KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ TRONG NUÔI CẤY IN VITRO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Hà Thị Loan Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 2/2011 đến tháng 6/2011.Với mục tiêu tìm ra nồn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ CHẤT HỮU

CƠ TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Sinh viên thực hiện: THÂN THỊ MINH PHƯƠNG

TP Hồ Chí Minh, tháng 08/2011

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ MỘT SỐ CHẤT HỮU

CƠ TRONG NUÔI CẤY IN VITRO

SÂM NGỌC LINH

(Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Tác giả

Thân Thị Minh Phương

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính công ơn sinh thành, giáo dưỡng của bố mẹ đã nuôi con khôn lớn Anh chị em, cùng những người thân trong gia đình đã động viên tinh thần, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong học tập

Chân thành cảm ơn:

O Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Nông học đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường

O Quý thầy cô khoa Nông học đã tận tình dạy bảo những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập

O Anh Quân, chị Thảo, chị Vy (các kỹ thuật viên của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM) đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

O Tập thể lớp Nông học 33 và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài

O Anh Phạm Thanh – Trung tâm Chuyển giao công nghệ Kon Tum đã tận tình giúp

đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin gởi lời tri ân sâu sắc đến cô Phạm Thị Minh Tâm và Th.S Hà Thị Loan (Trung tâm Công nghệ Sinh Học Tp.HCM) đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Tp HCM, tháng 08 năm 2011

TÓM TẮT

Thân Thị Minh Phương, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm

2011

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật và một

số chất hữu cơ trong nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.)”

Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Minh Tâm

Th.S Hà Thị Loan

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật thuộc Trung tâm

Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 2/2011 đến tháng 6/2011.Với mục tiêu tìm ra nồng độ thích hợp của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường để tạo mô sẹo, tăng trưởng phôi, tái sinh chồi và tăng trưởng chồi sâm

Ngọc Linh in vitro Đề tài gồm bốn thí nghiệm: Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng

của 2,4-D và TDZ đến khả năng tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân sâm Ngọc Linh Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ gồm khoai tây và nước dừa đến sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Kết quả đạt được như sau:

Thí nghiệm 1: Đối với cuống lá sâm Ngọc Linh, 2,4-D có tác dụng tạo mô sẹo tốt hơn TDZ Môi trường MS có bổ sung 1 mg 2,4-D/l MS tạo mô sẹo tốt nhất, sau 30 ngày nuôi cấy mô sẹo tạo được có đường kính 15,33 mm và trọng lượng tươi 441,67

mg

Thí nghiệm 2: Trong môi trường MS có bổ sung 1 mg BA/l và 0,5 mg NAA/l là

tốt nhất cho sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh in vitro Sau 60 ngày nuôi cấy, đường

kính phôi đạt 22,00 mm tăng 2,75 lần sau 60 ngày nuôi cấy, và trọng lượng phôi đạt 833,33 mg tăng 3,17 lần sau 60 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 3: Trong hầu hết các chỉ tiêu theo dõi, môi trường MS có bổ sung

thêm 1 mg BA/l và không có NAA là tốt nhất cho sự tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in

vitro Sau 60 ngày nuôi cấy chồi tái sinh có chiều cao 25,33 mm và đạt trọng lượng

tươi là 331,67 mg

Thí nghiệm 4: Thành phần hữu cơ như nước dừa và khoai tây có ảnh hưởng tốt đến sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh Ở nồng độ 10 ml nước dừa/l MS là tốt nhất, sau 30 ngày nuôi cấy, chồi đạt trọng lượng tươi 225,00 mg tăng 2,81 lần sau 30 ngày

nuôi cấy

MỤC LỤC

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình ảnh viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Giới hạn đề tài 3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu tổng quan về cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 4

2.1.1 Phân loại sâm 4

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 5

2.1.3 Đặc điểm hình thái sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 6

2.1.4 Đặc điểm sinh thái nhân sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 7

2.1.5 Giá trị dược liệu và giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 7

2.2 Tình hình trồng sâm Ngọc Linh tại Việt Nam 8

2.3 Một số nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 10

2.3.1 Sơ lược về phương pháp nuôi cấy in vitro 10

2.3.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu 16

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.3 Vật liệu nghiên cứu 16

3.4 Các thí nghiệm tiến hành 18

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh in vitro 18

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh in vitro 19

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro 21

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoai tây, nước dừa đến sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh in vitro 23

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo của cuống lá sâm Ngọc Linh in vitro 25

4.1.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự cảm ứng tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh 25

4.1.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến trọng lượng và đường kính mô sẹo sâm Ngọc Linh 26

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh in vitro 28

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tăng đường kính phôi sâm Ngọc Linh 28

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến trọng lượng tươi

phôi sâm Ngọc Linh 29

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro 31

4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro qua các giai đoạn 31

4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến số lá/chồi tái sinh sâm Ngọc Linh in vitro 34

4.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến chiều cao chồi tái sinh và trọng lượng tươi chồi tái sinh sâm Ngọc Linh in vitro 36

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoai tây, nước dừa đến sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh in vitro 39

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ khoai tây, nước dừa đến sự tăng chiều cao chồi và trọng lượng chồi sâm Ngọc Linh 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 1: GIÁ TRỊ CHUYỂN ĐỔI SỐ LIỆU 46

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 49

EDTA : Ethylene Diamino Tetra Acetic Acid

IAA : Indole-3-Acetic Acid

MS : môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA : α – napthylacetic acid

NSC : Ngày sau cấy

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) 17

Bảng 4.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh qua các giai đoạn 25

Bảng 4.2 Đường kính và trọng lượng mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 30 ngày nuôi cấy 26

Bảng 4.3 Đường kính phôi sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy 28

Bảng 4.4 Trọng lượng phôi trung bình sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy 30

Bảng 4.5 Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy 32

Bảng 4.6 Số lá trung bình/chồi tái sinh sâm Ngọc Linh qua các giai đoạn nuôi cấy 35

Bảng 4.7 Chiều cao chồi tái sinh chồi tái sinh sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy 37

Bảng 4.8 Trọng lượng tươi chồi tái sinh sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy 38

Bảng 4.9 Chiều cao chồi và trọng lượng chồi sâm Ngọc Linh sau 30 ngày nuôi cấy 39 

 

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Bộ phận trên mặt đất và dưới đất của sâm Ngọc Linh (lá, quả và thân rễ) 7 

Hình 3.1 Giống nhân sâm Ngọc Linh in vitro sử dụng trong thí nghiệm 16 Hình 4.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh sau 30 ngày nuôi cấy 28 Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tăng trưởng

phôi sâm Ngọc Linh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy 30 Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự tái sinh chồi sâm Ngọc

Linh in vitro sau 60 ngày nuôi cấy 38 Hình 4.4 Ảnh hưởng của nước dừa và khoai tây đến sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc

Linh in vitro 40 

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) còn gọi là sâm Việt Nam,

sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc hay cây thuốc giấu Là loại sâm quý được tìm thấy tại miền trung Trung Bộ Việt Nam Sâm Ngọc Linh là loại sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới - là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên thế giới

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sâm Ngọc Linh có tác dụng bổ dưỡng toàn thân, tăng sức lực Khi dùng cho bệnh nhân, phục hồi sức khỏe, bệnh nhân ăn ngon, tăng sức đề kháng đối với những yếu tố độc hại Khi dùng để điều trị bệnh gan cấp, sâm Ngọc Linh có tác dụng làm chức năng gan hồi phục nhanh chóng và làm giảm khả năng chuyển thành bệnh mãn tính Ngoài ra, nó còn có tác dụng điều hòa hoạt động tim mạch, phòng chống xơ vữa động mạch

Vì có giá trị kinh tế cao, sâm Ngọc Linh đã bị khai thác cạn kiệt và đứng trước nguy cơ tuyệt chủng, được xếp đầu bảng trong sách đỏ thực vật Việt Nam (1994) Năm 2009, Sở Y tế Quảng Nam đã chủ trương di thực hơn 40.000 cây sâm Ngọc Linh từ đỉnh núi Ngọc Linh về các xã Tr’hy, Ch’ơm, Phước Lộc đã phát triển tốt Tỷ lệ cây sống và phát triển bình thường đạt trên 80% Kết quả các mẫu xét nghiệm lấy từ sâm Ngọc Linh di thực, do Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm Trường Đại học Y Dược TP.HCM kiểm nghiệm, cho thấy chất lượng, hàm lượng tương đồng với mẫu sâm nguyên chủng mọc tự nhiên tại vùng núi Ngọc Linh (Hoàng Anh, 2009) Cũng trong năm 2009, Viện Dược liệu đã mạnh dạn di thực 1.000 cây sâm Ngọc Linh về trồng tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Tam Đảo và đỉnh núi Thiên Thị - điểm cao nhất của đỉnh núi Tam Đảo Sau hơn một năm di thực đến vùng đất mới, cây sâm sinh trưởng và phát triển rất tốt, tỷ lệ sống đạt trên 72% (Lâm Đào An, 2011)

Cây sâm, đặc biệt là sâm Ngọc Linh là một cây trồng rất khó tính, sinh trưởng rất chậm, một năm chỉ tăng trưởng được 1 - 2 g chất khô Sâm tự nhiên chỉ thu hoạch sau 7 năm trồng Ngoài ra, cây sâm rất khó để giống và nhân giống Hạt sâm rất khó nẩy mầm, phải sau một năm mới nứt nanh Tỷ lệ nẩy mầm lại rất thấp chỉ khoảng 30 - 40% Một cây lại chỉ có khoảng 2 - 10 hạt đạt tiêu chuẩn để trồng (Nguyễn Ngọc Dung, 1995) Do đó, việc nhân giống bằng hạt gặp rất nhiều khó khăn và tỷ lệ nhân giống lại rất thấp

Để đáp ứng được nguồn cây giống cho công tác di thực sâm Ngọc linh đến vùng đất mới và khắc phục những khó khăn trong nhân giống hữu tính Nhờ công nghệ

nuôi cấy in vitro có thể khắc phục được những trở ngại của điều kiện ngoại cảnh, đồng

thời có thể tạo ra một số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh trong một thời gian ngắn Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như BA, NAA, TDZ, 2,4-D và các

chất hữu cơ có vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro Để tìm hiểu ảnh hưởng

của những chất này lên nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng

của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật và một số chất hữu cơ trong nuôi

cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” đã được tiến

hành

1.2 Mục tiêu, yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

- Tìm được nồng độ thích hợp của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo từ cuống lá

sâm Ngọc Linh in vitro

- Tìm được nồng độ của BA kết hợp với NAA thích hợp đến sự tăng trưởng

phôi sâm Ngọc Linh in vitro

- Tìm được nồng độ của BA kết hợp với NAA thích hợp đến sự tạo chồi sâm

Ngọc Linh in vitro

- Tìm được nồng độ của khoai tây, nước dừa thích hợp đến sự tăng trưởng của

chồi sâm Ngọc Linh in vitro

1.2.2 Yêu cầu

- Theo dõi các chỉ tiêu về sự tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh

- Theo dõi các chỉ tiêu về sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh

- Theo dõi các chỉ tiêu về sự tạo chồi của sâm Ngọc Linh

- Theo dõi các chỉ tiêu về sự tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu tổng quan về cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.)

2.1.1 Phân loại sâm

Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam có rất nhiều loại sâm Để dễ phân biệt người ta thường gọi kèm theo tên địa phương hoặc màu sắc sâm

* Trên thế giới: có các loại sâm như:

+ Nhân sâm (Panax ginseng họ Araliaceae): được mô tả sớm nhất và được ứng

dụng phổ biến nhất Theo lịch sử y học cổ truyền của Trung Quốc từ 3000 năm trước Công nguyên, nhân sâm đã được nói đến như là một thần dược trong “Thần nông bản thảo” của vua Thần Nông

+ Đảng sâm (Codonopsis spp Họ Campanulaceae): mọc hoang và được gieo

trồng ở Thượng Đảng

+ Huyền sâm (Scrophularia họ Scrophulariaceae): có màu đen

+ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza họ Lamiaceae): có màu đỏ

+ Bố chính sâm (Hibicus sagittifolius họ Malvaceae): mọc hoang và được sản

suất ở Bố Trạch

+ Sa sâm (Launaea pinnatifida họ Asteraceaea) hay (Adenophora spp họ

Campanulaeae): loại sâm này thường mọc ở vùng đất pha cát

+ Thổ nhân sâm (Talinum spp họ Portulaceae)

+ Nam sâm (Schefflera octophylla họ Araliaceae)

+ Bàn long sâm (Spiranthes sinensis họ Orchidaceae)

+ Điền thất nhân sâm (sâm tam thất, Panax pseudoginseng họ Araliaceae) + Sâm Nhật Bản (Panax japonicas họ Araliaceae)

+ Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius): còn gọi là sâm Bắc Mỹ, sâm Hoa Kỳ

được coi là có tính mát, tính hàn, gần như đối nghịch với nhân sâm có tính ấm hay nhiệt (theo Albert leung, 1984)

+ Sâm Tây Bá Lợi Á (Eleutherococcus senticosus họ Araliaceae): còn gọi là

sâm Siberi, sâm Liên Xô

* Ở Việt Nam: có nhiều dược liệu có tên sâm được sử dụng lâu đời ở Việt Nam

như:

