b) Cơ chế tác động của enzyme pectinase
3.3.2. Ứng dụng enzym trong chuẩn đoán bệnh.
3.3.2..1.Ứng dụng enzym trong xác định nồng độ cơ chất.
Nồng độ cơ chất được xác định theo hai phương pháp: - Phương pháp xác định điểm cuối (end-point methods)
- Phương pháp xác đo tốc độ phản ứng (measurement of reaction rate) a) Phương pháp xác định điểm cuối.
Nguyên tác của phương pháp như sau: khi cho enzym tác động vào cơ chất, cơ chất sẽ giảm và sản phẩm cuối sẽ tăng lên. Ta có thể xác định được những chỉ số này.
Đối với nồng độ cơ chất thấp hơn giá trị của hằng số (Km) Michaelis, tốc độ phản ứng tuân theo phương trình sau:
Ở đây, thời gian cần cho kết thúc phản ứng phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và hằng số Km của enzym sử dụng .
Phương pháp xác định glucose với glucose-oxidase
Trong phản ứng đầu tiên, glucose bị oxy hóa bởi glucose oxidase tạo thành peroxide hydro theo phương trình sau:
Glucose + O2 + H2O → gluconate + H2O2
Trong phản ứng thứ hai peroxide hydro, dưới tác dụng của enzym horse-radish peroxidase sẽ tạo màu theo phản ứng sau:
H2O2+ chromogen → gluconate + H2O
Trong phân tích này, 2,2’-azino-bis (3-ethyl 2,3-dihydrobenzothiazol sulfonate (ABTS)) được sử dụng như chromogen.
Phương pháp xác định urea
Urea bị phân hủy bởi urease ở 0,7 UI/ml. Và amoniac được tạo thành khi cho enzym glutamate dehydrogenase có hoạt tính 6,2 UI/ml tác động.
urea + H2O → 2NH3+ CO2
2-Cetoglutarate + 2NH4+ + 2NADH → 2L-clutamate+ 2NAD+ + 2H2O b). phương pháp động học (kinetic methods)
phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km
phương pháp xác định glucose: phản ứng xảy ra trong phương pháp này như sau:
glucose-oxidase 10 UI/ml
D-glucose + ATP → D-glucose-6-phosphate + ADP
D-glucose-6-phosphate + NAD.P+ → D-glucono-δ-lactone-6-phosphate + NADPH + H+
Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase. Sau đó, glucose- 6-phosphate bị hydrogen hóa bởi tác động của glucose-6-phosphate
dehydrogenase. Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng máy quang điện.
Xác định triglyceride. Chất béo được thủy phân bằng lipase và carboxylesterase. Glycerol sau đó sẽ được phosphoryl hóa bởi glycerol kinase. ADP được tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến ATP với phospho enol pyruvate và pyruvate kinase. Cuối cùng, pyruvate được hydrogen hóa bởi L-lactate
dehydrogenase và NADH sẽ giảm dần.
Triglyceride + 3H2O → glycerol +3 acid béo glycerol +ADP → glycerol 3 phosphate +ADP ADP + phospho enol pyruvate → ATP + pyruvate Pyruvate + NADPH + H+ → L-lactate + NAD+