2 .6 Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật
2.6.3Tinh chế enzym
Để tinh chế enzym người ta dùng các dung môi hữu cơ để kết tủa, hoặc dùng một số trung tính kết tủa.
Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzym bao gồm: etanol, izopropanol, axeton. Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Khi đó lực hút và lực đẩy tỷ lệ thuận với hằng số điện môi. Do đó, trong dung dịch toàn bộ các protein enzym và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử khác đều bị kết tủa. Do sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạo thành một tập hợp và đợt và sẽ lắng xuống.
Các yếu tố có ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm nồng độ dung môi, nhiệt độ, phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzym. Kết tủa enzym bằng etanol người ta thực hiện trong các điều kiện kỹ thuật sau:
- Kết tủa trong điều kiện nhiệt độ từ 3 – 50 C. Thông thường, người ta phải làm lạnh dung dịch chiết enzym và dung môi để tránh biến tính enzym.
- Khối lượng etanol cho vào gấp 3 – 4 lần thể tích dịch chiết enzym. - Khuấy đều để phân phối etanol trong dung dịch.
- Sau khi có kết tủa đem lọc hoặc đem ly tâm để thu nhận kết tủa.
- Rửa kết tủa bằng rượu đậm đặc 2 – 3 lần để tách bớt lượng nước trong kết tủa và đem sấy chân không.
- Kết tủa enzym bằng izopropanol ta thực hiện các điều kiện kỹ thuật như sau: + Khối lượng izopropanol gấp 1,5 – 2 lần khối lượng dịch chiết enzym.
+ Các điều kiên khác thực hiện như thực hiện đối với etanol. Kểt tủa thu được từ việc sử dụng etanol là một kết tủa dạng bột nhão và dính, do đo khi tiến hành sấy sễ gặp rất nhiều khó khăn.
Kết tủa enzym bằng axetol ta cần lượng axetol nhiều hơn 1,5 – 2 lần dịch chiết enzym. Điều lưu ý là axetol là một chất rất dễ gây cháy nổ, do đó việc thực hiện phải rất cẩn thận.
Trong tất cả các phương pháp trên người ta cho thêm 0,2% CaCl2 để làm tăng khả năng kết tủa của enzym và làm bền cấu trúc của chúng.
Khi cần tách riêng biệt một enzym nào đó ra khỏi hỗn hợp enzym kết tủa trên, ta sẽ dựa trên độ hòa tan khác nhau trong hỗn hợp etanol và các enzym đó để tách.
Muối trung tính dùng để kết tủa enzym là: sulfat amon, sulfat natri, sulfat magie.Trong đó người ta cho biết loại tốt nhất là sulfat amon vì độ hòa tan của chúng cao, phản ứng kết tủa không phụ thuộc vào nhiệt độ và chúng không làm biến tính các enzym. Kết tủa bằng sulfat amon thường thu được các kết tủa enzym có hoạt tính cao hơn các kết tủa enzym từ phương pháp dùng dung môi hữu cơ.
Nhược điểm lớn nhất của phương pháp kết tủa enzym bằng phương pháp trung tính là lượng muối trung tính dùng quá nhiều, thường tới 50 – 60% so với dung dịch chiết enzym. Mặt khác, nếu trong phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ để kết tủa, thì ngoài việc thu được kết tủa ta còn có thể tái thu hồi dung môi hữu cơ. Nhưng trong phương pháp kết tủa bằng muối trung tính ta lại không thể tái thu hồi muối trung tính. Do đó, để giảm giá thành ta có thể thực hiện bằng cách là làm cô đặc dịch chiết enzym trước khi cho kết tủa enzym.