+ Bố chính sâm (Hibiscus sagittifolius var quinquelobus họ Malvaceae) thường

thấy ở Quảng Bình, Phú Yên

+ Sâm cau (Curculigo orchiodes họ Hypoxidaceae): mọc nhiều dưới tán rừng

xanh từ Lạng Sơn, Hòa Bình đến Đồng Nai

+ Sâm đại hành (Eleutherine subaphylla họ Iridaceae): mọc hoang ở khắp nơi

của Việt Nam

+ Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis họ Araliaceae): mọc tập trung ở các

huyện vùng núi Ngọc Linh thuộc Kon Tum và Quảng Nam ở độ cao 1.500 m - 2.100

m so với mực nước biển (Bách khoa toàn thư mở, 2010)

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

- Trước khi có sự phát hiện từ phía các nhà khoa học, sâm Ngọc Linh đã được các đồng bào dân tộc thiểu số trung Trung Bộ sử dụng như một loại củ rừng, chữa

nhiều loại bệnh theo các phương thức cổ truyền Năm 1973, khu Y tế trung Trung bộ

cử cán bộ đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô - tỉnh Kon Tum Sau nhiều ngày tìm kiếm, đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, dược sỹ Đào Kim Long

đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm Dược sỹ

Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Ngọc Linh này là Panax articulatus

KL Dao

Năm 1979, Ty Y tế Quảng Nam tổ chức điều tra ở 5 xã của huyện Trà My với

sự giúp đỡ của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, đã phát hiện nhiều củ sâm quý có tuổi đời hơn 50 năm tuổi, thậm chí có cây khoảng 82 năm tuổi có rễ, củ và thân

rễ dài hơn nửa mét Năm 1985, sâm Ngọc Linh với tên khoa học là Panax

vietnamensis Ha et Grushv họ Ngũ gia Araliaceae, được công bố tại Viện thực vật

Kamarov (Nga) do Hà Thị Dụng và I.V Grushvistky đặt tên (Thanh Hải, 2003)

Cây sâm Ngọc Linh được phát hiện ở độ cao 1.200 m trở lên, đạt mật độ cao nhất khoảng từ 1.700 – 2.000 m dưới tán rừng già, và cho tới nay chỉ có hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam là có cây sâm này Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh (Hà Thị Dụng và Grushvitzky I V., 1985) Tuy những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc ở cả núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đăcklây thuộc Kon Tum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này Hiện nay, nhờ công tác nghiên cứu cũng như những thành công trong công tác

di thực hy vọng sẽ mở rộng được diện tích trồng sâm Ngọc Linh của nước ta

2.1.3 Đặc điểm hình thái sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Sâm Ngọc Linh thuộc chi Panax, phân họ Aralioideae, họ Araliaceae, thuộc bộ Apiales (Hà Thị Dụng và Grushvitzky I V., 1985) có các đặc điểm hình thái như sau:

- Thân: Là loại cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 100 cm Trên thân có sẹo

và các đốt như đốt trúc do thân khí sinh rụng hàng năm để lại Sâm Ngọc Linh có dạng thân khí sinh thân đứng, màu lục hoặc hơi tím, nhỏ, có đường kính thân khoảng 4 - 8

mm, thường tàn lụi hàng năm tuy thỉnh thoảng cũng tồn tại một vài thân trong vài năm Thân rễ có đường kính 1 - 2 cm, mọc bò ngang như củ hoàng tinh trên hoặc dưới mặt đất khoảng 1 - 3 cm, mang nhiều rễ nhánh và rễ củ Các thân mang lá và tương ứng với mỗi thân mang lá là một đốt dài khoảng 0,5 - 0,7 cm

- Lá: Lá kép hình chân vịt mọc vòng với 3 - 5 nhánh lá Cuống lá kép dài 6 - 12

mm, mang 5 lá chét, lá chét ở chính giữa lớn nhất với độ dài 12 - 15 cm, rộng 3 - 4 cm Phiến lá chét hình bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, lá có lông ở cả hai mặt

- Hoa: Cây 4 - 5 năm tuổi có hoa Hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân, cuống tán hoa dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính Mỗi tán có 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1,5 cm, có 5 lá đài, 5 cánh hoa màu vàng nhạt, 5 nhị Bầu thường có một ô và một vòi, đôi khi hai ô, hai vòi (Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996)

- Quả và hạt: Quả mọc tập trung ở trung tâm của tán, dài khoảng 0,8 - 1 cm, rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm Sau hai tháng bắt đầu chuyển từ màu xanh đến xanh thẫm,

vàng lục, khi chín ngã màu đỏ cam với một chấm đen không đều ở đỉnh quả Mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt Quả có hạt hình thận, đôi khi có hai hạt hình cầu hơi dẹt Trung bình mỗi cây có khoảng 10 - 30 quả (Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996)

Hình 2.1 : Bộ phận trên mặt đất và dưới đất của sâm Ngọc Linh (lá, quả và thân rễ)

(Bách khoa toàn thư mở, 2010)

2.1.4 Đặc điểm sinh thái nhân sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Cây sâm được phát hiện ở độ cao từ 1.200 m trở lên, cho tới nay mới chỉ phát hiện có sâm Ngọc Linh ở Kon Tum và Quảng Nam Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.578 m Sâm mọc chủ yếu dưới tán rừng già, có tầng đất mặt là đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50 cm, có độ mùn cao, tơi xốp Sâm Ngọc Linh thích hợp với cường độ ánh sáng yếu 1/3 ánh sáng toàn phần, thường mọc dưới tán rừng ẩm Nhiệt độ ban ngày khoảng 20 - 250C, ban đêm 15 - 180C (Hà Thị Dụng và Grushvitzky I V., 1985)

Mùa ra hoa tháng 4 – 6, mùa quả chín tháng 7 – 8 Tái sinh bằng hạt và bằng các đoạn thân rễ (Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996)

2.1.5 Giá trị dược liệu và giá trị kinh tế của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.)

Thân rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh chứa 32 hợp chất saponin triterpen, trong đó có

30 chất là saponin dammaran - là thành phần hợp chất có tác dụng sinh học chủ yếu của sâm Hàm lượng saponin toàn phần rất cao chiếm đến 10,75% ở thân rễ cây mọc hoang Ngoài ra, trong thân rễ sâm còn chứa 7 hợp chất polyacetylen; 17 acid béo trong đó có các acid palmitic, stearic, oleic, linoleic và linolenic; 18 acid amin trong đó

có đủ 8 loại acid amin cần thiết cho cơ thể; 20 nguyên tố vi lượng trong đó có Fe, Mu,

Co, Se, K, và các thành phần khác là glucid, tinh dầu (Đỗ Huy Bích và cộng sự, 2004) Theo kết quả nghiên cứu từ năm 1978 của Bộ Y tế trong thân rễ của Sâm Ngọc Linh chứa hơn 50 hoạt chất trong đó có 26 hợp chất saponin có cấu trúc hoá học đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới không có trong các loại nhân sâm khác (trong khi Sâm Hàn Quốc chỉ có khoảng 25 loại saponin) (Trần Lê Quân và cộng sự, 2001) Trong lá và cọng phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới (Nguyen M.D và cộng sự, 1993) Những kết quả nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học mới nhất còn kéo dài danh sách các saponin của sâm Ngọc Linh hơn nữa, lên tổng cộng 52 loại Như vậy, sâm Ngọc Linh là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu

và sử dụng từ lâu trên thế giới (Nguyễn Thượng Dong và cộng sự, 2007)

