Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm một số chủng vi khuẩn nội sinh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum) tại Đắk Lắk

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG VĂN HIỂN Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum) TẠI ĐẮK LẮK KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Lớp : K46 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2014 - 2018 Thái Nguyên - năm 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG VĂN HIỂN Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY HỒ TIÊU (Piper nigrum) TẠI ĐẮK LẮK KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành/chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K46 - CNSH Khoa Khóa học : CNSH - CNTP : 2014 - 2018 Người hướng dẫn : PGS TS Phí Quyết Tiến ThS Bùi Đình Lãm Thái Nguyên - năm 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp này, nhận giúp đỡ quý báu nhiệt tình thầy cán Phòng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trước hết xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phí Quyết Tiến Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học, Trưởng phòng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học, người tạo điều kiện, tận tâm hướng dẫn tơi nghiên cứu khoa học suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Bùi Đình Lãm, Khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên giúp đỡ, bảo tận tình tơi q trình học tập để hồn thành khóa luận Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp hồn thành khóa luận tốt nghiệp tốt Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Dương Văn Hiển i ii DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ ngữ viết tắt Bp Base pair (Đơn vị cặp base) CMC Cacboxy Methy Cellulose DNA Axit Deoxyribonucleic IAA β-indol-acetic acid (Auxin) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia) OD Optical Density (Mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) RI Relative Inhibition (Phần trăm ức chế tăng trưởng sợi nấm) RNA Acid Ribonucleic VKNS Vi khuẩn nội sinh VSV Vi sinh vật w/v Đơn vị khối lượng thể tích ii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Một số nghiên cứu vi khuẩn nội sinh từ hồ tiêu 13 giới 3.1 Trình tự cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA 19 4.1 Khả kháng nấm gây bệnh chủng vi khuẩn 21 nội sinh phân lập hồ tiêu 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi 25 khuẩn nội sinh 4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 29 Đắk Lắk 4.4 Đặc điểm hình thái chủng HDL17 chủng HDL34 30 4.5 Khả đồng hóa nguồn carbon, nitơ chủng 31 HDL17 chủng HDL34 4.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh 32 trưởng chủng HDL17 chủng HDL34 4.7 Phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng HDL17 34 chủng HDL34 iii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình 2.1 Cây hồ tiêu (Piper nigrum) 2.2 Cây hồ tiêu bị bệnh chết nhanh bị nhiễm nấm Phytophthora capsici 2.3 Cây hồ tiêu bị bệnh chết chậm nhiễm nấm Fusarium oxysporum 4.1 Khả kháng nấm gây bệnh 36 chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu Trang 11 23 4.2 Vi khuẩn nội sinh đối kháng nấm gây bệnh: (A), (B), (C) đối chứng loại nấm bệnh Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici Fusarium oxysporum, (D): Chủng HDL13 kháng nấm Rhizoctonia solani, (E): Chủng HDL10, 24 HDL21, HDL22, HDL34 kháng nấm Phytophthora capsici, (F): Chủng HDL07 kháng nấm Fusarium oxysporum 10 4.3 Khả sinh enzyme ngoại bào vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 4.4 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn nội sinh A: chitinase; B: protease; C: cellulase 4.5 Hình thái khuẩn lạc chủng HDL17 (A) chủng HDL34 (B) môi trường MPA 4.6 Ảnh nhuộm Gram chủng HDL17 (A) chủng HDL34 (B) 4.