CHIẾT, TINH CHẾ VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME

Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&THỰC PHẨM

VŨ THỊ NINH 09248861 ĐOÀN THỊ PHƯỢNG 09247521 NGUYỄN THỊ THỦY 09246191

TẠ PHI VŨ 09258231

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME

1.1 Khái niệm về enzyme

Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác

Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng:

1- Làm tăng phản ứng hóa học

2- Bản than chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng

Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc tác hóa học chỉ làm tăng tốc độ phản ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng trong phản ứng Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó gọi là enzyme

Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấu men Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong

cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất

vô cơ Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong diều kiện

ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật Trong khi đó, các chất hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản ứng hóa học càng cao Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt như sau:

1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao.

3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu

sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme đượctổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơthể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi

enzyme

6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại

1.2 Cấu tạo của enzyme

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20000 đến 1000000 dalton

Các enzyme được cấu tạo từ L – axit amin Các axi tamin này liên kết với nhau bởi liên kết peptit Khi thủy phân protein enzyme, ta sẽ thu nhận được các axitamin Trong một sốtrường hợp, ngoài axit amin ra người ta còn thu được những thành phần khác

- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta chỉ thu được các axit amin thì enzyme này được gọi là enzyme đơn cấu tử hay còn gọi là enzyme đơn giản

- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta thu được ngoài axit amin còn các thành phần khác thì enzyme này được gọi là enzyme đa cấu tử hay còn gọi là enzyme phức tạp Các enzyme phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như ion kim loại,vitamin, glutation dạng khử, … đa số enzyme có trong cơ thể thuộc enzyme đa cấu tử Trong thành phần enzyme đa cấu tử người ta phân biệt rõ các phần như sau:

- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme

- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”

Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzyme, có thể tồn tại độc lập.Trong khi tham gia xúc tác, không phải toàn bộ tất cả các phần trong cấu trúc của enzyme tham gia mà chỉ có

một phần giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng Phần giới hạn tham gia phản ứng này được gọi là trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt đông của enzyme do một số axit amin đảm trách Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến thì không phải bất kỳ đột biến nào cũng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản ứng sinh hóa của tế bào, chỉ

có những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axit amin thì mới có ý nghĩa

Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptit Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng chúng lại gần nhau trong không gian Khoảng cách này được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động thường giống cấu trúc không gian của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác

Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử là nhóm ngoại và nhóm định chức của axitamin nằm ở apoenzyme Khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm định chức của trung tâm hoạt động sẽ thay đổi cấu trúc không gian sao cho tương ứng với cấu trúc không gian của cơ chất

Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không có khả năng tham gia phản ứng ngay, muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa Trung tâm hoạt động của loại enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay

proenzym, ví dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin Các enzyme này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme nào đó hoặc một yếu tố nào đó Khi đó một số liên kết peptit trong phân tử zymogen bị mất, enzyme sẽ được hoạt hóa Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm chức trong phân tử enzyme Khi đó trung tâm hoạt động của enzyme ở trạng thái hoạt hóa

Ở những enzyme dị lập thể hay enzyme điều hòa còn có trung tâm dị lập thể (enzymeđiều hòa) Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác Các cơ chất tương

tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc

độ phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi Trong trường hợp phản ứng enzyme được tăng lên khi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được gọi là chất điều hòa dương Ngược lại nếu phản ứng enzyme giảm đi khi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất diều hòa này được gọi là chất điều hòa âm Các chất điều hòa hoàn toàn không biến đổi khi chúng tương tác với enzyme

Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzymebao gồm:

- Nhóm sulfridril của xistein

- Nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε – amin của lizin

- Nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamiz

- Nhóm hydroxyl của serin, treonin, và trirozin

Trung tâm hoạt động của các enzyme một thành phần bao gồm từ 3 – 7 nhóm chức năng trên Các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động được định hướng xác định sau