Với thành phần hóa học như vậy, sâm Ngọc Linh có tác dụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tác dụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp hồi phục sức lực tương tự nhân sâm; làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước những bất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục số hồng cầu, bạch cầu bị giảm; tăng nội tiết

tố sinh dục; kháng viêm; điều hoà hoạt động của tim; hạ cholesterol máu, chống xơ vữa động mạch; giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng (Nguyen M.D và cộng sự, 1999)

Hợp chất hóa học đa dạng và tác dụng thực tiễn đối với sức khỏe của con người khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá ngày càng cao, thậm chí còn cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần Hơn thế nữa, sâm Ngọc Linh là một loại sâm quý và hiếm thấy nên giá trị của nó trên thị trường càng được đẩy lên cao Giá hiện nay của sâm Ngọc Linh tự nhiên khô là 200 triệu đồng/kg còn sâm tươi là 50 – 70 triệu đồng/kg Sâm tươi trồng có giá là 25 triều đồng/kg, và sâm trồng khô có giá là 75 triệu đồng/kg nhưng cũng không có để cung ứng (Mỹ Hằng, 2009)

2.2 Tình hình trồng sâm Ngọc Linh tại Việt Nam

Sau khi dược tính và tác dụng đối với sức khỏe của sâm Ngọc Linh được công

bố công khai trên các phương tiện thông tin đại chúng, những năm 80 của thế kỷ 20, trên thị trường tự do giá sâm Ngọc Linh tương đương giá sâm Triều Tiên và vào

những năm 90, giá sâm Ngọc Linh còn đắt hơn sâm Triều Tiên nhiều lần Việc khai thác, mua bán và sử dụng tràn lan chưa có quy định quản lý, bảo vệ cùng các chính sách, giải pháp đầu tư, quy hoạch phát triển khiến hơn 108 vùng sâm mọc tự nhiên giữa Quảng Nam và Kon Tum dần cạn kiệt, kéo theo hàng ngàn hecta rừng nguyên sinh bị tàn phá nặng nề (Khoa học và Công nghệ Kon Tum, 2010) Trước nguy cơ tuyệt chủng của giống sâm quý, Chính phủ Việt Nam đã quyết định thành lập vùng cấm quốc gia ở khu vực có sâm mọc tập trung tại hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam, đồng thời xếp sâm Ngọc Linh vào danh sách các loại cây cấm khai thác, mua bán bất hợp pháp

Để bảo vệ và phát triển cây thuốc quý này cùng một số cây dược liệu khác, rại dược liệu Trà Linh được thành lập tại Quảng Nam Tính đến tháng 4 năm 1987, trại đã thu được 53,3 kg thân rễ, trồng được 81.000 cây sâm và đến tháng 9 năm 1992 trại đã

có 100.000 cây Từ năm 1985, Trại đã áp dụng các biện pháp bón phân và chăm sóc để tăng năng suất thân rễ, tăng tỷ lệ nẩy mầm và tỷ lệ cây sống

Từ tháng 1 năm 1995, công việc nghiên cứu gieo trồng sâm Ngọc Linh được tiến hành một cách có hệ thống hơn tại Trại Dược liệu Trà Linh, với việc nhân giống bằng cây lai hữu tính và vô tính, gia tăng diện tích trồng, vận động bà con dân tộc thiểu số trong vùng nhận giống về trồng Kết quả từ những nỗ lực trên đã giúp tăng số hạt đậu trên cây, tỷ lệ nẩy mầm đạt 75% khi gieo trồng và tỷ lệ cây sống đạt 95% Cây nuôi cấy vô tính mọc khỏe, nhanh, ra hoa sớm và năng suất thân rễ và củ cao hơn so với cây mọc từ hạt (Bách khoa toàn thư mở, 2010)

Theo Thứ trưởng Bộ Y tế Cao Minh Quang, chủ trương của Chính phủ là đưa sâm Ngọc Linh thành sản phẩm quốc gia từ dược liệu (cùng Hồi và Trinh nữ hoàng cung) Chính phủ đang quyết liệt xây dựng cơ chế để sâm Ngọc Linh trở thành hàng hóa xuất khẩu với mục tiêu cuối cùng là sâm Ngọc Linh sẽ trở thành một sản phẩm quốc gia (Thảo My, 2010)

Sau hai năm nghiên cứu và nhân trồng thử nghiệm, năm 2010 công ty TNHH Hoa lan Thanh Quang đã nhân giống được khoản 50.000 cây giống sâm Ngọc Linh và

đã đưa ra trồng thử nghiệm tại khu vực nhà lưới tại Đà Lạt Sau một năm rưỡi những cây giống vô tính sâm Ngọc Linh tỏ ra khá thích nghi với điều kiện khí hậu, thổ

nhưỡng của Đà Lạt, tỷ lệ cây sống đạt khá cao (trên 75%), trong đó một số cây đã bắt đầu hình thành củ (Hứa Thiên Vương, 2010)

Cho đến nay, công tác khôi phục lại vùng trồng sâm Ngọc Linh tại Kon Tum cũng đã đạt được nhiều thành quả Tổng cộng diện tích trồng sâm Ngọc Linh đạt trên

20 ha, bao gồm của nhà nước, doanh nghiệp tư nhân và của đồng bào dân tộc thiểu số (Thảo My, 2010)

2.3 Một số nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha

et Grushv.)

2.3.1 Sơ lược về phương pháp nuôi cấy in vitro

2.3.1.1 Cơ sở khoa học và ý nghĩa của nuôi cấy in vitro trong nông nghiệp

Cơ sở khoa học của nuôi cấy in vitro:

- Do tế bào có tính toàn năng: Haberlandt (1902) đã đề cập đến tính toàn năng của tế bào Ông cho rằng, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể đa bào nào đều có khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan điểm hiện đại: mỗi tế bào hoàn chỉnh đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cả cá thể Đó là tính toàn năng của tế bào

- Do sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào, tức là từ tế bào ban đầu có thể tạo thành các tế bào chuyên hóa và chuyên biệt Các tế bào chuyên biệt ở các bộ phận thực vật lại có khả năng như một tế bào ban đầu Quá trình đó được gọi là sự phân hóa

và phản phân hóa của tế bào (Trần Văn Minh, 1994)

Ý nghĩa thực tiễn của nuôi cấy in vitro:

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006), ngoài tác dụng nghiên

cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy invitro còn có những đóng góp hết

sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống

Phương pháp nuôi cấy in vitro được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các

giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến Người ta đã sử

dụng phương pháp nuôi cấy in vitro và tế bào trong công tác chọn giống cây trồng

Phương pháp nuôi cấy in vitro còn có triển vọng sử dụng rộng rãi trong công

nghệ sinh học Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chỉ sau một thời gian ngắn chúng ta có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối được tạo ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính của mình, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tổng hợp các hợp chất thứ

cấp như ankaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kiềm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy in vitro tế bào là áp dụng kỹ

thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng Những lợi

ích trong việc áp dụng nuôi cấy in vitro trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp

được tóm tắt như sau:

- Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro hay

nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất

- Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

- Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến

Tóm lại, nuôi cấy in vitro hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to

lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong nông nghiệp

Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào đã trở thành một phần quan trọng trong các nghiên cứu ứng dụng khoa học vào cuộc sống nhằm phát triển nền kinh tế Tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ III (Đà Lạt - 12/1995) Nguyễn Văn Uyển cũng đã nêu 2 nhiệm vụ lớn của công nghệ sinh học ở nước ta từ nay đến năm 2010 là: 1) Tạo các giống cây trồng mới bằng phương pháp công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là công nghệ gen; 2) Nhân nhanh các giống, dòng ưu việt bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật Chính vì những ưu thế đó mà phương pháp nuôi cấy mô được ứng dụng để nhân giống rất nhiều loại cây trồng đặc biệt là các cây trồng khó nhân giống hữu tính như sâm Ngọc Linh

2.3.1.2 Sơ lược về một số chất điều hòa sinh trưởng và các chất hữu cơ sử dụng trong môi trường nuôi cấy

- Auxin: Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như: Indol acetic acid (IAA), Naphthyl acetic acid (NAA), 2,4-Dichlorphenol acetic acid (2,4D), Indol butyric acid (IBA) Trong đề tài này tôi sử dụng NAA và 2,4-D

NAA (α – napthylacetic acid ): không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy nhưng một khi đã được mô thực vật hấp thu thì tốc độ phân tách xảy ra nhanh chóng không chỉ do các tác nhân vật lý mà còn do tác động của các enzyme Ngoài ra, NAA

ít có tác dụng ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố hơn là 2,4-D (Nguyễn Đức Lượng và

Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

- Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời

ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi còn ngược lại auxin cao hơn thì kích thích sự tạo rễ (Dương Công Kiên, 2002) Trong đề tài này tôi sử dụng BA

và TDZ

BA (6-benzylaminopurine): là một dạng của cytokinin Có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng phát triển có hiệu quả liên tục bao gồm rễ, lá non, trái đang phát triển và hạt BA có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và tạo thành cơ quan Tuy nhiên, sự kết hợp của auxin/cytokinin sẽ ảnh hưởng lên sự tạo mô sẹo, rễ hay chồi BA có thể ức chế hoặc kích thích sự khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng

độ và thời gian xử lý Ngoài ra, BA còn có khả năng trì hoãn sự lão hóa và kích thích

sự vận chuyển chất dinh dưỡng và những hợp chất hữu cơ (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

TDZ là chất có cấu trúc thuộc nhóm chất phenyl urea có hoạt tính giống cytokinin (Mok và cộng sự, 1983; Thomas và Katterman, 1986) TDZ được sử dụng cho nhân giống thực vật thông qua con đường phát sinh cơ quan và phát sinh phôi trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau (Malik và Saxena, 1992; Zhou và cộng sự, 1994) TDZ có thể kích thích cảm ứng và nhân chồi cả khi được dùng riêng lẻ và khi dùng kết hợp với các chất điều hòa khác Ở cây hai lá mầm, TDZ có khả năng kích thích tạo chồi (Masimo và cộng sự, 1996; Eapen và cộng sự, 1998) Tuy nhiên, việc sử dụng TDZ trong nhân giống thực vật một lá mầm ít được báo cáo (Dương Tấn Nhựt, 2010)

- Nước dừa: Chất có hoạt tính chính trong nước dừa hiện đã được chứng minh

là myo-inositol (m-inositol) và một số acid amin khác Trong nước dừa có chứa 0,05% nitơ; 0,56% acid phosphoric; 0,25% Kali; 0,69% calci oxid; 0,59% magnesi oxid và nhiều thành phần khác như sắt, đường (Trần Văn Minh, 1994) Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006), myo – inositol được chứng minh là kích thích sự sinh trưởng của tế bào đa số loài thực vật

- Khoai tây: Được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như là một thành phần hữu

cơ Trung bình trong 100 g khoai tây có: hydratcabon 19 g (trong đó có 15 g tinh bột; 2,2 g chất xơ); 0,1 g chất béo; 3 g protein và 79 g nước Bên cạnh đó, khoai tây còn chứa vi chất dinh dưỡng giá trị, đặc biệt về các vitamin (bao gồm vitamin B1: 0,08 mg (8%), vitamin B2 0,03 mg (2%), vitamin B3 1,11 mg (7%), vitamin B6 (19%), vitamin

C 20 mg (33%) cùng với những khoáng chất như canxi 12 mg; sắt 1,8 mg; magiê 23 mg; photpho 57 mg; kali 421 mg; natri 6 mg (Trương Bút, 2011)

2.3.2 Các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro sâm Ngọc Linh

Năm 1993, Nguyễn Ngọc Dung thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây

sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) và tạo nguyên liệu sâm bằng công

nghệ sinh học Đã nghiên cứu được môi trường nuôi cấy đặc thù thích hợp để đạt kết quả tái sinh cây sâm Ngọc Linh

Năm 2006, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên

cứu về sự nhân sinh khối rễ của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis – nguồn vật liệu

cho phân lập saponin” đã xác định môi trường tối ưu cho sự phát sinh mô sẹo từ rễ của

sâm Ngọc Linh là môi trường MS có bổ sung 3 mg NAA/l, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar Và môi trường tối ưu cho sự nhân sinh khối rễ là cơ sở để áp dụng hệ thống bioreactor để làm vật liệu cho phân lập saponin là môi trường SH có bổ sung 3 mg NAA/l, 30 g/l sucrose

Năm 2007, Nguyễn Trung Thành và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu “Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối và sự tích lũy sản phẩm

ginsenoside trong nuôi cấy tế bào lỏng của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.)” Cho thấy, với nồng độ môi trường MS với tỷ lệ 50% hoặc 100% là thích hợp cho sự tích lũy sinh khối tế bào và sự tổng hợp sản phẩm thứ cấp ginsenoside Nồng độ đường trong môi trường cũng được thay đổi, kết quả cho thấy 30 g/l là thích hợp cho sự tích lũy sinh khối tế bào và sự tổng hợp sản phẩm ginsenoside Tương tự, ở nồng độ 30 mM nitrogen là tối ưu cho sự sinh trưởng tế bào và sự tích lũy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ginsenoside

Được sự giúp đỡ của Bộ Khoa học công nghệ, Bộ Quốc phòng và các nhà khoa học Hàn Quốc, Học viện Quân y đã thực hiện đề tài “Ứng dụng công nghệ Biomass tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh” Đây là công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp Kết quả cho ra khối lượng lớn tế bào chứa hoạt chất từ một hay một nhóm tế bào ban đầu Toàn bộ quy trình mất khoảng 10 – 20 ngày trong khi bình thường phải mất 6 năm mới có thu hoạch Đề tài này đã được đăng ký Bằng độc quyền sáng chế tại Cục Sở hữu trí tuệ, đoạt giải nhất Hội nghị Khoa học tuổi trẻ Học viện Quân y năm 2007 (Dương Văn Cường, 2008)

Năm 2008, Nguyễn Trung Thành và cộng sự đã thực hiện đề tài “Ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng đến sự tăng trưởng sinh khối và sự tích lũy sản phẩm ginsenoside trong nuôi cấy tế bào lỏng sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)” Kết quả cho thấy sinh khối thu được lớn nhất khi bổ sung NH4NO3 với nồng độ 0,5; nồng độ 1 của KNO3 là tối ưu cho sự sinh trưởng của tế bào và sản phẩm ginsenoside thu được lớn nhất ở nồng độ 2; nồng độ MgSO4 thay đổi từ 0,5 – 2 nhìn chung không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và tổng sản phẩm ginsenoside Sinh khối tế bào và thành phần ginsenoside tăng trưởng đáng kể khi bổ sung CaCl2 vào môi trường

Năm 2009, Nguyễn Thành Sum và cộng sự đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo

sát môi trường thích hợp tạo rễ bất định và nhân sinh khối sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro” Đã xác định môi trường MS có bổ sung 30 g

succor/l, 8 g agar/l, 3 mg 2,4D/l cho kết quả hình thành sẹo từ củ và rễ bất định tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy Môi trường tăng sinh khối rễ bất định khả quan nhất được lựa chọn là môi trường White có bổ sung 30 g succorse/l, 8 g agar/l, 3 mg NAA/l Năm 2009, Thượng tọa Thích Huệ Đăng sau ba năm đi tìm kiếm và nghiên cứu

về sâm Ngọc Linh đã đầu tư xây dựng phòng nuôi cấy mô và tiến hành nhân giống vô tính sâm Ngọc Linh Đến năm 2010, phòng nuôi cấy của Thượng tọa Thích Huệ Đăng

đã có khoảng 50.000 cá thể sâm Ngọc Linh được nhân giống vô tính (Lê Trọng, 2011) Năm 2010, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã thực hiện đề tài “Nhân giống vô

tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)” đã xác định môi trường

tối ưu nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung 1 mg 2,4-D/l kết hợp với 0,2 mg TDZ/l Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường SH bổ sung 1 mg BA/l, 1 mg NAA/l và 2 g than hoạt tính/l Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½ SH được bổ sung 1mg BA/l và 0,5 mg NAA/l, 50 g sucrose/l, 2 g than hoạt tính/l và được đặt trong điều kiện ánh sáng đèn LED 70% đỏ 30% xanh là tốt

nhất 1000 cây sâm in vitro sau 6 tháng trồng ngoài khu vực vườn ươm cho thấy tốc độ

sinh trưởng và phát triển nhanh hơn so với cây sâm Ngọc Linh trồng bằng hạt với tỷ lệ sống sót là 87%

Năm 2010, tại Hội thảo Quốc tế tháng 4/2010, Nguyễn Văn Kết và Trương Thị Lan Anh đã báo cáo đề tài “Ứng dụng bioreactor trong sản xuất thực vật” trong đó việc ứng dụng hệ thống bioreactor để sản xuất các hoạt chất sinh học đã thực hiện thành công trên nhiều đối tượng khác nhau Đặc biệt là việc sản xuất sinh khối sâm đã có những thành công đầu tiên trong việc sử dụng phương pháp này để tạo nguyên liệu phục vụ cho mục đích thương mại hóa Theo Son và cộng sự (1999), trong bioreactor

có dung tích 20 lít, người ta cấy 240 g rễ sâm thứ cấp, sau 42 ngày, trọng lượng rễ thu

được là 2,2 kg Người ta cũng đã chứng minh được rằng sâm nuôi cấy in vitro có khả

năng tổng hợp hoạt chất tương tự cây mẹ được dùng làm nguồn nguyên liệu thay thế cho nguồn sâm thiên nhiên khan hiếm

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm có 4 thí nghiệm với các nội dung như sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo từ cuống lá sâm

Ngọc Linh in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự tăng trưởng

phôi sâm Ngọc Linh in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tái

sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoai tây, nước dừa đến sự tăng trưởng chồi

sâm Ngọc Linh in vitro

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 02/2011 đến tháng 06/2011 tại Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM

3.3 Vật liệu nghiên cứu

* Giống

Cây giống nhân sâm Ngọc Linh in vitro thu thập tại Trung tâm Chuyển giao

công nghệ Kon Tum

Hình 3.1: Giống nhân sâm Ngọc Linh in vitro sử dụng trong thí nghiệm

* Môi trường nuôi cấy

Bảng 3.1: Môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

Nguyên tố mg/l Khoáng đa lượng

- Khoai tây: gọt bỏ vỏ, thái nhỏ đem nấu chín Sau đó, lọc lấy nước cho vào môi trường MS với các nồng độ khác nhau

- Nước dừa: lấy từ trái dừa non, đem lọc để loại bỏ cặn Cho vào môi trường

- Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8

- Môi trường được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút

- Điều kiện nuôi cấy

Độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux (ở thí nghiệm 2, 3, 4 riêng thí nghiệm 1 nuôi cấy trong điều kiện tối)

Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày

Ẩm độ trung bình 70 - 80 %

Nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 0C ± 2 0C

3.4 Các thí nghiệm tiến hành

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo

từ cuống lá sâm Ngọc Linh in vitro

3.4.1.1 Thời gian

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 21/2/2011 đến 21/3/2011

3.4.1.2 Phương pháp thí nghiệm

thước tương đồng khoảng 0,6 ± 0,2 cm cấy vào bình tam giác có chứa môi trường MS

có bổ sung 2,4-D hoặc TDZ với các nồng độ khác nhau

với 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại

- Tổng số mẫu cấy trong thí nghiệm: 180

- Tỷ lệ tạo mô sẹo: Tỷ lệ tạo mô sẹo = Số mẫu tạo mô sẹo/Số mẫu ban đầu Theo dõi định kỳ 7 ngày/lần

- Trọng lượng tươi của mô sẹo (mg/mô sẹo): Cân trọng lượng tươi của mô sẹo vào ngày thứ 30 sau cấy

- Đường kính mô sẹo (mm/mô sẹo): Đặt mẫu mô sẹo lên giấy kỹ thuật có chia milimet để đo đường kính mô sẹo vào ngày thứ 30 sau cấy

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ

NAA đến sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh in vitro

3.4.2.2 Phương pháp thí nghiệm

* Các bước thực hiện: Tách những cụm phôi (mẫu) có kích thước tương đồng

khoảng 0,5 ± 0,1 cm (đường kính phôi) cấy vào bình tam giác có chứa môi trường MS

có bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau

ngẫu nhiên, với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại

- Tổng số mẫu cấy trong thí nghiệm: 72

A1B2 A2B1 A2B2 A1B1 A2B2 A1B2 A1B1 A2B1 A2B1 A1B1 A1B2 A2B2

* Chỉ tiêu theo dõi

- Đường kính phôi (mm/phôi): Đặt cụm phôi lên giấy kỹ thuật có chia milimet

đã được hấp khử trùng đo đường kính cụm phôi vào ngày thứ 60 sau cấy

- Trọng lượng tươi cụm phôi (mg/phôi): Dùng cân điện tử đã được cách ly vô trùng cân trọng lượng tươi của cụm phôi vào ngày thứ 60 sau cấy

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ

NAA đến sự tái sinh chồi sâm Ngọc Linh in vitro

3.4.3.1 Thời gian

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 21/2/2011 đến ngày 28/4/2011

3.4.3.2 Phương pháp thí nghiệm

* Các bước thực hiện: Cắt những đoạn thân (mẫu) có kích thước tương đồng

khoảng 0,5 x 0,3 cm (đường kính thân x chiều dài thân) cấy vào bình tam giác có chứa môi trường MS có bổ sung BA và NAA với các nồng độ khác nhau

ngẫu nhiên, với 8 nghiệm thức, 3 lần lặp lại

* Chỉ tiêu theo dõi

- Tỷ lệ tái sinh chồi: Tỷ lệ tái sinh chồi = Số mẫu tái sinh chồi/Số mẫu ban đầu Theo dõi định kỳ 10 ngày/lần từ ngày cấy

- Số lá trung bình (lá/chồi): theo dõi định kỳ 10 ngày/lần bắt từ ngày thứ 20 sau cấy

- Trọng lượng tươi chồi (mg/chồi): dùng cân điện tử đã được cách ly vô trùng cân mẫu chồi của từng nghiệm thức vào ngày thứ 60 sau cấy

- Chiều cao chồi trung bình (mm/chồi): đo vào ngày thứ 60 sau cấy Dùng giấy

kỹ thuật có chia milimet đã được hấp khử trùng đặt trên giấy cấy Đo chiều dài chồi từ phần thân chồi tái sinh đến chóp lá

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khoai tây, nước dừa đến sự

tăng trưởng chồi sâm Ngọc Linh in vitro

3.4.4.1 Thời gian

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 29/4/2011 đến ngày 29/5/2011

3.4.4.2 Phương pháp thí nghiệm

cao khoảng 1 ± 0,2 cm), cấy vào bình tam giác có chứa môi trường MS có bổ sung 1

mg BA/l và nồng độ khoai tây, nước dừa khác nhau

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên,

7 nghiệm thức với 3 lần lặp lại

* Chỉ tiêu theo dõi

- Chiều cao chồi trung bình (mm/chồi): đo vào ngày thứ 30 sau cấy Dùng giấy

kỹ thuật có chia milimet đã được hấp khử trùng đặt trên giấy cấy Đo chiều dài chồi từ phần thân chồi tái sinh đến chóp lá

- Trọng lượng tươi chồi (mg/chồi): dùng cân điện tử đã được cách ly vô trùng cân mẫu chồi của từng nghiệm thức vào ngày thứ 30 sau cấy

3.5 Xử lý số liệu

Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1.3

NT5 NT1 ĐC NT6 NT2 NT3 NT4 NT2 NT4 NT1 NT3 NT16 ĐC NT5

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo của cuống lá

sâm Ngọc Linh in vitro

4.1.1 Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự cảm ứng tạo mô sẹo từ cuống lá sâm

Ngọc Linh

Bảng 4.1: Tỷ lệ tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh qua các giai đoạn

Ghi chú: Trong cùng một cột các giá trị trung bình không cùng ký tự thì khác biệt rất

có ý nghĩa trong thống kê (**: sự khác biệt ở mức α = 0,01)

Từ bảng 4.1 cho thấy:

Ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm đều tạo sẹo và có sự khác biệt giữa các

nghiệm thức rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) Ở 7 ngày sau cấy, tất cả các

nghiệm thức đều có cảm ứng tạo sẹo tuy nhiên tỷ lệ rất thấp, chỉ có môi trường MS có

bổ sung 1 mg 2,4-D/l là cao nhất

Đối với 2,4-D, nồng độ 1 mg/l MS cho tỷ lệ tạo mô sẹo và thời gian hình thành

mô sẹo nhanh nhất Ở các nồng độ 2,4-D cao hơn thì sự tạo mô sẹo yếu hơn Với nồng

độ 1 mg 2,4-D/l MS sau 7 ngày nuôi cấy tỷ lệ tạo sẹo là 0,60 và sau 28 ngày nuôi cấy

tỷ lệ này là 0,80 Ở nồng độ 2 mg/l MS sau 14 ngày nuôi cấy tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo.là

0,56 Ở nồng độ 3 mg/l MS sau 28 ngày nuôi cấy tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 0,33 và sự

khác biệt giữa các nghiệm thức rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01)

Đối với TDZ, tỷ lệ tạo mô sẹo rất thấp, cao nhất là ở nồng độ 0,1 mg/l MS với

tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 0,51 sau 28 ngày sau cấy và sự khác biệt với các nồng độ TDZ

khác rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) Ở các nồng độ 0,2 mg/l MS và 0,3 mg/l

MS thì tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo rất thấp và có hiện tượng mẫu bị bạc trắng và hóa nâu

TDZ có tác dụng tạo mô sẹo yếu hơn 2,4-D, ở nồng độ TDZ tạo mô sẹo lớn nhất (0,1

mg/l MS) tỷ lệ tạo mô sẹo (0,51) vẫn thấp hơn tỷ lệ tạo mô sẹo ở nồng độ 2,4-D tạo

mô sẹo đứng thứ hai (0,57 ở 2 mg 2,4-D/l MS) và sự khác biệt khác có ý nghĩa trong

thống kê (p ≤ 0,01)

Tóm lại: Trong môi trường có bổ sung 2,4-D có tác dụng tạo mô sẹo từ cuống

lá sâm Ngọc Linh tốt hơn môi trường có bổ sung TDZ Trong đó môi trường MS có bổ

sung 1 mg 2,4-D/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo tốt nhất

4.1.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến trọng lượng và đường kính mô sẹo sâm

Ngọc Linh

Bảng 4.2: Đường kính và trọng lượng tươi mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 30 ngày nuôi

cấy

Đường kính mô sẹo (mm) Trọng lượng tươi mô sẹo (mg)

