm thức B0.5N0 (0,5 mg/l BA) vàB0.5N0.3 (0,5 mg/l 14   BA + 0,3 mg/l NAA) mô sẹo tăng sinh tạo rễ Còn nghiệm thức lại khơng có khả tái sinh chồi Hiện tượng mẫu mô sẹo bị hóa xanh, giải thích mơ sẹo tạo từ mơ hay quan có chứa diệp lục có khả quang hợp (Street, 1969) Mơ sẹo chứa diệp lục tố phụ thuộc vào lượng đường bổ sung môi trường nuôi cấy cường độ ánh sáng (Vasil Hildebrandt, 1966) Do hóa xanh mơ sẹo thí nghiệm cường độ ánh sáng cao kích thích hình thành diệp lục tố làm biến đổi độ cứng, màu sắc cấu trúc mô sẹo, từ vàng, mềm, ướt sang xanh, cứng, Điều đề cập đến nuôi cấy mô sẹo Salvia officinalis L., loại thuộc họ hoa môi (Oana-Maria, 2010) Nguyễn Bá Nam cs (2010) cho số lồi cây, ni cấy mơ sẹo điều kiện ánh sáng xảy tượng tiết phenol mơi trường, hợp chất ngăn cản hấp thụ chất điều hòa sinh trưởng thực vật tế bào Do đó, nồng độ BA NAA bổ sung thí nghiệm bị phần tượng dẫn đến việc chưa có kích ứng tạo chồi Ngồi ra, nồng độ kết hợp hai chất chưa thích hợp nên chưa thể tái sinh chồi Trong q trình thực thí nghiệm sử dụng BA có nồng độ từ 0,5 đến mg/l để tái sinh chồi từ mơ sẹo chóp rễ đậu xanh Kết cho thấy mô sẹo lại tăng sinh có dấu hiệu chết dần Tuy nhiên, Nguyễn Thị Luyện (2009) sử dụng BA cho tái sinh đậu xanh từ mô sẹo phôi đậu xanh lại cho kết tốt nồng độ 2, mg/l Vì thế, tái sinh chồi từ mơ sẹo chóp rễ đậu xanh cần nghiên cứu thêm để kết hợp BA (hoặc chất khác thuộc nhóm cytokinin) với loại chất kích thíchtăng trưởng thuộc nhóm auxin giúp cho q trình tạo chồi 15   Hình 3.6Mơ sẹo mẫu chóp rễ sau 30 ngày ni cấy mơi trường tạo chồi nghiệm thức (a)B0.5N0: MS+ 0,5 mg/l BA + mg/l NAA; (b) B0.5N3: MS+ 0,5 mg/l BA + 0.3 mg/l NAA; (c) B0.5N0.5: MS+ 0,5 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA; (d) B0.5N1: MS+ 0,5 mg/l BA + 1.0 mg/l NAA;(e) B1N0: MS+ 1.0 mg/l BA + mg/l NAA; (f) B1N0.3: MS+ 1.0 mg/l BA + 0.3 mg/l NAA; (g) B1N0.5: MS+ 1.0 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA; (h) (i) B1N1: MS+ 1.0 mg/l BA + 1.0 mg/l NAA 16   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sự cảm ứng tạo mơ sẹo mẫu chóp rễ tốt so với mẫu đoạn rễ chất lượng đường kính mơ sẹo Mơi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l 2,4D 0,5 mg/l kinetin thích hợp để sử dụng cho cảm ứng hình thành mơ sẹo điều kiện tối tuần nuôi cấy Mô sẹo tăng sinh mơi trường MS bổ sung BA kết hợp NAA theo nồng độ:B0.5N0.5: MS+ 0,5 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA; B0.5N1: MS+ 0,5 mg/l BA + 1.0 mg/l NAA; B1N0: MS+ 1.0 mg/l BA + mg/l NAA; B1N0.5: MS+ 1.0 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA, nhiên không cảm ứng tạo chồi 4.2 Đề nghị Tiếp tục khảo sát nồng độ chất kích thích tăng trưởng khác để tái sinh chồi từ mơ sẹo chóp rễ đậu xanh in vitro phục vụ cho chuyển gen đậu xanh thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogeneses 17   ... HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiataL Wilczek) TỪ RỄ in vitro. .. đó, nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng số chất kích thích tăng trưởng lên trình tái sinh đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) từ rễ in vitro thực sở đểtiến hành trình chuyển gen đậu xanh thông qua... thực Khảo sát ảnh hưởng 2,4D kinetin đến cảm ứng tạo mơ sẹo từ chóp rễ đoạn rễ đậu xanh in vitro Khảo sát ảnh hưởng BA NAA đến phát sinh phơi vơ tính hình thànhchồi từ chóp rễ đậu xanh in vitro