đó để đảm bảo cho chúng có khả năng tương tác với nhau trong khi phản ứng

Trung tâm hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm một số nhóm chức năng của axit amin trong thành phần apoenzyme và trong nhiều trường hợp còn cần cả ion kim loại Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là nhũng ion kim loại hóa trị 2 như Fe, Co, Mn, Zn, Cu …chúng có mặt ở cả trung tâm hoạt động của enzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Các kim loại này có thể tham gia trựctiếp trong các phản ứng xúc tác, chúng liên kết bền với phân tử enzyme Trong nhiều trường hợp enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra khỏi thành phần của enzyme Trong trường hợp này enzyme này được gọi là metaloenzyme Hoạt động của enzyme này sẽ được phục hồi khi cho kim loại vào

1.3 Cách gọi tên và phân loại enzyme

Trước kia thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả Các tên đã quen dùng như tripxin, pepxin, kimotripxin, …hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thông dụng Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọi theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm đuôi “aza”.

Tên gọi hệ thống thường gồm hai phần:

- Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm);

- Chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác

Ví dụ: + Tên thông dụng: ureaza

+ Tên gọi hệ thống: cacbamit – amidohydrolaza

Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hổ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc

Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

L – axit amin

Có tên gọi: L – axit amin: oxydoreductaza (deamin)

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1- 6 Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp:

L – aspartat + α – xetoglutarat = oxaloaxetat + glutamate

(Nhóm amin được chuyển từ L – aspactat đến α – xetoglutarct)

- Oxygenase: tác động oxy hóa

- Peroxydase: tác động khi có H2O2, có tác dụng loại khả năng gây độc của H2O2 trong cơthể

1.3.2 Transferase

Có tác động lên phản ứng chuyển nhóm chức Phương trình phản ứng tổng quát:

A – B + C  A + B – C

Các dạng thông dụng:

- Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A)

- Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose Enzyme chuyển hóa tinh bột

- Amino transferase: chuyển nhóm amin.

- Photpho transferase: ATP  ADP

ATP + AMP  ADP + ADP

- Peptit hydroláe: có khả năng thủy phân liên kết peptit

- Lipase có khả năng thủy phân lipit Ví dụ triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Ví dụ: dưới tác dụng của pyruvat carboxylase (6.4.1.1), từ acid pyruvit tạo thành oxaloacetic.

CHƯƠNG II: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME

1 Các phương pháp phá vỡ tế bào

1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học

Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính enzyme nội bào Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật,thực vật và VSV Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay

mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay

Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học Riêng

tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định

- Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả

- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trườnglỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào) Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều

* Phương pháp đồng hóa áp lực cao:

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng

va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin) Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau Ví

dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar Phương pháp đồng hóa áplực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn Tế bào động vật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này

* Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp sản xuất enzyme Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi

thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.

1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học

Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải là phương pháp cơ học Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học)

Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh,

hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện Tuy nhiên vì trong quá trìnhthực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone

Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử

dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp Một phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ởdạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu Nguyên tắc của phương pháp này là, khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người

ta thu được huyền phù tế bào vỡ Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao

Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme) Có hai phương pháp hiện đang được sử

dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào

Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những

enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mứchoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm men Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng

bị phá hủy Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme

từ ngoài tế bào Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào Người ta thường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp) Ngoài

ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác

2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme

Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp:

Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:

- Protein có hoạt tính sinh học

- Các chất hòa tan khác

- Nước

Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác

Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều thành phần Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV

Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thườngtiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp

Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâmhình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa

Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một

số kiểu ly tâm khác Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu

tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng

2.2.2 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan.

Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc; sức đề kháng

Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:

- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệuquả

- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả

- Lọc theo dòng chảy cắt ngang Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn

- Lọc thông thường Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một

số nhà máy vẫn còn sử dụng Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn

2.3 Phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý một khối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao Mặt

khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao Chính

vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:

- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme

- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này

- Tăng khả năng bảo quản enzyme

- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản

- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất

Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những phương pháp sau:

2.3.1 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzymenhân tạo) Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào sống Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ chết Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào

bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại

Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độsinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme Tùy theo nguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá trình cô đặc

Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng chophép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu

hoạt tính Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết.

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:

- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứkhông nằm trong phần tủa

- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch

* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao

quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của

enzyme

Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate Các thiết

bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép không rỉ Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chếtạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate Sau này người ta thay

ammonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại không có tính hòa tan tốt Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng

để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%.

* Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng

rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ýđến nhiệt độ Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ

3 – 100C Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme

* Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được

ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %) Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho

kỹ thuật làm sạch sau này Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp Các polymer được sử dụng nhiều

là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme

* Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng

có cả nhóm acid và nhóm base Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở

khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính

2.3.3 Phương pháp siêu lọc

Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc,thẩm thấu ngược

Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan Trong khi

đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton Người ta sử dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly propylene làm nguyên liệu màng lọc Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng Ngoài ra, người ta còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích

2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme

2.4.1 Phương pháp kết tinh

Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

2.4.2 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm Người ta cũng

đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi

2.4.3 Phương pháp sắc ký

* Phương pháp sắc ký lọc gel Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong

cột dùng để tách enzyme Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng

* Sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử

protein Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy

mô công nghiệp Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH

Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

* Sắc ký kỵ nước Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử

protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate

* Sắc ký đồng hóa trị Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái

2.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật

2.5.1 Thu nhận enzyme amylase

Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase,

γ-amylase (hay glucose) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase (enzyme nội bào), và exoamylase (enzyme ngoại bào) Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và ngô Có hai phương pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

* Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký

Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày Hạt nảy mầm được đồng hóatrong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5)(dung dịch đệm A) Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút Phần ở trên được xem như dịch enzyme thô Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH4)2SO4 (25 – 60%) Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút

Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì

sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A; enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M Dung dịch được thẩm tích và được lôi cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn

amylase Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

* Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)

Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0) Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích) Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme.

Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase

2.5.2 Thu nhận enzyme bromelin từ dứa

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng

phân giải protein, được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).

 Phương pháp thu nhận

Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin

 Thu dịch enzyme thô

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc vớitốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin

 Các phương pháp tách bromelin

Phương pháp kết tủa enzyme

Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong điều kiện sinh

lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch, protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa đượcenzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống

Cách thực hiện:

- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị một lít dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt được độ bão hòaammonium sulfate là 70%) Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa

- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96% (cũng

đã được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 00Ctrong 3-4 giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa

- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-40C Ly tâm hốn hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa Thêm 2 thể tích acetone lạnh vào, để 1 giờ ở 0-40C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh

Phương pháp hấp phụ

Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin Trình tự thực hiện tương tự nhau Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa Tủa được gọi là bromelin-kaolin

Phương pháp siêu lọc

- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách các thành phần trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu đượcnước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng

- Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng 336cm2 Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc

- Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dungdịch đệm phosphate 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC Rửa protein bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6 Sau đó, tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl 0,5M khuấy trộn 3-4 lần Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất Sau đó, góp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme

 Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin

 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 1000C trong một giờ rồi nhồi vào cột (kích thước cột 23,5x0,9cm) Đặt 1 cái phễu thủy tinh phía trên cột, cho sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục cho đếnkhi nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không

có bọt khí Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7 phút

Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,02M, pH 7,2 Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzyme được thu đến khi dùng Ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzyme Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô Quá trình lọc enzyme qua sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tính của enzyme Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng thời gian 1 giờ

 Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký

Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons

Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần amino acid Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzyme Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 – 20.000 Dalton

2.5.3 Thu nhận enzyme papain

Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S Papain là một protease thiol,

là một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton Quá trình thu nhận papain tinh khiêt gồm các bước sau:

- Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain còn chứa

một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các chất tạp khác Để có được quy trình tách và tinh sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn tạp lớn… Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150 cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng 200-300ml dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein hydrochloride trong 1.000 ml dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa

pH dịch chiết tới pH 5,7) Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửacối với dung dịch cystein để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1 lít Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1 Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm Nước lọc có màu trắng sữahoặc màu xanh, pH gần 5,7 Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch được tiến hành trong điều kiện lạnh

- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh

lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M Tủa xám tạo thành có thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 2.600rpm trong 1 giờ Dịch chiết phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ

- Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate: Cho ammonium sulfate vào dịch

enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500rpm thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giử lại để lấy chymopapain Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch ammonium sulfate 40% độ bão hòa

- Quá trình phân đoạn bằng NaCl: hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cystein 0,02M

(pH7-7,5), tủa papain tạo thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn Sau một giờ ly tâm ở 2.500rpm trong một giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng

- Kết tinh: tủa được thành dịch huyền huyền phù với 400ml dung dịch cytein 0,002M,

pH 6,5 ở nhiệt độ phòng pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại pH 6,5 sau khi cho protein vào Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, sau đó duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2.500rpm trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể

- Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất (tạo dung dịch

protein có nồng độ khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein) Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào papain đã bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dịch huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa như ở bước 5 Hoạt độ riêng của enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên

- Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ khoảng 400C, thu nhận papain tinh chế

Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trongdung dịch đệm phosphate chứa cystein, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc

2.5.4 Thu nhận enzyme ficin

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl SH) Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và

(-bromelin Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch nhựa tươi từ cây sung Quá trình sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các bước sau:

- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất

- Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước

- Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên

- Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn

và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn

- Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn enzyme

- Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với

tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C

2.6 Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật

Tùy theo yêu cầu của ứng dụng enzym mà ta cần enzym sạch và enzym khôngsạch(chế phẩm thô, chế phẩm tinh)

Chế phẩm enzym thô thường chứa nhiều loại enzym khác nhau, chứa thành phầnmôi trường chưa được đồng hóa và vi sinh khối tế bào vi sinh vật

Chế phẩm enzym tinh là sản phẩm được tách khỏi dung dịch môi trường và táchkhỏi tế bào vi sinh vật, sau đó được tinh sạch bằng cách kết tinh, làm khô Các chế phẩmenzym tinh khiết được ứng dụng sản xuất các sản phẩm tinh khiết, vô trùng Thôngthường chế phẩm enzym tinh chứa một loại enzym, cũng có một số trường hợp enzymtinh chứa một số enzym cùng loại Các enzym tinh thưòng sử ụng trong công nghiệp nhẹ,

mỹ phẩm, y học và trong một số công nghệ thực phẩm

Quá trình thu nhận enzym sạch được trình bày như sau:

2.6.1 Thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt:

Việc thu nhận enzym sạch từ nuôi cấy bề mặt bao gồm 2 giai đoạn:

2.6.1.1.Chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt:

Công đoạn chiết rút enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt rất phức tạp

Giai đoạn tinh chế dễ hay khó phụ thuộc rất nhiều vào công đoạn này Khi tiếnhành chiết rút enzym từ canh trường ta thu được không chỉ có enzym hòa tan trong nước

mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ ché của môi trường và cà chất màucủa chính nấm mốc tạo ra Hiện nay có hai phương pháp chiết rút enzym từ canh trườngnuôi cấy bề mặt:

a Phương pháp thủ công:

Trong phương pháp thủ công chế phẩm enzym thô được nghiền nhỏ( nghiền bằngcối với các thạch anh hoặc với bột thủy tinh sau khi được xử lí sạch hoặc máy nghiền.Mục đích của quá trình này là làm tăng khả năng thu nhận enzym trong dịch chiết từ tếbào vi sinh vật Dịch chiết thu nhận được từ phương pháp này rất đục do trong đó chứarất nhiều chầt khác nhau

b Phương pháp chiết rút enzym bằng các thiết bị khuếch tán.

Trong phương pháp chiết rút bằng các thiết bị khuếch tán, các enzym được chuyển

từ tế bào vào nước do sự chêch lệch nồng độ enzym từ tế bào vào nước Thiết bị dùngcho quá trình này bao gồm nhiều thiết bị khuếch tán được lắp đặt nối tiếp nhau Quá trìnhkhuếch tán được thực hiện như sau:

Nước (dung môi) được đưa từ bể khuếch tán chứa chế phẩm nấm mốc có hàmlượng enzym và các chất tan khác thấp nhất Dung dịch sau khi khuếch tán chứa nồng độenzym cao hơn sẽ đi từ bể khuếch tán có chế phẩm nấm mốc mới nạp vào Như vậy, vấn

đề trở nên phức tạp trong điều hành Để dễ hiểu ta xem cách vận hành cụ thể như sau:

Chế phẩm nấm mốc được đưa vào bể khuếch tán thứ nhất, đồng thời ta đưa nướcvào, giữ chế phẩm nấm mốc trong nước một thời gian Tuần tự như vậy ta tiến hành vớitất cả các bể còn lại Dòng chảy của dịch khuếch tán từ bể này sang bể khác sẽ làm giàuhơn lượng khuếch tán vào Dịch khuếch tán cuối cùng sẽ được bơm vào bể thu nhận và từ

bể khuếch tán thứ nhất, sau khi tháo bã nấm mốc được nối vào vị trí cuối cùng của dãy

khuếch tán Khi đó bể khuếch tán thứ hai trong lúc này của bể thứ nhất Trong quá trìnhkhuếch tán, nhiệt độ được duy trì là 25-280C và cho thêm focmalin để tránh nhiễm trùng.Dịch khuếch tán hay dịch chiết enzym được cô đặc dưới áp suất thấp trong chân không đểhàm lượng chất khô ít hơn 50-55%.