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 27 28 30 30 33 iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỤC LỤC v Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật 2.1.1 Khái niệm vi khuẩn nội sinh 2.1.2 Đặc điểm sinh học phân loại vi khuẩn 2.1.2.1 Đặc điểm sinh học vi khuẩn 2.1.2.2 Phân loại vi khuẩn 2.1.3 Tiềm ứng dụng vi khuẩn nội sinh 2.2 Cây hồ tiêu bệnh hồ tiêu 2.3 Tiềm phân lập vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 11 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hồ tiêu Việt Nam 13 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Đối tượng, phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu 15 v 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 15 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 15 3.1.4 Thời gian nghiên cứu 15 3.2 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Đánh giá hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn nội sinh với nấm gây bệnh 16 3.3.2 Đánh giá khả sinh enzyme ngoại bào 17 3.3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng tuyển chọn 17 3.3.3.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc 17 3.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 17 3.3.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 18 3.3.4 Phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 19 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 20 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu có khả kháng nấm gây bệnh 21 4.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào 25 4.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng HDL17 chủng HDL34 29 4.3.1 Đặc điểm hình thái 29 4.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 31 4.3.3 Phân loại chủng HDL17 chủng HDL34 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 33 vi vii Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 I Tiếng Việt 37 II Tiếng Anh 37 III Ngôn ngữ khác 43 IV Trang Web 43 PHỤ LỤC vii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây hồ tiêu có tên khoa học Piper nigrum, thuộc họ hồ tiêu Cây hồ tiêu xem “vua loại gia vị” trở thành sản phẩm nông nghiệp quan trọng Việt Nam Năm 2014, Đắk Lắk trở thành tỉnh có diện tích hồ tiêu lớn nước với 16,1 nghìn ha, chiếm 36,7% diện tích vùng Tây Nguyên 18,8% diện tích hồ tiêu nước [1] Tuy nhiên, Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đắk Lắk cho biết, tính đến hết tháng năm 2016 địa bàn tồn tỉnh có 1,822 hồ tiêu bị nhiễm bệnh Trong đó, diện tích tiêu bị nhiễm bệnh vàng chết nhanh 507 ha; vàng chết chậm: 1,038 ha; rệp sáp hại rễ: 73,6 ha, tuyến trùng: 191,4 [55] Bệnh chết nhanh công đồng loạt đến loài nấm, chủ yếu nấm Phytophthora spp gây Bệnh chết chậm kết hợp gây hại tuyến trùng nấm đất, chủ yếu loài tuyến trùng Meloidogyne spp Radopholus similis gây Các bệnh kể làm giảm suất hồ tiêu, chí gây chết Trước thực trạng đó, biện pháp sinh học thay để diệt trừ bệnh hại để hạn chế tác động tiêu cực thuốc hóa học gây Biện pháp sinh học sử dụng chủng vi sinh vật (VSV) đối kháng với nguồn gây bệnh tạo chế phẩm sinh học nhằm phòng chống bệnh giảm tác động xấu từ thuốc bảo vệ có nguồn gốc hóa học Đặc biệt, vi khuẩn nội sinh (VKNS) thực vật VSV sống mô thực vật không gây bệnh tác động bất lợi tới trình phát triển bình thường VKNS nhiều nhà khoa học nghiên cứu khả ức chế kiểm soát bệnh thực vật, khả sinh enzyme, chất kích thích sinh trưởng thực vật, chất diệt cỏ [7] Ngoài giá trị kinh tế từ hồ tiêu mang lại, loại trồng mơi trường sinh sống VKNS 33 Chủng HDL34 sinh trưởng dải nhiệt từ 20 - 40°C sinh trưởng tối ưu 37°C; dải pH từ 6-8 sinh trưởng tối ưu pH = Chủng HDL17 HDL34 