Ghi chú: Trong cùng một cột các giá trị trung bình không cùng ký tự thì khác biệt rất

có ý nghĩa trong thống kê (**: sự khác biệt ở mức α = 0,01)

Từ kết quả bảng 4.2 cho thấy:

Về đường kính mô sẹo: Đối với 2,4-D, nồng độ cho mô sẹo lớn nhất là 1 mg/l

MS (đường kính mô sẹo là 15,33 mm), khi tăng nồng độ 2,4-D lên 2 mg/l MS và 3 mg/l MS thì mô sẹo tạo ra có đường kính nhỏ hơn và sự khác biệt giữa các nồng độ 2,4-D rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) TDZ tạo mô sẹo yếu hơn 2,4-D, nồng

độ TDZ tạo mô sẹo lớn nhất cũng là 0,1 mg/l MS (đường kính mô sẹo 10,00 mm) nhưng chỉ tương đương với nồng độ 2,4-D cho mô sẹo lớn thứ hai (đường kính mô sẹo 10,67 mm) Khi tăng nồng độ TDZ lên 0,2 mg/l MS và 0,3 mg/l MS thì mô sẹo được tạo ra cũng nhỏ dần và sự khác biệt giữa các nồng độ TDZ rất có ý nghĩa trong thống

kê (p ≤ 0,01)

Về trọng lượng mô sẹo: 2,4-D với nồng độ 1 mg/l MS cho mô sẹo có trọng lượng cao nhất (441,67 mg) và sự khác biệt với các nồng độ 2,4-D và TDZ khác nhau rất có ý nghĩa trong thống kê TDZ ở nồng độ 0,1 mg/l MS cũng cho mô sẹo có trọng lượng cao nhất (286,33 mg) và sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặc thống kê (p ≤ 0,01) Mặc dù TDZ ở nồng độ 0,1 mg/l MS tạo mô sẹo có đường kính nhỏ hơn 2,4-D ở nồng

độ 2 mg/l MS (10,00 mm < 10,67 mm) nhưng trọng lượng mô sẹo ở nồng độ 0,1 mg TDZ/l MS lại có trọng lượng lớn hơn mô sẹo tạo được ở nồng độ 2 mg 2,4-D/l MS (286,33 mg < 162,67 mg)

Tóm lại: 2,4-D có tác dụng tạo mô sẹo từ cuống lá tốt hơn TDZ và ở môi trường

MS có bổ sung 1 mg/l là tốt nhất

Mô sẹo tạo được từ môi trường có bổ sung 1 mg 2,4-D/l MS có màu trắng vàng sáng, mô sẹo phát triển đều và tốt nhất, mô sẹo không có hiện tượng bị đen như ở môi trường có 3 mg 2,4-D/l MS TDZ ở nồng độ 0,1 mg/l MS tạo mô sẹo có màu trắng xanh và ở nồng độ 0,3 mg/l MS cho hiện tượng mô sẹo bị ướt Kết quả trong thí nghiệm này đã bổ sung vào kết quả nghiên cứu về khả năng tạo mô sẹo từ cuống lá

sâm Ngọc Linh in vitro

Như vậy, môi trường tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc Linh được lựa chọn là môi trường MS có bổ sung 1 mg 2,4-D/l Kết quả trong thí nghiệm này khác với nghiên cứu tạo sẹo của Nguyễn Thành Sum và cộng sự (2009) Sự khác nhau này là do

bộ phận được lựa chọn để tạo sẹo khác nhau Đối với thí nghiệm tạo sẹo từ củ sâm

Ngọc Linh của Nguyễn Thành Sum thì môi trường MS có bổ sung 3 mg 2,4-D/l là

thích hợp nhất

Hình 4.1: Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến sự tạo mô sẹo từ cuống lá sâm Ngọc

Linh sau 30 ngày nuôi cấy

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ

NAA đến sự tăng trưởng phôi sâm Ngọc Linh in vitro

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến sự tăng đường kính phôi sâm Ngọc Linh

Bảng 4.3: Đường kính phôi sâm Ngọc Linh sau 60 ngày nuôi cấy

Kết quả bảng 4.3 cho ta thấy:

Môi trường MS có bổ sung NAA có ảnh hưởng đến sự tăng đường kính phôi và

sự khác biệt rất có ý nghĩa về trong thống kê giữ môi trường có bổ sung 0,1 mg/l MS

và 0,5 mg/l MS (p ≤ 0,01) Trong đó, tốt nhất là môi trường MS có bổ sung 0,5 mg NAA/l (đường kính phôi đạt 20,83 mm sau 60 ngày nuôi cấy)

Môi trường MS có bổ sung BA có ảnh hưởng đến sự tăng đường kính phôi Trong đó, nồng độ 2 mg/l cho kết quả tốt hơn nồng độ 1 mg/l nhưng không có sự khác biệt trong thống kê

Kết quả trắc nghiệm phân hạng cho yếu tố BA và NAA cho thấy, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) Môi trường MS

có sự kết hợp giữa BA và NAA cho kết quả tốt nhất ở nồng độ 0,5 mg NAA/l MS và 1

mg BA/l MS (đường kính phôi đạt 22,00 mm) tăng 2,75 lần sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường có sự kết hợp giữa 1 mg BA/l MS và 0,1 mg NAA/l MS cho kết quả thấp nhất (đường kính phôi đạt 14,33 mm) chỉ tăng 1,79 lần sau 60 ngày nuôi cấy Môi trường

có sự kết hợp giữa 2 mg BA/l MS với 0,1 mg NAA/l MS và môi trường kết hợp giữa 2

mg BA/l MS với 0,5 mg NAA/l MS thì đường kính phôi không có sự khác biệt trong thống kê

Tóm lại: môi trường MS có sự kết hợp giữa 1 mg BA/l và 0,5 mg NAA/l giúp tăng đường kính phôi tốt nhất và môi trường kết hợp giữa 1 mg BA/l và 0,1 mg NAA/l

có tác dụng tăng đường kính phôi yếu nhất

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với nồng độ NAA đến trọng lượng tươi phôi sâm Ngọc Linh

Kết quả bảng 4.4 cho ta thấy:

Môi trường MS có bổ sung BA có ảnh hưởng đến sự tăng trọng lượng tươi phôi sâm Ngọc Linh và sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) Trong đó, nồng độ BA cho kết quả tốt nhất là 2 mg/l MS (trọng lượng tươi phôi trung bình đạt 669,50 mg sau 60 ngày nuôi cấy)

NAA có ảnh hưởng đến sự tăng trọng lượng tươi phôi sâm Ngọc Linh và sự khác biệt rất có ý nghĩa trong thống kê (p ≤ 0,01) NAA ở nồng độ 0,5 mg/l MS cho trọng lượng phôi lớn nhất (trọng lượng tươi phôi trung bình đạt 792,50 mg sau 60 ngày nuôi cấy)