2 .6 Chiết và tinh chế enzyme từ vi sinh vật
2.6.4 Phương pháp thu nhận một số enzym quan trọng từ vi sinh vật(VSV):
2.6.4.1. Thu nhận enzym protease từ VSV:
• Nguồn thu nhận enzym protease:
Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.
Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease:
Vi khuẩn: Bac.subtilispha, Bac.cireulans, Bac.sphaericus, Bac.brevis, Bac.cerus… Xạ khuẩn: Str.griseus, Str.rimous, Str.fradiae,…
Nấm mốc: Asp.oryzae, Asp.satoi, Asp.niegr, Pen.chrysogenum, Pen.cyaneo fulvum, Mucor.pusillus
• Các phương pháp thu nhận enzym protease
a. Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt
Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi.
Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2( đối với nấm sợi) hoặc từ 6,2-7,2 ( đối với vi khuẩn). Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy
thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp nhất ( thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất). Nói chung, đối với đa số nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ. Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiết rút enzym khỏi môi trường, loại bỏ nhũng phần không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ.
b. Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu
Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng. Sau khi làm lạnh, cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%. Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy. Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc.
Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượng oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV. Thể tích thùng lên men càng lớn càng khó khống chế yếu tố này. Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3.Theo các tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men(chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian) sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm.
c. Thu nhận enzym protease:
Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSV theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối loãng hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nói trên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc li tâm, thu lấy dung dịch trong. Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzym trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt.
Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym. Ở Nhật bản đã tìm đựoc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy. Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt động enzym.
Hệ enzym amylase là một trong số các hệ enzym đựoc sử dụng rộng rãi trong nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác.
Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzym nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814.
Các enzym amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và vi khuẩn.
• Nguồn enzym amylase từ VSV
Trong thiên nhiên enzym có nhiều ở hầu hết ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzym do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzym này trong những điều kiện xác định.
Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thu enzym chỉ đạo. Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzym amylase. Những chủng VSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác và thậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzym khác nhau.
VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
• . Thu nhận enzym amylase từ VSV
Muốn thu được các enzym amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyên truyền lấy nhưng chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzym amylase không những chỉ phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu.
Ngoài các yếu tố hóa học ( thành phần môi trường) ra, cá điều kiện lý hóa của quá trình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzym amylase. Người ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp. Ví dụ, có thể dùng Bac.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hạơc chủ yếu là phức hệ protease.
Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzym amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản tối quan trọng. Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu.
a.Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt
Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ ( tinh bột, dextrin), hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.
Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Chất lượng của cám mì, cám gạo có ảnh hưởng lứon tới hoạt lực của các emzym amylase.
Yêu câu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05%, nên dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc.
Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Các cấu tử được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm mạch (15- 20%) , trấu( 2-25%) mùn cưa(5-10%), có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn( sau khi tách lyenzym) làm cấu tử chính của môi trường.
Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.5 atm trong vòng 4-6h, có thể thanh trùng loãng hơn nóng ở nhiệt độ 120 độ C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin(40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lương.
Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%, và giữ độ ẩm này trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 55-50% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzym amylase.
Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tiếp, gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không khí.
Nhiệt độ nuôi: tòan bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ:
+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu tiên), đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-30 độ C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-38 độ C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí 96-100%
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi ( kéo dài trong vòng 4-18 giờ). Thời kỳ này cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy ngưòi ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29 độ C và độ ẩm cao vào phòng nuôi.
Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzym có thể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu nước chiết bột đậu nành.
Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzym amylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nông độ ionhydro trong môi trường và sự biến đổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi.
Độ acid của canh trưởng đựoc xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV. Trước hết, pH của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzym amylase.
Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình VSV tiêu thụ anion (NO3) sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng lên. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae 3-9-15 nhằm thu -amylase là 5.5-5.7 (môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm mạch và NaNO3 ). Trong quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có pH 7.8-8.2. Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase (là 7-8) khác hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzym (pH 4,7-4,9). Khi điều chỉnh pH tới giá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi (pH=6) thì họat lực -amylase cũng giảm đi nhiều (gần bằng 23%). Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu glucoamylase ngưòi ta nuôi Asp.awamori 22 trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột. Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8.pH tối thích ban đầu cho chủng này sinh trường là 7,0-7,2. Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0 (Fenikxova. Silova,1960). pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac. Subtilis nhằm thu hút -amylase thích hợp nhất là 6,3- 7,9. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đều giảm vận tốc sinh tổng hợp enzym, còn nếu pH bằng 8,8-9,0 thì vi khuẩn hầu như không phát triển.
Nhiệt độ nuôi: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng của VSV và sự tạo thành các enzym amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lục các enzym amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30-320C ( trong đó có Asp.oryzae 3-9-15 và Asp.awarmoni 22). Đối với -amylase, môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 370C. Một số vi khuẩn khác laị có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn. .diataticus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 500C nuôi chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzym tạo thành amylase của Bac.coagulans và
Bac.slerothermophilus đuợc nuôi ở 35 C và 55 C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90-94% hoạt độ ban đầu; trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C chỉ bị vô hoạt có 10- 12% (Campell,1955). Các VSV ưa nhiệt(vi khuẩn) sinh tổng hợp nên các amylase bền nhiệt. Enzym với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp. Vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm.
Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzym của VSV.
Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau:
- Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi - Bằng máy các kiểu chuyên dùng
- Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy - Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men.
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzym (cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi. Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự sinh tổng hợp enzym amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng (có nhiệt độ cao không quá 400C ) trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-72 giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống (48
giờ) thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) phải là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae (3-9-15) tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường (nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Điều này cũng dễ hiểu thôi, bởi lẽ ở nhiệt độ tương đối cao (50-650C), độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống, mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên.
Nguời ta nuôi Bac.subtilis trong thùng nhân giống (15 giờ ở 370C) có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là 40m3/m3