sinh trưởng dải nồng độ muối 0,5 - 2%, chủng HDL34 sinh trưởng tốt nồng độ muối 1%, chủng HDL17 sinh trưởng tốt nồng độ muối 1,5% Khi nồng độ muối ≥ 2,0%, chủng HDL17 HDL34 sinh trưởng yếu không sinh trưởng Từ kết nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng HDL17 HDL34, dựa khóa phân loại Bergey (1989) [15], kết luận sơ hai chủng HDL17 HDL34 thuộc chi Bacillus Từ kết luận dựa kết nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa, tiến hành nghiên cứu phân loại chủng HDL17 HDL34 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA 4.3.3 Phân loại chủng HDL17 chủng HDL34 dựa phân tích trình tự gen 16S rDNA Kết DNA tổng số chủng HDL17 HDL34 (Phụ lục 2) sử dụng làm vật liệu di truyền cho nghiên cứu khuếch đại gen 16S rDNA, kết thể Hình 4.6 Hình 4.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA gel agarose 1,0% 34 Kết khuếch đại gen 16S rDNA chủng HDL17 HDL34 cho thấy, hai sản phẩm khuếch đại DNA phản ứng PCR cho băng rõ nét có kích thước khoảng 1400 bp (Hình 4.7) Như vậy, sản phẩm phản ứng PCR thu thử nghiệm đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh giải trình tự gen 16S rDNA chủng HDL17 HDL34 Trình tự gen 16S rDNA chủng VKNS hồ tiêu nghiên cứu trình bày (Phụ lục 3) Kết phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng HDL17 HDL34 trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7 Phân tích trình tự gen 16S rDNA chủng HDL17 chủng HDL34 Chủng vi Trình tự gen 16S rDNA chủng vi Độ tương đồng khuẩn khuẩn so sánh (%) HDL17 HDL34 Bacillus velezensis GYL4 (CP020874.1) 100 Bacillus velezensis PgBe183 (MH211274.1) 100 Bacillus velezensis DR-08 (CP028437.1) 100 Bacillus velezensis BS-37 (CP023414.1) 100 Bacillus velezensis GQJK61 (MH244327.1) 100 Bacillus subtilis IAM12118 (NR_112116.2) 100 Bacillus subtilis JCM1465 (NR_113265.1) 100 Bacillus subtilis NBRC13719 (NR_112629.1) 100 Bacillus subtilis BCRC10255 (NR_116017.1) 100 Bacillus subtilis DSM10 (NR_027552.1) 100 Kết phân tích trình tự 16S rDNA so sánh với trình tự gen công bố Genbank công cụ BLAST (NCBI) cho thấy chủng HDL17 HDL34 thuộc chi Bacillus Chủng HDL17 có trình tự tương đồng 100% với lồi Bacillus velezensis, chủng HDL17 định 35 danh Bacillus velezensis Chủng HDL34 có trình tự tương đồng 100% với loài Bacillus subtilis Từ kết so sánh chủng HDL34 định danh Bacillus subtilis (Bảng 4.7) Theo số công bố quốc tế, đa số chủng VKNS có khả kháng nấm gây bệnh thuộc chi Bacillus Năm 2017, Kollakkodan cộng phân lập tổng số 47 chủng VKNS hai giống tiêu P.nigrum P.colubrinum Trong có 26,92% (n=7) số chủng VKNS phân lập từ mẫu giống tiêu P.colubrinum có khả ức chế nấm P capsici 23,81% (n=5) số chủng phân lập từ mẫu giống tiêu P.nigrum có khả ức chế nấm P capsici Định danh chủng VKNS ký hiệu PCSE PNSE B velezensis S subtilis Hai chủng Bacillus velezensis PCSE Bacillus subtilis PNSE thể khả kháng nấm P capsici, khoảng cách từ đường cấy vi khuẩn tới mép đường tròn sinh trưởng sợi nấm 5,8 2,2mm Tuy nhiên, khơng có báo cáo khả kháng nấm bệnh Fusarium oxysporum Rhizoctonia solani hai chủng [48] Theo tài liệu, loài thuộc Bacillus thường biết đến tác nhân kiểm sốt sinh học, lồi thuộc Bacillus tiết enzyme thủy phân có khả phá vỡ vách tế bào [49] Sinh tổng hợp loạt loại thuốc kháng sinh iturin [50], surfactin [51], fengycin [52], bacillomycin mycosubtilin [53] Như vậy, chủng Bacillus velezensis HDL17 Bacillus subtilis HDL34 hứa hẹn tiềm kiểm soát sinh học ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh nông nghiệp 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Tổng số 36 chủng VKNS phân lập hồ tiêu Đắk Lắk, có 32 chủng kháng chủng nấm, có 26 chủng kháng nấm Rhizoctonia solani, 24 chủng kháng nấm Phytophthora capsici 27 chủng kháng nấm Fusarium oxysporum Tổng số 36 chủng VKNS, 75,00% (n = 27) chủng sinh enzyme chitinase, 97,22% (n = 35) chủng sinh enzyme cellulase, 77,77% (n = 28) chủng sinh enzyme protease - Đã tuyển chọn hai chủng HDL17 HDL34 có khả kháng nấm gây bệnh hồ tiêu sinh enzyme ngoại bào cao - Phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng HDL17 định danh Bacillus velezensis; Chủng HDL34 định danh Bacillus subtilis 5.2 Kiến nghị - Lựa chọn môi trường điều kiện ni cấy thích hợp chủng HDL17 HDL34 nhằm thu sinh khối ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh nông nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Tổng cục Thống kê, Niên giám thống kê 2005 - 2014 Trung tâm giống trồng (2017), Biểu bệnh, cách chăm sóc, cách chữa trị bệnh virus hồ tiêu Phạm Thị Thúy Hoài (2013), ‘Nghiên cứu sản xuất sử dụng số chế phẩm sinh học nhằm nâng cao suất hồ tiêu Quảng Trị”, Đề tài hợp tác với Quảng Trị Đơn vị chủ trì đề tài: Viện Hóa Sinh Biển - Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam Vy Thị Mai Trâm, Bùi Thị Thu Nga, Nguyễn Hữu Hùng, Đỗ Đăng Giáp, Lê Thị Ánh Hồng, Nguyễn Thị Kim Xuân Dương Đức Hiếu (2015), “ Phân lập vi khuẩn Pasteuria Penetrans ký sinh tuyến trùng bướu rễ meloidogyne spp hồ tiêu”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(4A), 1369-1377 Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, 45-56, 97-102,163-171 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty (2001), “Vi sinh vật học”, Nxb Hà Nội, Hà Nội II Tiếng Anh Higashide E, Asai M, OotsuK TS, Kozay Y, Hasegawa T, Kishi T,Sugino Y and Yoneda M (1977), “Ansamitocins, a group of novelmaytansinoid antibiotics with antitumour properties from Nocar-dia” Nature, 270, 721-722 Tervet I W and Hollis J P (1948), “Bacteria inthe storage organs of healthy plants”, Phytopathology, 38, 960-967 Kado C.I (1992), “Plant pathogenic bacteria”, The prokaryotes, 8(4), 660-662 10 B J E Schulz, C J C Boyle and Th N Sieber (2006), “Microbial Root Endophytes”, Soil Biology, 9(367), 4-29 11 Hallmann J, Quadt HA, Mahaffee WF and Kloepper JW (1997), “Bacterial endophytes in agricultural crops”, Can J Microbiol, 43, 895-914 12 Compant S., Clément C and Sessitsch A (2010), “Plant growth-promoting bacterial in the rhizo and endosphere of plant: their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization”, Soil Biol Biochem, 42, 669-678 13 Hardoim S, Pablo R, Overbeek LS, Elsas Y and Jan Dirk van (2008), “Properties of bacteria endophytes and their proposed role in plant growth”, Trends in Microbiology, 16(10), 463-471 14 Menpara D and Chanda S (2013), “Endophytic bacteria - unexplored reservoirof antimicrobials for combating microbial pathogens”, Microbial Pathogens and Strategies for Combating them: Science, Technology and Education, 1095-1103 15 Stanley T Williams ME Sharpe and Holt JG (1989), “Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, 4, 2452-2492 16 Waksman S A (1961), “The Actinomycetes, classification, identification and descriptions of genera and species”, 2, 1132-1855 17 Nduka O Enemchukwu (2007), “Modern Industrial Microbiology and Biotechnology”, Enfield USA, 429-453 18 Ayuso Sacido and Genilloud O (2004), “New PCR primer for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: Detection and distribution of these biosynthetic gene sequence in major taxonomic groups”, Microbial Ecology, 38, 10-14 19 Béchamp A (1866), “The role of chalk in butyric and lactic fermentations, and living organisms it contains”, C R Hebd Seances Acad Sci, 63, 451456 20 Smibert R M and Krieg N R (1994), “Methods for General and Molecular Bacteriology”, American Society for Microbiology, 607-654 21 Miss Yuparet Puangmali (1999), “Isolation and selection of some Herbal endophytic Bacteria Capable of Producing L-Asparaginase”, Microbial Ecology, 67-95 22 Pirttila AM, Joensuu P, Pospiech H, Jalonen J and Hohtola A (2004), “Bud endophytes of Scots pine produce adenine derivatives and other compounds that affect morphology and mitigate browning of callus cultures”, Physiologia Plantarum, 121(2), 305-312 23 Christopher P Chanway (1997), “Inoculation of tree roots with PGPR soil bacteria”, An emerging technology for reforestation, 43(1), 99-112 24 Elizabeth Bent and Christopher P Chanway (1998), “The growthpromoting effects of a bacterial endophyte on Lodgepole pine are partially inhibited by the presence of other rhizobacteria”, Canadian Journal of Microbiology, 73(44), 980-988 25 Miller CM, Miller RV, Garton KD, Redgrave B, Sears J, Condron MM, Teplow DB and Strobel GA (1998), “Ecomycins, unique antimycotics from Pseudomonas viridiflava”, J Appl Microbiol, 84, 937-944 26 Aldor LS and Keasling JD (2003), “Process design for microbial plastic factories: metabolic engineering of polyhydroxyalkanoates”, Curr Opin Biotechnol, 14, 475-483 27 Gabriele Berg, Leo Eberl and Anton Hartmann (2005), “The Rhizosphere as a Reservoir for Opportunistic Human Pathogenic Bacteria”, Environmental Microbiology, 7(11), 1673-1685 28 Altman A and Hasegawa PM (2011), “Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century”, Academic press, 309-328 40 29 Sarma YR, Anandaraj M and Jose A (1988), “Effect of climatic factors on Phytophtkora leaf infections in black pepper grown in arecanut black pepper mixed cropping system”, J Plantn Crop, 16, 110-118 30 Ramachandran N, Sarma Y R and Anandaraj M (1990), “Vertical progression and spread of Phytophthora leaf infection in black pepper in areca-black pepper mixed cropping system”, Indian Phytopath, 42, 414-419 31 Anandaraj M, Ramachandran N and Sarma YR (1991), “ Epidemiotogy of foot rot disease of black pepper (Piper nirgum L.)”, National Research Centre for Spices, 144-145 32 Sarma YR, Ramachandran N and Anaridaraj M (1988), “Integrated disease management of quick wilt (foot rot) of black pepper (Piper nigrum L.) caused by Phytophthora palmivora MF4 (P capsici)”, J Coffee Re, 18, 61-67 33 Anandaraj M, Ramana KV and Sarma YR (1994), “Role of Phytophthora capsici in the etiology of slow decline disease of black pepper”, National Research Centre for Spices, 45, 30-23 34 Rosenblueth, Martínez-Romero, T Preobrazhenskaya and M Sveshnikova (2006), “In vitro antagonism of Phytophthora capsici and Fusarium solani by bacterial isolates from Sarawak”, Malaysian Journal of Microbiology, 11(2), 137-143 35 Aravind R, Kumar A, Eapen SJ and Ramana KV (2008), “Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype: isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici”, Letters in Applied Microbiology, 48, 58-64 36 Nascimento SB, Lima AM, Borges and Souza CRB (2015), “Endophytic bacteria from Piper tuberculatum Jacq.: isolation, molecular 41 characterization, and in vitroscreening for the control of Fusarium solanif sp piperis, the causal agent of root rot disease in black pepper (Piper nigrum L.)”, Genet Mol Res, 14(3), 7567-7577 37 Kang SH, Hyun SC, Hoon C,Choong MR, Jihyun FK and Seung HP (2006), “Two bacterial endentophytes eliciting both plant growth promotion and plant defense on pepper”, J Microbiol Biotechnol, 17(1), 96-103 38 Dinu A, Kumar A, Aravind R and Eapen SJ (2007), “Novel in planta assay for selection of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici on black pepper (Piper nigrum L.)”, J Spices Aromatic Crops, 16, 1-7 39 Aravind R, Dinu