2.6.2 Thu nhận enzym từ phương pháp bề sâu:

Dung dịch lên men từ phương pháp nuôi cấy bề sâu, sau khi tách khối vi sinh vậtchứa hàm lượng chất khô rất thấp (khoảng 1 – 3 %) Do đó, để giảm chi phí dung môihoặc muối trung tính trong quá trình kết tủa ta phải cô đặc dung dịch này

Phương pháp cô đặc phải sao cho hoạt tính dung môi không thay đổi Muốn vậydung dịch phải được cô chân không ở nhiệt độ thấp, khoảng 25 – 300C Lượng dịch sau

cô đặc sẽ giảm 4 – 10 lần Phương pháp tốt nhất là cho dịch qua cột nhựa trao đổi ionhoặc các chất hoạt động bề mặt Hiện nay, người ta áp dụng một số phương pháp thunhận enzym từ dịch lọc của phương pháp bề mặt sâu như sau:

a.Phưong pháp thu nhận enzym bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ

hoặc bằng muối trung tính từ dịch chiết của canh trường nuôi bề mặt Dịch nuôi cấy từphưong pháp bề sâu phải làm cô đặc lại Thao tác và các yêu cầu kỳ thuật tương tự nhưphương pháp thu nhận kết tủa enzym từ môi trường nuôi cấy bề mặt

b.Phương pháp hấp thụ hoàn toàn bởi silicagen Được thực hiện ở pH 4,7 – 4,9.

Cách tiến hành được thực hiên như sau: cho dịch enzym chảy qua cột nạp đầy silicagen.Sau đó tách silicagen ra Để tăng quá trình hấp phụ, người ta cho thêm 6 – 20% NaCl.Sau đó silicagen được rửa bằng photphat natri ở pH= 8 – 8,4 hoặc bằng cacbonat natri2% Bằng cách này ta có thể thu được nước lọc từ canh trường nuôi cấy bề sâu xuống 8 –

10 lần Sau đó rút enzym ra, silicagel được tái sinh lại bằng cách nung ở nhiệt độ 160 –

1700C hoặc cũng có thể xử lí bằng HCl 1N và rửa cẩn thận bằng nước cất

Dung lượng hấp thụ của 1 gam silicagel là 60 – 120 - amilaza

2.6.3 Tinh chế enzym

Để tinh chế enzym người ta dùng các dung môi hữu cơ để kết tủa, hoặc dùng một

số trung tính kết tủa

a Phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzym bao gồm: etanol, izopropanol,axeton Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường Khi đó lực hút

và lực đẩy tỷ lệ thuận với hằng số điện môi Do đó, trong dung dịch toàn bộ các proteinenzym và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử khác đều bị kết tủa Do

sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp vàđợt và sẽ lắng xuống

Các yếu tố có ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm nồng độ dung môi, nhiệt độ,phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzym Kết tủa enzym bằngetanol người ta thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật sau:

- Kết tủa trong điều kiện nhiệt độ từ 3 – 50 C Thông thường, người ta phải làm lạnhdung dịch chiết enzym và dung môi để tránh biến tính enzym

- Khối lượng etanol cho vào gấp 3 – 4 lần thể tích dịch chiết enzym

- Khuấy đều để phân phối etanol trong dung dịch

- Sau khi có kết tủa đem lọc hoặc đem ly tâm để thu nhận kết tủa

- Rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 – 3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa vàđem sấy chân không

- Kết tủa enzym bằng izopropanol ta thực hiện các điều kiện kỹ thuật như sau:+ Khối lượng izopropanol gấp 1,5 – 2 lần khối lượng dịch chiết enzym