A, Santosh JE, Cuma A and Ramana KV (2009), “Isolaton and Evaluation of endophytic bacteria Against plant parasitic nematodes infesting back pepper ( Piper nigrum L.)”, Indian journal of Nematology, 221-217 40 Abdul Munif, Rita Harni and Siswanto, “The Potential of endophytic bacteria for the biological control of plant parasitic nematodes on black pepper”, IPB International Convention Center, 30(8), 315-318 41 B Jasim, C John Jimtha, Mathew Jyothis and EK Radhakrishnan (2013), “Plant growth promoting potential of endophytic bacteria isolated from Piper nigrum”, Plant growth regulation, 71(1), 1-11 42 Toh SC and Lihan S (2016), “Screening for antifungal-producing bacteria from Piper nigrum plant against Phytophthora capsici”, International Food Research Journal, 23(6), 2616-2622 43 Tresner H and Danga F (1958), “Hydrogen sulfide production by Streptomyces as a criterion for species differentiation”, Journal of bacteriology, 76(3), 239-246 42 44 Živković S, Stojanović S, Ivanović Ž, Gavrilović V, Popović T and Balaž J (2010), “Screening of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and Colletotrichum gloeosporioides” Archives of Biological Sciences, 62(3), 611-623 45 Kateka D, Shannaphimon W, Phichaya T, Prapaporn B, Arunee A, Panupong S and Ekachai C (2009), “Comparative study of proteolytic activity of protease-producing bacteria isolated from Thua Nao”, Journal of Science and Technology, 3(2), 269-276 46 Kasana RC, Salwan R, Dhar H, Dutt S and Gulati A (2008), “A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's iodine”, Current Microbiology, 57, 503-507 47 Yap CA (2012), “Rhizobacteria of pepper (Piper nigrum) and their antifungal activities”, African Journal of Microbiology Research, 6(19), 4185-4193 48 Kollakkodan N., Anith K N and Radhakrishnan N V (2017), “Diversity of endophytic bacteria from Piper spp with antagonistic property against Phytophthora capsici causing foot rot disease in black pepper (Piper nigrum L.)”, Journal of Tropical Agriculture, 9(125), 531-752 49 Chernin L and Chet I (2002), “Microbial enzymes in biocontrol of plant pathogens and pests”, Enzymes in the Environment: Activity, Ecology, and Applications, 171-225 50 Joshi R and M B Gardener (2006), “Identification of genes associated with pathogen inhibition in different strains B subtilis phytopathology”, Antagonistic Activity of Endophytic, 96, 145-154 51 Tsuge K., T Akiyama and M Shoda (2001), “Cloning, Sequencing, and Characterization of the Iturin A Operon”, Journal of bacteriology, 183(21), 6265-6273 43 52 Phister T., D J O’sullivam and L L Mckay (2004), “Identification of Bacilysin, Chlorotetaine, and Iturin A Produced by Bacillus sp Strain CS93 Isolated from Pozol, a Mexican Fermented Maize Dough”, Appl Environ Microbiol, 70(1), 631-634 53 Ramarathnam R, Bo S, Chen Y, Fernando WG, Xuewen G and Kievit T (2007), “Molecular and biochemical detection of fengycin- and bacillomycin D-producing Bacillus spp., antagonistic to fungal pathogens of canola and wheat”, Can J Microbiol, 53(7), 901-912 III Ngôn ngữ khác 54 Duarte MLR, Albuquerque FC and Hamada MM (1999), “Causada por Fusarium oxysporum, uma nova doenỗa da pimentado-reino no Estado Pará”, Fitopatologia Brasileira, 24, 78-181 IV Trang Web 55.http://www.daidoanket.vn/tin-tuc/kinh-te/tieu-chet -nguoi-dan-lo-lang129364 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường nuôi cấy - PDA (g/l): Glucose: 20; khoai tây: 300; thạch: 20; H2O: 1000 ml; PH: 6,5 - - MPA + CMC (g/l): Cao thịt: 3; Pepton : 5; NaCl: 5; CMC: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; PH: 6,5 - [44] - MPA + Casein (g/l): Cao thịt: 3; Pepton : 5; NaCl: 5; Casein: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; PH: 6,5 - [45] - MPA + Chitin (g/l): Cao thịt: 3; Pepton : 5; NaCl: 5; Chitin: 10; thạch: 20; H2O: 1000 ml; PH: 6,5 - [46] - Khoáng (g/l): (NH4)2SO4: 2; MgSO4.7H2O: 0,2; NaH2PO4.H2O: 0,5; CaCl2.H2O: 0,1; K2HPO4: 0,5; thạch: 20; PH: 6,5 - [15] Phụ lục 2: DNA tổng số chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn nghiên cứu Phụ lục 3: Trình tự gen 16S rDNA chủng HDL17 HDL34 - Trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn HDL17 AACACGTGGG TAACCTGCCT GTAAGACTGG GATAACTCCG GGAAACCGGG GCTAATACCG 61 GATGGTTGTC TGAACCGCAT GGTTCAGACA TAAAAGGTGG CTTCGGCTAC CACTTACAGA 121 TGGACCCGCG GCGCATTAGC TAGTTGGTGA GGTAACGGCT CACCAAGGCG ACGATGCGTA 181 GCCGACCTGA GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAGA CTCCTACGGG 241 AGGCAGCAGT AGGGAATCTT CCGCAATGGA CGAAAGTCTG ACGGAGCAAC GCCGCGTGAG 301 TGATGAAGGT TTTCGGATCG TAAAGCTCTG TTGTTAGGGA AGAACAAGTG CCGTTCAAAT 361 AGGGCGGCAC CTTGACGGTA CCTAACCAGA AAGCCACGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG 421 CGGTAATACG TAGGTGGCAA GCGTTGTCCG GAATTATTGG GCGTAAAGGG CTCGCAGGCG 481 GTTTCTTAAG TCTGATGTGA AAGCCCCCGG CTCAACCGGG GAGGGTCATT GGAAACTGGG 541 GAACTTGAGT GCAGAAGAGG AGAGTGGAAT TCCACGTGTA GCGGTGAAAT GCGTAGAGAT 601 GTGGAGGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGACTC TCTGGTCTGT AACTGACGCT GAGGAGCGAA 661 AGCGTGGGGA GCGAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC GATGAGTGCT 721 AAGTGTTAGG GGGTTTCCGC CCCTTAGTGC TGCAGCTAAC GCATTAAGCA CTCCGCCTGG 781 GGAGTACGGT CGCAAGACTG AAACTCAAAG GAATTGACGG GGGCCCGCAC AAGCGGTGGA 841 GCATGTGGTT TAATTCGAAG CAACGCGAAG AACCTTACCA GGTCTTGACA TCCTCTGACA 901 ATCCTAGAGA TAGGACGT // - Trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn HDL34 ACGGGTGAGT AACACGTGGG TAACCTGCCT GTAAGACTGG GATAACTCCG GGAAACCGGG 61 GCTAATACCG GATGGTTGTT TGAACCGCAT GGTTCAAACA TAAAAGGTGG CTTCGGCTAC 121 CACTTACAGA TGGACCCGCG GCGCATTAGC TAGTTGGTGA GGTAACGGCT CACCAAGGCA 181 ACGATGCGTA GCCGACCTGA GAGGGTGATC GGCCACACTG GGACTGAGAC ACGGCCCAGA 241 CTCCTACGGG AGGCAGCAGT AGGGAATCTT CCGCAATGGA CGAAAGTCTG ACGGAGCAAC 301 GCCGCGTGAG TGATGAAGGT TTTCGGATCG TAAAGCTCTG TTGTTAGGGA AGAACAAGTA 361 CCGTTCGAAT AGGGCGGTAC CTTGACGGTA CCTAACCAGA AAGCCACGGC TAACTACGTG 421 CCAGCAGCCG CGGTAATACG TAGGTGGCAA GCGTTGTCCG GAATTATTGG GCGTAAAGGG 481 CTCGCAGGCG GTTTCTTAAG TCTGATGTGA AAGCCCCCGG CTCAACCGGG GAGGGTCATT 541 GGAAACTGGG GAACTTGAGT GCAGAAGAGG AGAGTGGAAT TCCACGTGTA GCGGTGAAAT 601 GCGTAGAGAT GTGGAGGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGACTC TCTGGTCTGT AACTGACGCT 661 GAGGAGCGAA AGCGTGGGGA GCGAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC 721 GATGAGTGCT AAGTGTTAGG GGGTTTCCGC CCCTTAGTGC TGCAGCTAAC GCATTAAGCA 781 CTCCGCCTGG GGAGTACGGT CGCAAGACTG AAACTCAAAG GAATTGACGG GGGCCCGCAC 841 AAGCGGTGGA GCATGTGGTT TAATTCGAAG CAACGCGAAG AACCTTACCA GGTCTTGACA 901 TCCTCTGACA ATCCTAGAGA TAGGACGT // XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên, ngày… tháng… năm……… Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên) chữ ký ghi rõ họ tên) ... bệnh chủng vi khuẩn 21 nội sinh phân lập hồ tiêu 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi 25 khuẩn nội sinh 4.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 29 Đắk Lắk 4.4 Đặc điểm hình thái chủng. .. thực đề tài: Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm số chủng vi khuẩn nội sinh hồ tiêu (Piper nigrum) Đắk Lắk 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát - Nghiên cứu chủng VKNS hồ tiêu có khả kháng... 2.1.3 Tiềm ứng dụng vi khuẩn nội sinh 2.2 Cây hồ tiêu bệnh hồ tiêu 2.3 Tiềm phân lập vi khuẩn nội sinh hồ tiêu 11 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hồ tiêu Vi t Nam 13 Phần