+ Các điều kiên khác thực hiện như thực hiện đối với etanol Kểt tủa thu được từviệc sử dụng etanol là một kết tủa dạng bột nhão và dính, do đo khi tiến hành sấy sễgặp rất nhiều khó khăn

Kết tủa enzym bằng axetol ta cần lượng axetol nhiều hơn 1,5 – 2 lần dịch chiếtenzym Điều lưu ý là axetol là một chất rất dễ gây cháy nổ, do đó việc thực hiện phảirất cẩn thận

Trong tất cả các phương pháp trên người ta cho thêm 0,2% CaCl2 để làm tăngkhả năng kết tủa của enzym và làm bền cấu trúc của chúng

Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym kết tủa trên,

ta sẽ dựa trên độ hòa tan khác nhau trong hỗn hợp etanol và các enzym đó để tách

b Phương pháp kết tủa enzym bằng một số muối trung tính.

Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là: sulfat amon, sulfat natri, sulfatmagie.Trong đó người ta cho biết loại tốt nhất là sulfat amon vì độ hòa tan của chúngcao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính cácenzym Kết tủa bằng sulfat amon thường thu được các kết tủa enzym có hoạt tính cao hơncác kết tủa enzym từ phương pháp dùng dung môi hữu cơ

Nhược điểm lớn nhất của phương pháp kết tủa enzym bằng phương pháp trungtính là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường tới 50 – 60% so với dung dịch chiếtenzym Mặt khác, nếu trong phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa, thì ngoàiviệc thu được kết tủa ta còn có thể tái thu hồi dung môi hữu cơ Nhưng trong phươngpháp kết tủa bằng muối trung tính ta lại không thể tái thu hồi muối trung tính Do đó, đểgiảm giá thành ta có thể thực hiện bằng cách là làm cô đặc dịch chiết enzym trước khicho kết tủa enzym

2.6.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV):

2.6.4.1 Thu nhận enzym protease từ VSV:

Nguồn thu nhận enzym protease:

Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzym này có trong tế bàohoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theoquy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp, trong nôngnghiệp và trong y học

Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease:

Vi khuẩn: Bac.subtilispha, Bac.cireulans, Bac.sphaericus, Bac.brevis, Bac.cerus…

Xạ khuẩn: Str.griseus, Str.rimous, Str.fradiae,…

Nấm mốc: Asp.oryzae, Asp.satoi, Asp.niegr, Pen.chrysogenum, Pen.cyaneofulvum, Mucor.pusillus

Các phương pháp thu nhận enzym protease

a Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt

Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi

Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2( đối với nấm sợi) hoặc từ 7,2 ( đối với vi khuẩn) Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy Thời gian nuôicấy thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợpnhất ( thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất) Nói chung, đối với đa sốnấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiếtrút enzym khỏi môi trường, loại bỏ nhũng phần không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối

6,2-vô cơ hay dung môi hữu cơ

b Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu

Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng Sau khilàm lạnh, cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10% Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm trahoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cầnnhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc

Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượngoxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV Thể tích thùng lên men càng lớncàng khó khống chế yếu tố này Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3.Theocác tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men(chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trunggian) sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm

c Thu nhận enzym protease:

Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSVtheo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối loãnghoặc nước để chiết rút enzym Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nóitrên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọchoặc li tâm, thu lấy dung dịch trong Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzymtrong một giờ Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt

Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bàoVSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym Quá trình này là một giaiđoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym Ở Nhậtbản đã tìm đựoc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường

nuôi cấy Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thườnglàm giảm đáng kể hoạt động enzym.

2.6.4.2 Thu nhận enzym amylase từ VSV

Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym đựoc sử dụng rộng rãi trong nhấttrong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác

Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nóiriêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814

Các enzym amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, tronghạt nảy mầm, nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và vi khuẩn

Nguồn enzym amylase từ VSV

Trong thiên nhiên enzym có nhiều ở hầu hết ở thực vật, động vật và vi sinh vật.Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùnglàm nguồn thu các chế phẩm enzym do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn cácenzym này trong những điều kiện xác định

Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thu enzym chỉ đạo.Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzym amylase Những chủngVSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác vàthậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzym khác nhau

VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn,còn xạ khuẩn thì ít hơn

Thu nhận enzym amylase từ VSV

Muốn thu được các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập,

và chọn giống VSV để tuyên truyền lấy nhưng chủng hoạt động mạnh, đồng thời phảitiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêuchuẩn hóa các điều kiện nuôi Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉphụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn cácđiều kiện nuôi đặc hiệu

Ngoài các yếu tố hóa học ( thành phần môi trường) ra, cá điều kiện lý hóa của quátrình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzym amylase Người

ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp Ví

dụ, có thể dùng Bac.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hạơc chủ yếu là phức hệprotease

Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzym amylasetrong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường, độtiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu

tố cơ bản tối quan trọng Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt vàphương pháp bề sâu

a.Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt

Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ( tinh bột, dextrin), hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thànhphần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử

Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám

mì, cám gạo Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhấtcủa môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa Chất lượng củacám mì, cám gạo có ảnh hưởng lứon tới hoạt lực của các emzym amylase

Yêu câu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạpchất độc không quá 0.05%, nên dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng,không hôi mùi mốc

Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn Các cấu tử được đưa vào cóthể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ Các cấu tử này thường là mầmmạch (15-20%) , trấu( 2-25%) mùn cưa(5-10%), có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn( saukhi tách lyenzym) làm cấu tử chính của môi trường

Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng đểđảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.5 atm trong vòng 4-6h, có thể thanh trùng loãng hơnnóng ở nhiệt độ 120 độ C trong 90 phút Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin(40%) và0,8% HCl kỹ thuật theo khối lương

Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%, và giữ độ ẩm này trongsuốt quá trình nuôi Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 55-50% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzym amylase.

Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng củamôi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 Vì vậy cần phải thải nhiệt nàybằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100% Chế độthông khí có thể liên tiếp, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dàycủa lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giaiđoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích khôngkhí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích khôngkhí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích khôngkhí

Nhiệt độ nuôi: tòan bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3thời kỳ:

+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầutiên), đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữcho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-30 độ C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ32-38 độ C cho vi khuẩn Độ ẩm tương đối của không khí 96-100%

+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi ( kéo dài trong vòng 4-18 giờ) Thời kỳnày cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp Ở nhà máy ngưòi ta thổi khôngkhí vô trùng có nhiệt độ 28-29 độ C và độ ẩm cao vào phòng nuôi

Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể thêmnước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu nước chiết bột đậu nành

Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzymamylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nông độ ionhydro trong môi trường và sự biếnđổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi

Độ acid của canh trưởng đựoc xác định bởi thành phần và tính chất của các muối

vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV Trước hết, pHcủa canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ Nếu như thêm vào môi

trường các muối ammonium, thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium, các anion được giảiphóng ra sẽ acid hóa môi trường Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môitrường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzym amylase.

Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình VSV tiêuthụ anion (NO3) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng

lên pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là

5.5-5.7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm mạch và NaNO3 ) Trongquá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có

pH 7.8-8.2 Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụngNaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase (là 7-8) kháchẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzym (pH 4,7-4,9) Khi điều chỉnh pH tớigiá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì họat lực -amylase cũng giảm

đi nhiều (gần bằng 23%) Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ đểnuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7 Để thu

glucoamylase ngưòi ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột.

Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8.pH tối thích banđầu cho chủng này sinh trường là 7,0-7,2 Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0

(Fenikxova Silova,1960) pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac Subtilis nhằm thu hút

-amylase thích hợp nhất là 6,3-7,9 Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đềugiảm vận tốc sinh tổng hợp enzym, còn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn hầu như khôngphát triển

Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng

của VSV và sự tạo thành các enzym amylase Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽdẫn đến làm giảm hoạt lục các enzym amylase Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợithuộc giống Aspergillus là 30-320C ( trong đó có Asp.oryzae 3-9-15 và Asp.awarmoni22) Đối với -amylase, môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 370C.Một số vi khuẩn khác laị có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn diataticus sinh

trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người

ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 500C nuôichủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và phấn Nhiệt độnuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym tạo thành amylase củaBac.coagulans và Bac.slerothermophilus đuợc nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác

xa nhau Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bịmất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550Cchỉ bị vô hoạt có 10-12% (Campell,1955) Các VSV ưa nhiệt(vi khuẩn) sinh tổng hợp nêncác amylase bền nhiệt Enzym với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vựcsản xuất Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp Vìnuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về

độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm

Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí Vì vậysinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy.Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nênlượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung Chính vì lẽ đó,việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khốicũng như sinh tổng hợp các enzym của VSV

Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiệnbằng nhiều cách khác nhau:

- Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi

- Bằng máy các kiểu chuyên dùng

- Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy

- Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men

Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzym (cảnấm sợi, nấm men và vi khuẩn) có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằngsục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi Việc chọnchế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh

trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sựsinh tổng hợp enzym amylase nữa.

Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng (cónhiệt độ cao không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôitrong khoảng 68-72 giờ Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống(48 giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) phải

là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ chothùng sản xuất Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) tương ứng với 180micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cựckiểu clark) Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinhtrưởng Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định Nuôi VSV ưa nhiệtđòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm Điều này cũng dễ hiểu thôi, bởi lẽ ởnhiệt độ tương đối cao (50-650C), độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống,mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên

Nguời ta nuôi Bac.subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 370C) có cánhkhuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là 40m3/

m3 môi trường/giờ Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất (trong 48giờ ở 370C) có cánh khuấy liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60m3/m3 môitrường/giờ Thời gian nuôi VSV để có lượng amylase cực lớn trong phưong pháp nuôichìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng, vào phương pháp nuôi và một số yếu

tố liên quan Việc xác minh thời gian nuôi tối thích cũng đựoc tiến hành bằng thựcnghiệm Chẳng hạn ngưòi ta nuôi Asp.oryzae (3-9-15) trong thùng lên men nhângiống 48 giờ, còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ Lượnggiống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với tổng thể tích môi trưòng dinhdưỡng

Trong công nghiệp rượu, khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp giánđoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ Tuổi của nấm tốt nhất là 24-30 giờ vàlượng vật liệu gieo cấy là 10% so với tổng thể tích môi trường dinh dưỡng Khi nuôibằng phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dòng chảy liên tục, thời gian

nuôi sez ngắn hơn rất nhiều (30-40 giờ) Asp.oryzae 22 sản sinh glucoamylase cũngđựơc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52giờ hay hơn nữa Thời gian nuôi Bac.diastalicus ( để thu chế sản phẩm superbiolasedùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt) trong thùng nhân giống kéo dài 15giờ, còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thểtích môi trường dinh dưỡng Đối với Endomycopsis sp Thời gian nuôi để có lượngamylase cực lớn phải tới 80 giờ.

2.6.4.3 Thu nhận enzym pectinase từ VSV

Enzym pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin Sựphân hủy pectin trong tự nhiên thườn xảy ra khi trái cây chín Những enzym này vìvậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt

Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cámgạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường làcác muối ammonim, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%.Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h, sau đó giảmxuống 240C và nuôi trong 48-52h Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chếphẩm enzym thô và đem tinh chế

Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải đượctrích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate.Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enym pectinase có thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%) Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa0.79 Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu đựoc có độ tinh khiếtkhoảng 90%, con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75% Nhiệt độ kết tủatối ưu đối với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó, lytâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấythăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản

2.6.4.4 Thu nhận chế phẩm enzym từ canh trường bề sâu

a Phương pháp yếm khí:

Sự tích tụ enzum trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gầnđạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơđược sử dụng hoàn toàn.pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp.Đối với nấm mốc,pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzympectinase.pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzym pectinase Khi pH dịch về phíaacid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0 tuy sự tạo thành sinh khối khôngbịảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm Tuy nhiên, pH của cáctrường nuôi cấy A.niger và A.awamori có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự.

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24.32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h.Đối với A niger và A awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môitruờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử Thời gian ủ sơ bộ thường là38-42h Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàmlượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chânkhông canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bịsấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi

ra đạt 60-70% Thời gian lưu của chế phẩm enztm trong thiết bị sấy phun phải khôngquá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C Chế phẩm thuđược cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu chế sản phẩm pectinasetinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muốiammonium sulfate (50-80% trong muối kết) Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độpectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trườngban đầu Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzymbằng phươn pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô Khi độbão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp(đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độbão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinasecao