khảo sát sự kháng kháng sinh của acinetobacter baumannii và các chủng acinetobacter spp tại viện pasteur tp hồ chí minh

baumannii biểu hiện một khả năng nổi bật là tích tụ cơ chế kháng thuốc biến đổi tuyệt vời bằng nhiều cơ chế khác nhau, hơn nữa còn thu nhận được các yếu tố thuộc về gene như plasmids, i

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS CAO H ỮU NGHĨA

Thành ph ố Hồ Chí Minh - 2013

1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

2

LỜI CẢM ƠN

Lu ận văn được hoàn thành với sự giúp đỡ quý báu từ Thầy Cô, Anh Chị, các bạn Xin g ửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:

TS CAO H ỮU NGHĨA – người trực tiếp hướng dẫn khoa học – đã tận tâm hướng

dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn

Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi trong việc học tâp và nghiên cứu

Quý Thầy Cô trường ĐHSP Thành Phố Hồ Chí Minh, Cô Cao Minh Nga đã tận tình

dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian tôi được học tại trường

Chị Vũ Lê Ngọc Lan, Chị Nguyễn Thị Phương Quỳnh, Cô, Anh Chị phòng Vi sinh

Bệnh phẩm khoa LAM (Pasteur) cùng các Anh Chị phòng Vi khuẩn 2 khoa Miễn dịch (Pasteur), Cô Trần Thái Thành bệnh viện Ngoại Thần Kinh Quốc Tế đã nhiệt tình dạy bảo

và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn này

Các bạn sinh viên cùng thực tập

Gia đình là điểm tựa vững chắc cho tôi

Tác giả

3

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

L ỜI CẢM ƠN 2

M ỤC LỤC 3

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

M Ở ĐẦU 8

1 Lý do ch ọn đề tài 8

2 M ục đích đề tài 9

3 Nhi ệm vụ của đề tài 9

4 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 9

5 Th ời gian, địa điểm thực hiện đề tài 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Nhi ễm trùng bệnh viện 11

1.1.1 Khái niệm 11

1.1.2 Những đối tượng có nguy cơ nhiễm trùng bệnh viện 11

1.1.3 Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện 11

1.2 S ự đề kháng kháng sinh 13

1.2.1 Kháng sinh 13

1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 19

1.2.3 Một số biện pháp hạn chế gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh 22

1.3 Acinetobacter 23

1.3.1 Khái quát Acinetobacter 23

1.3.2 Acinetobacter baumannii 28

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu sự kháng kháng sinh của Acinetobacter trên thế gi ới và trong nước 33

1.4.1 Trên thế giới 33

1.4.2 Trong nước 34

C HƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu 37

2.2 Đối tượng nghiên cứu 37

2.2.1 Đối tượng 37

2.2.2 Cỡ mẫu 37

4

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.3.1 Vật liệu 37

2.3.2 Phương pháp thực hiện 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51

3.1 Kết quả phân lập, định danh các chủng Acinetobacter 51

3.2 Đặc tính bệnh nhân nghiên cứu 54

3.2.1 Đặc tính về giới bệnh nhân 54

3.2.2 Đặc tính về tuổi bệnh nhân 55

3.3 Sự phân bố của vi khuẩn Acinetobacter 57

3.4 Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii 58

3.5 Các ch ủng sản xuất metallo-β-lactamase được sàng lọc nhanh theo phương pháp đĩa đôi IMP-EDTA 62

3.6 Một số gene kháng kháng sinh phát hiện được ở Acinetobacter baumannii 63

3.6.1 Gene blaampC 63

3.6.2 Gene blaOXA-23 65

3.6.3 Gene blaIMP-1 66

3.6.4 Gene blaNDM-1 68

3.7 K ết quả giải trình tự một số gene kháng kháng sinh 69

3.7.1 Gene blaAmpC 69

3.7.2 Gene blaOXA-23 72

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 86

ARN Acid ribonucleic

ATCC American Type Culture Collection- Ngân hàng chủng giống Mỹ

HAIs Health care-associated infections- Nhiễm trùng bệnh viện

I Intermediate- trung gian

ICU Intensive care unit- đơn vị chăm sóc đặc biệt

MH Mueller Hinton agar

NCBI Nation Center for Biotechnology Information – Trung tâm quốc gia về thông tin Công nghệ sinh học

NET Netilmicin (30μg)

OMPs Outer membrane proteins- protein màng ngoài

PABA Acid para-amino-bezoic

PCR Polymerase chain reaction- phản ứng khuếch đại chuỗi

PIP Piperacillin (100µg)

R Resistant- kháng

S Susceptible- nhạy cảm

7

SXT Trimethoprim- sulfamethoxazole (1.25/23.75 μg)

tARN Transfer ribonucleic acid

TBE Tris-acetic base EDTA

TCC Ticarcillin/clavulanic acid (75/10μg)

TE Tetracyline (30μg)

TSA Trypticase soy agar

VAP Ventilator-associated pneumonia- Viêm phổi liên quan đến thở máy

VF Virulence factors- Yếu tố độc lực

biệt là trên da nhân viên y tế Acinetobacter là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây

nhiễm khuẩn bệnh viện Chúng gây những bệnh lý với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng [12] [14]

Tỷ lệ Acinetobacter spp gây nhiễm khuẩn bệnh viện đã tăng lên đều đặn trong những

năm gần đây trên thế giới Kết hợp với tỷ lệ nhiễm khuẩn tăng là sự gia tăng của những chủng không nhạy cảm với kháng sinh, cụ thể Carbapenems, đặc biệt đáng lo ngại

Ở Anh, nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter kháng Carbapenems đã xảy ra từ năm 2000 Từ năm 2004 đến năm 2008 tỷ lệ Acinetobacter không nhạy với Meropenem đã tăng từ 13% đến 29% Trong năm 2008, sự không nhạy của Acinetobacter với các lớp khác

của kháng sinh được báo cáo: Aminoglycosides khoảng 20%; Ciprofloxacin 30%; Ceftazidime 70%; Cefotaxime 89%; Piperacillin/ Tazobactam 50% Ở Châu Âu, tỷ lệ kháng kháng sinh của Acinetobacter được báo cáo cao nhất thuộc vùng Địa Trung Hải bao

gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý và Nhật [60]

Ở Mỹ, dữ liệu nhiễm khuẩn bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter đa kháng

thuốc, và không nhạy với Carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong năm 2008 [60]

Ở Việt Nam, nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong năm 2006-2007 bao

gồm 2 bệnh viện trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh và 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy 553/7571 (7,8%) bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs) Căn nguyên gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp là: viêm phổi (41,9%), nhiễm khuẩn vết mổ (27,5%), nhiễm khuẩn tiêu hoá (13,1%) Các vi khuẩn thường gặp là Pseudomonas aeruginosa (31,5%),

Acinetobacter baumannii (23,3%),và Candida spp (14,4%) Chủ yếu, HAIs xảy ra ở khoa

phẫu thuật [9]

Trong một nghiên cứu hiện thời về nhiễm trùng tại ICU (intensive care units) tại 75

quốc gia của 5 lục địa, Acinetobacter được tìm thấy đứng thứ năm trong các tác nhân gây

bệnh phổ biến nhất Hai nét đặc biệt chính đóng góp cho khả năng gây bệnh ngày càng tăng

9

của A baumannii: (i) A baumannii biểu hiện một khả năng nổi bật là tích tụ cơ chế kháng

thuốc biến đổi tuyệt vời bằng nhiều cơ chế khác nhau, hơn nữa còn thu nhận được các yếu

tố thuộc về gene như plasmids, integrons, transposons, hay vùng kháng kháng sinh, làm cho

vi khuẩn này đa hay toàn kháng thuốc và (ii) Khả năng tồn tại trong môi trường suốt một khoàng thời gian dài, kết hợp với sự kháng kháng sinh vốn có đến các yếu tố làm khô và

chất tẩy uế, làm A baumannii hầu như không thể diệt tận gốc từ thử nghiệm lâm sàng

Thêm vào đó, khả năng sản xuất màng sinh học đã đóng góp rất lớn vào sự tồn tại dai dẳng

và kháng kháng sinh [37] Qua các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới và trong nước cho thấy: nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter và khả năng kháng kháng

sinh của vi khuẩn này có xu hướng ngày càng tăng Việc nhiễm khuẩn bệnh viện do

Acinetobacter và việc sử dụng kháng sinh hợp lý ảnh hưởng trực tiếp đến sự sống còn của

bệnh nhân Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT SỰ KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII VÀ CÁC CHỦNG ACINETOBACTER SPP

TẠI VIỆN PASTEUR TP HỒ CHÍ MINH”

2 Mục đích đề tài

Góp phần giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh thích hợp điều trị cho bệnh nhân và tìm gene kháng kháng sinh của vi khuẩn

3 Nhiệm vụ của đề tài

- Phân lập và định danh các chủng Acinetobacter

- Khảo sát đặc tính bệnh nhân nhiễm Acinetobacter

- Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii

- Khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của Acinetobacter spp

- Tìm một số gene mã hóa cho tính kháng kháng sinh của Acinetobacter

4 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Các chủng Acinetobacter phân lập được từ các bệnh phẩm tại viện Pasteur TP Hồ

Chí Minh từ 01-06/2013

5 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

- Thời gian: từ 01/2013 đến tháng 06/2013

10

- Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

11

1.1 Nhiễm trùng bệnh viện

1.1 1 Khái niệm

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nhiễm trùng bệnh viện được định nghĩa như sau:

“nhiễm trùng bệnh viện là những nhiễm trùng mắc phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện

mà thời điểm nhập viện hoặc trước đó không thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào Nhiễm trùng 48 giờ sau khi nhập viện thường được coi là nhiễm trùng bệnh viện” [1]

1.1 2 Những đối tượng có nguy cơ nhiễm trùng bệnh viện

Những đối tượng có nguy cơ nhiễm trùng bệnh viện là những bệnh nhân bị suy giảm

miễn dịch làm giảm khả năng đề kháng của cơ thể bởi các lý do chính sau:

- Mắc các bệnh của cơ quan miễn dịch

- Dùng các thuốc giảm miễn dịch

- Sau phẫu thuật hoặc sau mắc một bệnh nặng hoặc đang mắc một bệnh mạn tính

- Người có tuổi nằm điều trị ở bệnh viện lâu ngày, trẻ em còi xương, suy dinh dưỡng, bị bệnh tiêu chảy kéo dài,…

- Nhân viên bệnh viện thường xuyên tiếp xúc với vi sinh vật gây bệnh trong khi cơ

thể có sức đề kháng kém, tình trạng vệ sinh, bảo hộ lao động chưa được cải thiện [5]

1.1 3 Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện

Nguồn vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện rất phong phú Khi cơ thể bị suy giảm

miễn dịch thì vi sinh vật từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh (nhiễm trùng ngoại sinh) hoặc bị nhiễm trùng do các vi sinh vật có ngay bên trong cơ thể (nhiễm trùng nội sinh) Các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện bao gồm: vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm [1] [5]

1.1 3.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện có thể xuất phát từ hai nguồn gốc khác nhau Vi khuẩn nội sinh: thường cư trú ở lông, tuyến mồ hôi, tuyến chất nhờn Bình thường trên da người có khoảng 13 loại vi khuẩn ái khí được phân bố khắp cơ thể và có vai trò ngăn cản sự

12

xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh Vi khuẩn ngoại sinh: là vi khuẩn từ dụng cụ y tế, từ không khí, nước hoặc lây chéo giữa các bệnh nhân

Vi khuẩn Gram dương, cầu khuẩn Staphylococcus aureus là tác nhân quan trọng

gây nhiễm trùng bệnh viện từ cả hai nguồn nội sinh và ngoại sinh Vi khuẩn Staphylococcus

aureus có thể gây nên nhiều nhiễm trùng đa dạng và rộng ở phổi, xương, tim và là tác nhân quan trọng trong nhiễm trùng bệnh viện có liên quan đến dây truyền máu, ống thở, nhiễm trùng vết bỏng và nhiễm trùng vết mổ

Vi khuẩn Gram âm, trong đó các trực khuẩn Gram (-) thường có liên quan đến nhiễm trùng bệnh viện và phổ biến ở bệnh nhân nhiễm trùng phổi ở khoa Điều trị tích cực Các loài

thường phân lập được trong nhiễm trùng bệnh viện và thường được báo cáo: P aeruginosa,

Klebsiella pneumonia, Echerichia coli, Proteus spp., Acinetobacter spp Trong đó,

Acinetobacter spp là tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện với chiều hướng ngày càng tăng

1.1.3.2 Virus

Một số virus có thể gây nhiễm trùng bệnh viện như virus viêm gan B và C (lây qua đường máu, lọc máu, đường tiêm, nội soi), các virus hợp bào đường hô hấp, SARS và virus

đường ruột (Enteroviruses: truyền qua đường tiếp xúc từ tay-miệng và theo đường phân

miệng) Các virus khác cũng luôn lây truyền trong bệnh viện như Cytomegalo virus, HIV,

Ebola, Influenzae, Herpes virus, Varicella-zoster virus

1.1 3.3 Ký sinh trùng và nấm

Một số ký sinh trùng (Giardia lamblia) có thể lây truyền dễ dàng giữa những người

trưởng thành và trẻ em Nhiều loại nấm và ký sinh trùng là các sinh vật cơ hội và là nguyên nhân gây nhiễm trùng khi bệnh nhân được điều trị quá nhiều kháng sinh và trong trường

hợp suy giảm miễn dịch (Candida albicans, Aspergillus spp., Cryptococccus neoformans,

Cryptosporidium)

Các ký sinh trùng và nấm thường là căn nguyên chính gây nhiễm trùng ở những bệnh nhân bị tổn thương hệ miễn dịch Các loài nấm Aspergillus spp thường gây nhiễm bẩn môi

trường không khí và các loài này thường bắt nguồn từ bụi và đất, đặc biệt là quá trình xây

dựng bệnh viện C albicans và C neoformans lại rất thường gặp trên bệnh nhân suy giảm

miễn dịch mắc phải ở nhiều giai đoạn khác nhau

13

1.2 S ự đề kháng kháng sinh

1.2.1 Kháng sinh

1.2 1.1 Định nghĩa

Kháng sinh (antibiotic, chemotherapeutica) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có

khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu (mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn) bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ở tầm phân tử [5]

1.2 1.2 Phân loại

Dựa trên sự liên quan về cấu tạo hóa học, đưa đến sự liên quan về cơ chế và hoạt phổ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm lớn: β-lactams và non β-lactams

a/ β- lactams: Gọi là β-lactams vì phân tử của chúng có một vòng β-lactam Cơ chế

tác động chung là ức chế tổng hợp vách của tế bào vi khuẩn Nhóm này gồm các lớp và phụ

lớp:

Bảng 1.1 Lớp, phụ lớp và kháng sinh nhóm β-lactams [23]

Amino-penicillin Ampicillin, Amoxicillin Ureido-penicillin Azlocillin, Mezlocillin, Piperacillin Carboxy-penicillin Carpenicillin, Ticarcillin

Penicillinase- stable Penicillins

Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin

14

Ticarcillin- clavulanic acid Cepems (tiêm) Cephalosporin I Cefazolin, Cephalothin, Cephapirin,

Cephradine Cephalosporin II Cefamandole, Cefonicid,

Cefuroxime Cephalosporin III Cefoperazone, Cefotaxime, Ceftriaxone,

Ceftizoxime, Ceftazidime Cephalosporin IV Cefepime

Cephalosporins kháng

sự hoạt động của MRSA

Cefditoren, Cefetamet, Cefixime, Cefpodoxime, Cefprozil, Ceftibuten, Cefuroxime, Cephalexin, Cephradine

Kanamycin, Netilmycin, Plazomicin,

Lipoglycopeptide Dalbavanco, Oritavancin, Teicoplanin,

Quinolones Quinolone Cinoxacin, Garenoxacin, Nalidixic acid

Flouroquinolone Besifloxacin, Ciprofloxacin, Clinafloxacin,

Enoxacin, Finafloxacin, Fleroxacin, Gatifloxacin, Gemifloxacin, Grepafloxacin, Levofloxacin, Lomefloxacin, Moxifloxacin, Norfloxacin, Sparfloxacin, Trovafloxacin, Ulifloxacin (prulifloxacin)

Quinupristin-16

dalfopristin

Glycylcyclines Tigecycline Aminomethylcycline Omadacycline

17

Các kháng sinh tác động lên thành tế bào đa phần thuộc nhóm diệt khuẩn (bactericide) Có nhiều cách tác động lên thành tế bào tùy vào loại kháng sinh

* Để có được tác dụng, các β-lactam phải đạt được các yêu cầu sau:

- Tiếp xúc được với màng sinh chất: các β-lactam thấm dễ dàng qua lớp murein để

tiếp xúc với màng sinh chất nên thuốc có hiệu lực với vi khuẩn Gram dương Chúng không

thấm qua màng bọc phospholipid của vi khuẩn Gram âm, chúng chỉ vào được nhờ các kênh

ưa nước porin Các chất ưa nước như Ampicillin, Amoxicillin, Cephalosporins thấm qua vỏ Gram âm tốt hơn Penicillin [2]

- Gắn vào các thụ thể PBPs (Penicillin-binding proteins) của tế bào Có khoàng 3-6

thụ thể PBP, trong đó một số thụ thể là những enzyme transpeptidase Sau khi gắn vào một hay nhiều thụ thể thuốc sẽ phong bế transpeptidase, làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của vách tế bào Cơ chế của việc phong bế transpeptidase có lẽ do enzyme này gắn vào Penicillins hoặc Cephalosporins có nhân cấu trúc tương tự với acyl-D-alanyl-D-alanine, một phân tử mà enzyme bình thường vẫn tác động, nên tác động của enzyme bị phong bế Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa các enzyme tự tiêu (autolytic enzymes) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương Trong môi trường ưu trương những tế bào bị biến đổi thành protoblast hay sphaeroplast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên rất dễ vỡ

* Một số thuốc khác như Bacitracin, Vancomycin, Novobiocin ức chế giai đoạn đầu của

việc tổng hợp peptidoglycan Bacitracin ngăn cản việc dephosphoryl hóa phospholipid cần thiết cho tổng hợp chuỗi peptidoglycan Vancomycin ngăn cản sự di chuyển đường pentapeptide thành chuỗi đa phân tử bên ngoài màng tế bào Do việc tổng hợp ở giai đoạn đầu này xảy ra ở bên trong màng tế bào chất nên thuốc phải được ngấm vào bên trong màng

mới có tác dụng [15] [16]

b/ Ức chế chức năng màng tế bào

Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất Màng này được xem như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, điều hòa sự trao đổi với môi trường bên ngoài Nếu sự toàn vẹn chức năng màng tế bào bị phá vỡ thì những đại phân

tử và ion sẽ thoát khỏi tế bào làm tế bào chết Các kháng sinh thuộc nhóm Polypeptide (Colistin, Polymycin,…), kháng sinh này gắn kết trên các chất hóa học riêng biệt làm xáo

18

trộn chức năng thẩm thấu, làm cho các chất trong bào tương như Mg2+

, K+, Ca2+ thoát ra ngoài và tế bào bị chết [15] [16]

việc sao chép ADN của virus Mitomycin gắn vào 2 chuỗi ADN ngăn cản 2 chuỗi tách rời

và như vậy ADN không được sao chép Tuy nhiên Actinomycin và Mitomycin đều ức chế tế bào vi khuẩn lẫn tế bào động vật nên ít được dùng trong điều trị

Nalidixic acid và Oxolinic ức chế sự tái tạo ADN do ức chế hoạt động của enzyme ADN gyrase là enzyme nối các ADN trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn

Rifampin ức chế sự tổng hợp ARN do ức chế ARN polymerase

Sulfonamides: là một nhóm phân tử có cấu trúc tương tự với acid benzoic (PABA- là một chất biến dưỡng cần thiết, được dùng như là một tiền chất để tổng

para-amino-hợp acid folic, cần thiết cho việc tạo ra các purin và pyrimidin, một giai đoạn quan trọng để

tổng hợp acid nucleic) Các Sulfonamides có tác dụng cạnh tranh vị trí hoạt động với PABA, tạo ra những chất tương tự acid folic nhưng không có chức năng dẫn đến việc cản

trở sự phát triển của vi khuẩn [15] [16]

d/ Ức chế tổng hợp protein

http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/654antibiotic.html

Hình 1.2 Sự ức chế tổng hợp protein ở tế bào vi khuẩn của kháng sinh

SỰ ỨC CHẾ TỔNG HỢP PROTEIN BỞI KHÁNG SINH

Chuỗi Peptide

Chloramphenicol gắn vào 50S rARN và ức chế tạo cầu peptide

Erythromycin gắn vào 50S rARN và ngăn cản sự chuyển

v ị trên mARN

Tetracycline ngăn cản tARN không đọc được mã trên mARN

Streptomycin thay đổi

hình dạng của 30S

rARN và dẫn đến

mARN bị đọc sai

19

Lớp Aminoglycosides (Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin,…): Kháng sinh gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosome dẫn đến thông tin trên mARN bị đọc sai nên tổng hợp được các protein không giống như thông tin được mã hóa

Lớp Macrolides (Erythromycin, Ezithromycin, …) gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome và ngăn cản việc chuyển vị trí trong quá trình tổng hợp protein Tương tự ở vị trí này là kháng sinh thuộc lớp Lincosamides (Clindamycin)

Lớp Phenicols (Chloramphenicol) gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyl transferase, ngăn chặn việc thành lập liên kết peptide

Lớp Tetracylines (Tetracycline, Minocycline, Doxycycline,…) tác động đến sự tổng

hợp protid theo nhiều cơ chế:

+ Gắn với thụ thể (receptor) trên tiểu đơn vị 30S của ribosome làm ribosome không

gắn vào mARN được

+ Gắn với thụ thể (receptor) trên 50S của ribosome làm tARN vận chuyển không gắn vào ribosome được

Ngoài ra, sự gắn kết của các Tetracyclines với ion Ca2+, Mg2+,…(các ion có trong ribosome cần thiết cho sự tổng hợp chuỗi peptide) Do vậy quá trình tổng hợp protein bị ngăn chặn

Ngoài các cơ chế trên, còn có cơ chế khác như:

Ức chế tổng hợp glucid: Nitrofurantoin ức chế acetyl-coenzym A, làm ảnh hưởng

đến chu trình chuyển hóa glucid của vi khuẩn [15] [16]

1.2 2 Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

1.2 2.1 Phân loại đề kháng kháng sinh

20

+ Đề kháng tự nhiên: Một số vi khuẩn không chịu tác động của một số kháng sinh

nhất định Ví dụ: Pseudomonas không chịu tác dụng của Penicillin, vi khuẩn không có vách

như Mycoplasma sẽ không chịu tác dụng của kháng sinh ức chế sinh tổng hợp vách như lactam

β-+ Đề kháng thu được: Do một biến cố di truyền là đột biến hoặc nhận được gene đề kháng làm cho một vi khuẩn đang từ không có trở nên có gene đề kháng Các gene đề kháng

nằm trên nhiễm sắc thể hay/và plasmid của vi khuẩn hoặc/và trên transposon Chúng có thể lan truyền được từ vi khuẩn nọ sang vi khuẩn kia thông qua các hình thức vận chuyển di truyền khác nhau như biến nạp, tải nạp, tiếp hợp và chuyển vị trí [5]

1.2 2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Vi khuẩn phát triển nhiều cơ chế đề kháng, những cơ chế chính mà các vi khuẩn dùng để chống lại tác dụng của kháng sinh được chia thành các loại sau:

- Khả năng gây bất hoạt của enzyme: β-lactam, Chloramphenicol,…;

- Biến đổi đích tác động của kháng sinh: β-lactam, Rifampicin, Quinolone, Tetracycline,…;

- Làm giảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn, gọi là tính không thấm: β-lactam, Quinolone, Tetracycline,…;

- Thải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn: β-lactam, Tetracycline,…;

- Vi khuẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc;

- Vi khuẩn có enzyme đã bị thay đổi [15] [16]

a/ Kh ả năng gây bất hoạt của enzyme

Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh,

bằng cách này chúng có thể phá hủy hoạt tính của kháng sinh Cơ chế này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng β-lactam, biến Penicillin thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc Chloramphenicol được biết đến với sự bất hoạt kháng sinh bởi enzyme acetyltransferase acetyl hóa 2 nhóm hydroxyl của Chloramphenicol Các kháng sinh thuộc Aminoglycosides và Macrolides cũng bị đề kháng bằng cơ chế này [15] [16]

b/ Thay đổi tại điểm tác động

21

Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào hoặc tác động đến vi khuẩn Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu

hết kháng sinh Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành

tế bào vi khuẩn gọi là penicillin binding protein (PBP) Staphylococcus aureus đề kháng

Methicillin có một yếu tố di truyền gọi là SCCmec (Staphylococcal casette chromosome mec)

chứa gene mecA mã hóa cho sự sản xuất một PBP biến đổi (PBP2a), không bị tác động bởi

sự gắn kết của kháng sinh nhóm β-lactam Những vi khuẩn có gene này có khả năng đề kháng nhiều kháng sinh nhóm β- lactam, ngay cả Carbapenem Các vi khuẩn Gram âm mất receptor P10 trên tiểu đơn vị 30S của ribosome nên Aminoglycosides không còn tác động được nữa [15] [16]

c/ Làm gi ảm hay loại trừ khả năng thấm của kháng sinh vào vi khuẩn

Đây là một cơ chế quan trọng của sự đề kháng ở vi khuẩn Gram âm Thuốc đi vào tế bào vi khuẩn thông qua kênh ở ngoài màng, sự đột biến dẫn tới đóng hoặc làm giảm kích thước của kênh, thường đem lại đề kháng kháng sinh với mức độ thấp Những thay đổi ở thành tế bào vi khuẩn Gram âm dẫn đến giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào vi khuẩn cũng dẫn đến đề kháng Cơ chế này xảy ra với các kháng sinh nhóm β-lactam, Quinolones, Aminoglycosides, Sulfamethoxazole và Trimethoprim [15] [16]

d/ Th ải trừ tích cực ra ngoài tế bào vi khuẩn

Hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi khuẩn Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong

những cơ chế chính của vi khuẩn đề kháng với các kháng sinh Tetracyclines mã hóa bởi gene Tet (Tet-pumb) Hiện nay cơ chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh (đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi các gene MefA/E (Macrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (Aminoglycosides), MexAB-OprM (nhóm β-lactam),… [15] [16]

e/ Vi khu ẩn thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

Sulfonamides bị kháng do vi khuẩn tìm được đường khác tổng hợp folic acid mà không cần dùng PABA ở ngoài tế bào nữa [15] [16]

f/ Vi khu ẩn có enzyme đã bị thay đổi

22

Enzyme bị thay đổi vẫn còn thực hiện được chức năng biến dưỡng, nhưng ít bị ảnh hưởng của thuốc so với enzyme ở vi khuẩn nhạy cảm Ví dụ: ở vi khuẩn nhạy cảm Sulfonamides, tetrahydropteroic acid synthetase có ái lực với Sulfonamides cao hơn nhiều

so với PABA, còn ở vi khuẩn kháng Sulfonamides do đột biến thì ngược lại

Một số cơ chế này có ở những vi khuẩn Gram dương và cả vi khuẩn Gram âm: do enzyme gây bất hoạt kháng sinh, thay đổi đích của vi khuẩn Ngược lại tính làm giảm hay

loại trừ khả năng thấm của kháng sinh chỉ thuộc về vi khuẩn Gram âm (vi khuẩn Gram dương không có màng ngoài nên rất dễ thấm ở lớp peptidoglycan nên thường cho phép kháng sinh đi qua) Hiện tượng thải trừ tích cực đã được mô tả ở các vi khuẩn Gram dương như các tụ cầu: Một hệ thống thải trừ thuộc ATP bơm Macrolides ra khỏi tế bào vi khuẩn ở

các Staphylococcus spp [15] [16]

1.2 2.3 Cơ chế lan truyền gene đề kháng

Một vi khuẩn có gene đề kháng, nó sẽ truyền dọc sang các thế hệ sau qua sự nhân lên

của tế bào; ngoài ra thông qua các hình thức vận chuyển di truyền, gene đề kháng có thể được truyền ngang từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác Xét về mặt dịch tễ học, gene đề kháng có thể được lan truyền trên bốn phương diện, đó là:

- Trong tế bào: Thông qua biến cố tái tổ hợp hoặc chuyển vị trí của transposon, gene

đề kháng có thể truyền từ phân tử ADN này sang phân tử ADN khác ngay trong một tế bào

- Giữa các tế bào: Thông qua các hình thức vận chuyển di truyền như tiếp hợp, biến

nạp và tải nạp gene đề kháng có thể truyền từ tế bào này sang tế bào kia trong cùng một loài hay khác loài

- Trong quần thể sinh vật: Thông qua sự chọn lọc dưới tác dụng của kháng sinh các dòng vi khuẩn đề kháng được chọn lọc và phát triển thay thế các dòng vi khuẩn nhạy cảm

- Trong quần thể đại sinh vật: Thông qua sự truyền nhiễm vi khuẩn đề kháng truyền

từ người này sang người khác hoặc từ súc vật sang người [5]

1.2 3 Một số biện pháp hạn chế gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh

- Chỉ dùng kháng sinh để điều trị những bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra

- Chọn kháng sinh theo kết quả kháng sinh đồ; nên ưu tiên kháng sinh có hoạt phổ

hẹp có tác dụng đặc hiệu trên vi khuẩn gây bệnh

- Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian

Các loài Acinetobacter có dạng các cầu trực khuẩn Gram âm, có ở khắp nơi trong

môi trường Các loài gây bệnh chiếm số ít trong các loài Acinetobacter đã biết như:

Acinetobacter baumannii, Acinetobacter genomic species 3, Acinetobacter genomic species 13TU Trong thực hành, các loài này thường được nhóm lại với nhau và dùng từ

‘Baumannii group’

Hơn 15-20 năm trở lại đây, các loài Acinetobacter nổi lên như mầm bệnh đáng lo

ngại trong bệnh viện Chúng thường dẫn đến nhiễm khuẩn hàng loạt từ các thiết bị y tế, và cũng rất nhanh chống phát triển cơ chế đề kháng nhiều tác nhân kháng sinh

Chi Acinetobacter bao gồm 21 loài đã biết rõ tên, 14 loài chưa biết rõ tên Hệ thống xác định kiểu hình và phương pháp xác định sự khác nhau về kiểu gene của các loài cũng được khám phá và được dùng để nghiên cứu sự đa dạng và phát sinh loài trong Chi

Acinetobacter có dạng hình que trong suốt quá trình phát triển nhanh và cầu trực khuẩn trong pha cân bằng Vỏ capsule (thường), không di động (mặc dù chúng biểu hiện sự

di động co quắp) Sự giữ màu crystal violet có thể cho kết quả không chính xác như cầu khuẩn Gram dương

Khuẩn lạc có đường kính 1-2mm, không sắc tố, vòm, nhày, bề mặt nhẵn

đến rổ

Oxidase (-) (ngược với Neisseria spp., Moraxella spp.), Indole (-), Catalase (+),

không chuyển hóa nitrate, không phát triển trong điều kiện yếm khí (khác

Enterobacteriaceae)

A baumannii là m ột loài lớn của chi Acinetobacter Các loài khác thỉnh thoảng gây

bệnh cho người bao gồm: A calcoaceticus, A lwoffi, A junii, A johnsonii và A baylyi [4]

[53] [67]

24

1.3.1.2 Dịch tễ học của Acinetobacter

Nhiễm trùng bệnh viện nguyên nhân thường thấy bởi Acinetobacter spp đã tăng lên

đều đặn trong những năm gần đây trên thế giới Các dòng quốc tế đã được xác định và nhiều nhóm được báo cáo là bùng phát dai dẳng bao gồm sự lan truyền trong bệnh viện và thực tế lan truyền trên thế giới Kết hợp với tỷ lệ nhiễm trùng tăng, một tỷ lệ tăng lên của chủng không nhạy cảm kháng sinh, cụ thể Carbapenems, thì đặc biệt đáng lo ngại

Ở Anh, nhiễm khuẩn bệnh viện do Acinetobacter kháng Carbapenems đã xảy ra từ năm 2000 Từ năm 2004 đến năm 2008 tỷ lệ Acinetobacter không nhạy với Meropenem đã tăng từ 13% đến 29% Trong năm 2008, sự không nhạy của Acinetobacter với các lớp khác

của kháng sinh được báo cáo: Aminoglycosides khoảng 20%; Ciprofloxacin 30%; Ceftazidime 70%; Cefotaxime 89%; Piperacillin/ Tazobactam 50% Ở Châu Âu, tỷ lệ

kháng kháng sinh của Acinetobacter được báo cáo cao nhất thuộc vùng Địa Trung Hải bao

gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ý và Nhật [1]

Tương tự ở Mỹ, dữ liệu nhiễm trùng bệnh viện xác định 65-75% bởi Acinetobacter

đa kháng thuốc, và không nhạy với Carbapenem tăng từ 9% trong năm 1995 lên 57% trong

năm 2008 Dữ liệu từ Ireland với Acinetobacter hơi bị giới hạn Một Đại học Y ở Ailen xác định 114 chủng Acinetobacter phân lập được từ các mẫu bệnh trong hơn 30 tháng từ năm

2005 đến năm 2007 Phương pháp tự động hóa xác định 77 chủng là A baumannii, tuy nhiên với phương pháp phân tử, các loài chiếm ưu thế thật sự A genomic species 3 11%

của 114 chủng phân lập được là kháng Carbapenem Tất cả các loài này mang gene carbapenemase (OXA-23) với đoạn xen vùng thượng nguồn promoter (ISAba1) [53]

Phương thức lan truyền

Sự lan truyền của Acinetobacter giữa các bệnh nhân là chủ yếu, và lan truyền giữa

bệnh nhân và nhân viên y tế hay qua việc cùng sử dụng các thiết bị y tế, lan truyền qua các

máy điều hòa và các quạt điện thông gió Sự lan rộng môi trường nhiễm Acinetobacter đã được xác định và đặc biệt các loài Acinetobacter có khả năng tồn tại thời gian dài trong môi

trường

Nhân tố nguy cơ cho sự định cư và nhiễm trùng bởi Acinetobacter spp bao gồm:

 Chăm sóc đặc biệt (Intensive care admission)

 Ở lâu trong bệnh viện (Prolonged hospital stay)

25

 Sử dụng thiết bị xâm lấn (Use of invasive devices)

 Dùng kháng sinh phổ rộng (Use of broad-spectrum antimicrobials) [53]

1.3.1.3 Các lưu ý về mặt lâm sàng

Viêm phổi liên quan thở máy (VAP) là nhiễm trùng phổ biến nhất bởi Acinetobacter

Ở vài quốc gia, tỷ lệ VAP bởi Acinetobacter xấp xỉ 5-10% Các loài Acinetobacter được xác

nhận là nguyên nhân của nhiễm trùng ở bệnh nhân với các vết bỏng, vết thương, vị trí mổ,

và được thừa nhận nhiều hơn gần đây là nguyên nhân nhiễm trùng các vết thương phức tạp

của quân nhân Các loài Acinetobacter là một tác nhân gây nhiễm trùng máu với tỷ lệ nhỏ ở Anh và ở Mỹ Tuy nhiên, các thông số tử vong ban đầu bởi nhiễm Acinetobacter dường như

khác biệt và được báo cáo từ 34-67% Thực chất tỷ lệ tử vong là hậu quả của phương pháp điều trị theo kinh nghiệm không phù hợp khi sự nhiễm trùng sau đó được xác định nguyên

nhân bởi Acinetobacter [53]

1.3.1.4 Thí nghiệm xác định

Các loài Acinetobacter phát triển tốt trên các môi trường nuôi cấy thường dùng Chúng thường được xác định đến chi với các đặc điểm như: cầu trực khuẩn Gram âm, catalase dương, oxidase âm, không lên men Xác định chính xác tên loài còn nhiều khó khăn Phương pháp Automated thường không thể phân biệt giữa 3 loài lâm sàng quan trọng Hơn nữa, các phương pháp kiểu hình để xác định cơ chế kháng thuốc thì không đáng tin cậy Do đó, phương pháp phân tử được sử dụng cho sự định loại, và cho việc dò ra các gene quyết định tính kháng thuốc [53]

b) Thay đổi tính thấm của màng ngoại (porin alterations)

c) Bơm ngược dòng thải loại kháng sinh (multi-drug efflux pumps)

d) Các enzyme thay đổi Aminoglycosides

e) Sự thay đổi các vị trí đích của Fluoroquinolone [53]

26

1.3.1.6 Đặc điểm phân bố

Acinetobacter sống ưu thế trong môi trường ẩm ướt Tồn tại trên da của 25% người

lớn khỏe mạnh Phân bố rộng trong môi trường tự nhiên và trong môi trường bệnh viện Tồn

tại đến 45% trong vùng mở khí quản

Bảng 1.3 Vùng định cư trên da người của Acinetobacter spp [4] [53]

Vị trí cơ thể Bệnh nhân trong bệnh

Thường trú trên da của 33% nhân viên y tế

Ở người bệnh:Vi khuẩn này thường được phân lập ở hầu và đường hô hấp

Môi trường bệnh viện: Bộ phận làm ẩm, trang bị của máy thở, thiết bị xâm lấn, thảm, nệm,

gối Acinetobacter có thể sống đến 25 ngày trong môi trường khô

1.3.1.7 Độc lực

Độc lực là mức độ của khả năng gây bệnh của vi sinh vật [5] Độc lực của A

baumannii ở mức độ tương đối thấp nhưng có tiềm năng về độc lực Một số các yếu tố độc

lực (virulence factors: VF) của Acinetobacter được biết đến bao gồm:

i/ Bề mặt tế bào kỵ nước và các enzyme: Acinetobacter spp được chứng minh rằng bề

mặt tế bào của chúng có tính kỵ nước, yếu tố quan trọng quyết định cho sự bám dính của vi

27

khuẩn Để gây ra nhiễm trùng thì vi khuẩn phải bám dính vào tế bào chủ Đặc tính kỵ nước còn bảo vệ vi khuẩn khỏi sự thực bào Đặc tính kỵ nước còn mang lại khả năng bám dính vào bề mặt nhựa như catheter và bộ phận giả Đặc tính kỵ nước của các chủng vi khuẩn phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt: bề mặt nhăn hơn thì kỵ nước nhiều hơn và ngược lại Ở

Acinetobacter, sự hiện diện của các protein nhô lên trên bề mặt tế bào mang đến tính kỵ nước Bề mặt kỵ nước cũng còn phụ thuộc các yếu tố vị trí định cư, các thụ thể bề mặt tế bào, fimbriae, các thành phần tế bào khác và enzyme bề mặt tế bào thuận lợi cho sự bám dính của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ Ví dụ: sự hoạt động urease của Acinetobacter thúc đẩy sự định cư của vi khuẩn này trên dạ dày chuột Urease cũng giúp Acinetobacter spp

định cư và gây viêm dạ dày hypochlorhydric hoặc achlorhydric ở người Nang (slime) polysaccharide ở bề mặt tế bào vi khuẩn cũng mang lại tính kỵ nước cho vi khuẩn [32] ii/ Nang polysaccharide độc: Acinetobacter spp có tạo thành nang polysaccharide độc,

nang này thường được hình thành trong pha tăng trường Nang polysaccharide gây độc đối với bạch cầu trung tính, hạn chế sự di chuyển cũng như hạn chế sự thực bào của bạch cầu nhưng không phá vỡ hệ thống miễn dịch

iii) Verotoxins: Acinetobacter (A haemolyticus) sản xuất verotoxins lần đầu tiên được báo cáo bởi Grotiuz et al Verotoxins có liên quan với tiêu chảy ra máu và được sản xuất bởi nhiều vi khuẩn đường ruột như E.coli và Shigella dysenteriae Độc tố này thuộc về một

phân họ protein đặc biệt, ARN N –glycosidases, ức chế tổng hợp protein Sự xuất hiện của chủng A haemolyticus sản xuất verotoxins gây ra sự lo ngại cho khả năng biến đổi cao của

Acinetobacter thì được gọi là acinetobactins [32]

v) Protein màng ngoài (Outer membrane proteins :OMPs): Protein màng ngoài ở một

số vi khuẩn Gram âm là cần thiết trong sinh bệnh học và thích nghi trong tế bào chủ cũng như tính kháng kháng sinh Vài OMPs trong họ OmpA được mô tả ở các chủng

Acinetobacter khác nhau Sự tương đồng về trình tự genome của OmpA ở A

radioresistens, A baumannii và A junii được báo cáo bởi Vila et al Protein OmpA gây

28

apoptosis ở tế bào biểu mô, kích thích gastrin và biểu hiện gene interleukin B Các tế bào

của Acinetobacter spp được bao quanh bởi OmpA, một loại protein giết chết tế bào chủ

Trong quá trình nhiễm trùng, OmpA liên kết với tế bào chủ và được chuyển vào bên trong nhân tế bào, nơi chúng gây ra sự chết tế bào [32]

1.3.1.8 Các nhiễm trùng chính liên quan Acinetobacter

- Viêm phổi đặc biệt trên bệnh nhân đặt nội khí quản, thở máy

Theo CDC, A baumannii gây ra 80% t ổng trường hợp nhiễm Acinetobacter

1.3 2.1 Vị trí phân loại khoa học

Acinetobacter baumannii được phân lập lần đầu tiên vào năm 1911 từ mẫu đất bởi

MW Beijerink (Kuo et al., 2004) với cái tên là Micrococcus calco-aceticus Từ đó nó cũng được đổi tên vài lần và được biết đến cái tên Acinetobacter vào những năm 1950

Acinetobacter spp trước tiên được nghĩ là loại vi khuẩn không độc hại (non-virulent saprophytes) (Bergogene-Berezin & Towner, 1996) Năm 1986, Acinetobacter baumannii được phân loại (Bouvet et al., 1986) A baumannii kháng Carbapenem (CRAB) lần đầu

tiên được phân lập 1991 (Kuo et al., 2004)

Năm 1986 A baumannii được phân loại khoa học (Bouvet et al., 1986) Acinetobacter được nhóm thành 3 phức hợp chính: Acinetobacter calcoacetycus-baumannii, với đặc tính

oxi hóa glucose, không tan huyết; Acinetobacter lwoffii, đặc tính không dùng glucose,

không tan huyết; Acinetobacter haemolyticus, với đặc tính làm tan huyết (Euzeby, 2008):

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Loài: A baumannii, A baylyi, A beijerinckii, A bouvetii, A calcoaceticus, gerneri, A

grimontii, A gyllenbergii, A haemolyticus, A johnsonnii, A junnii, A lwoffii, A parvus, A radioresisten, A schindleri, A soli, A tandoii, A tjernbergiae, A towneri A ursingii, A venetianus, 14 loài chưa biết tên [43]

1.3.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa

a/ Hình thái

A baumannii là vi khuẩn hiếu khí Gram âm, đa hình (cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn),

rất dễ nhầm lẫn với các vi khuẩn giống Neisseria Trên phết nhuộm Gram trực tiếp từ mẫu

bệnh phẩm, A baumannii là những song cầu nhỏ, kích thước 1,0x0,7 µm Khi nhuộm Gram

từ khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch hoặc từ canh cấy môi trường lỏng, tế bào vi khuẩn

có dạng cầu trực khuẩn rõ hơn và lớn hơn

Khuẩn lạc A baumannii phát triển trên môi trường Trypticase soy agar có dạng tròn,

lồi, nhẵn và hơi mờ đục có đường kính 1,5-2,0 mm nuôi cấy sau 24 giờ ở 370

C Trên môi trường thạch máu, các khuẩn lạc có kích thước 0,5-2 mm, màu sáng đều đến đục, lồi và nguyên vẹn, đặc biệt loài A baumannii không bao giờ tạo sắc tố là yếu tố giúp phân biệt với

một số vi khuẩn không lên men khác Phần lớn các dòng Acinetobacter mọc tốt trên môi

trường MacConkey, cho khuẩn lạc màu hồng nhạt [2] [43]

Hình 1.3 Khuẩn lạc A baumannii trên môi trường

thạch Chocolate và thạch máu

30

Bảng 1.4 Một vài đặc tính phổ biến của các loài Acinetobacter [55]

A

calco- aceticus

A

bauma- nnii

A

haemo- lyticus

A

junii

A

john- sonii

A

lwoff- lii

b/ Đặc điểm sinh hóa

Bảng 1.5 Một số thử nghiệm sinh hóa của A baumannii [43]

1.3.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii

A baumannii trở nên đề kháng với hầu hết kháng sinh thường được dùng, bao gồm Aminoglycosides, Quinolones và β-lactams phổ rộng và các chủng đa kháng hay toàn kháng đang trở thành một vấn đề được quan tâm trong lâm sàng [37]

31

Bảng 1.6 Cơ chế kháng kháng sinh ở Acinetobacter baumannii [37]

cephalosporinase trên nhiễm sắc thể

Enzyme lớp D lactamase phân giải Carbapenem

Nhóm OXA-23 Nhóm OXA-24/40 Nhóm OXA-58 Nhóm OXA-143 Metallo-β-

lactamase

VIM SIM-1 NDM Β-lactamase minor

relevance

Lớp A

Lớp D

TEM SHV SCO-1 CARB PER VER CTX-M GES KPC OXA-2, 10, 20, 37

Giảm tính thấm của màng

CarO

47 kDa OMP

44 kDa OMP

37 kDA OMP 33-36 kDa OMP

32

22-33 kDA OMP HMP-AB

MATE SMR

AdeABC AdeIJK AdeFGH AbeM AbeS

MFS

MATE SMR

AdeABC AdeIJK AdeFGH CmlA CraA AbeM AbeS

TetB

33

1.4 Sơ lược tình hình nghiên cứu sự kháng kháng sinh của Acinetobacter trên

thế giới và trong nước

1.4 1 Trên thế giới

Từ tháng 4/2007- 4/2008, Federico Perez và cộng sự với đề tài: ”Acinetobacter

baumannii và Klebsiella pneumonia kháng Carbapenem qua một hệ thống bệnh viện: tác động của các cơ sở chăm sóc đặc biệt với sự lan rộng vi khuẩn này”, tại 6 bệnh viện bang Ohio (Mỹ), kết quả: trong 39 chủng A baumannii phân lập được, hai kiểu gene chiếm ưu

thế liên quan đến dòng Châu Âu số II được tìm thấy 18 chủng chứa blaOXA-23 và 4 chủng có blaOXA-24/40 Trong số 29 chủng K pneumonia với sự nhạy cảm với Carbapenem giảm, 2

kiểu gene riêng biệt chứa blaKPC-2 hoăc blaKPC-3 được tìm thấy Những bệnh nhân nhiễm A

baumannii và K pneumoniae kháng Carbapenem thì lớn tuổi, mang đồng thời nhiều bệnh, thường vào và ra các cơ sở chăm sóc đặc biệt và thời gian ở bệnh viện dài (trên 25 ngày) với

tỷ lệ tử vong cao (trên 35%) [29]

Từ 7/2007-6/2009, Paviz Vahdani và CS tại bệnh viện Loghman Hakim, với đề tài: “Sự nhiễm Acinetobacter baumannii đa kháng kháng sinh trong một bệnh viện 400 giường tại

Tehran, Iran”, kết quả: Acinetobacter được phân lập phổ biến từ các mẫu bệnh phẩm thuộc

cơ quan hô hấp Vi khuẩn này kháng với Ceftazidime (96%), Ceftizoxime (95%), Ceftriaxone (93%), Amikacin (58%), Gentamicin (68%), Co-terimoxazole (85%) và Ciprofloxacin (85%) Tỷ lệ Acinetobacter kháng Imipenem thấp nhất (9%) [49]

Năm 2011, Pfeifer Y, Wilharm G, Zander E, Wichelhaus TA, Göttig S, Hunfeld

KP, Seifert H, Witte W, Higgins PG, với đề tài: “Đặc tính phân tử của blaNDM-1 trong 1

chủng Acinetobacter baumannii phân lập ở Đức năm 2007”, kết quả: A baumannii đa

kháng phân lập được mang gene β-lactamase blaNDM-1 và blaOXA-64, nhưng ngoài ra đoạn xen

34

ISAba1 thường nằm ở vùng thượng nguồn Sự chuyển giao khả năng kháng Carbapenem

bằng tiếp hợp và biến nạp không thành công Sự lai của ADN plasmid phân tách với mẫu

dò blaNDM không thành công Clon hóa toàn bộ ADN genome và phân tích trình tự cho thấy blaNDM-1 nằm giữa 2 yếu tố xen của ISAba125 [62]

Năm 2012, Pawel Nowak, Paulina Paluchowska, Alicja Budak, với đề tài: “Sự phân

bố của các gene blaOXA giữa các chủng Acinetobacter baumannii kháng Carbapenem ở bệnh

viện Phần Lan”, kết quả: Nghiên cứu bao gồm 104 chủng A baumannii kháng Carbapenem

đã phân lập, gồm những bệnh nhân trong ICU và BTU thuộc khu đặc biệt trong bệnh viện ở Krakow Multiplex PCR được dùng để tìm ra gene mã hóa cho enzyme Carbapenemase OXA được chọn Phân tích PCR thể hiện sự hiện diện của nhóm gene blaOXA-51và ISAba1 trong tất cả các chủng phân lập 46 chủng mang nhóm gene blaOXA-51và blaOXA-

23 trong khi 48 chủng mang nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-40 3 chủng phân lập mang nhóm gene blaOXA-51, blaOXA-23 và blaOXA-40 7 chủng mã hóa OXA-51

Carbapenemase nhưng không có enzyme thuộc vào các họ khác được kiểm tra So sánh các

chủng phân lập ở ICU và BTU biểu hiện sự trội hơn của nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-40 ở ICU trong khi nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-23 ở BTU [50]

1.4 2 Trong nước

Từ tháng 8/2005 đến tháng 8/2007, Cao Minh Nga, Nguyễn Thanh Bảo, Vũ T Kim

Cương, với đề tài: “Nhiễm khuẩn do Acinetobacter và tính kháng thuốc”, kết quả: Phân lập được 355 chủng vi khuẩn Acinetobacter từ bệnh phẩm đàm, mủ-dịch, nước tiểu và máu Tỷ

lệ các loài Acinetobacter định danh được: A baumannii (94,37%), A haemolyticus (4,79%)

và A loffii (0,85%) Vi khuẩn Acinetobacter kháng đa kháng sinh nhưng đều ở mức dưới 35% và tỷ lệ kháng thấp nhất với Imipenem (17,73%) Mức độ kháng thuốc của A

baumannii cao hơn A haemolyticus và A loffii Mức độ kháng Imipenem tăng dần theo thời

gian (năm) [12]

Từ 1/2008 – 6/2008, Cao Xuân Minh, Cao Xuân Thục, Trần Văn Ngọc, Phạm Hùng Vân, với đề tài: ”Đặc điểm lâm sàng và mối liên quan giữa kiểu gen và tính kháng thuốc của

vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong viêm phổi bệnh viện tại bệnh viện Chợ Rẫy” Kết

quả: Với 143 bệnh nhân được chẩn đoán viêm phổi bệnh viện do vi trùng A baumannii,

nghiên cứu cho thấy mức độ đa kháng thuốc của vi khuẩn này chiếm tỉ lệ cao (83%) A

35

baumannii gần như kháng thuốc hoàn toàn (>80%) với các kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporine III và Ciprofloxacine; mức độ kháng thuốc cao (>50%) và gia tăng qua các năm với các kháng sinh nhóm Levofloxacine và Carbapenem Bằng kĩ thuật khuếch đại phân đoạn ngẫu nhiên ADN (RAPD – PCR) với sự trợ giúp của phần mềm toán sinh học

(UPGMA) đã xác định có 7 nhóm kiểu gene của vi khuẩn A baumannii với mức độ kháng

thuốc khác nhau tại bệnh viện Chợ Rẫy [11]

Từ 5/2008 đến 11/2009, Phạm Hùng Vân và nhóm nghiên cứu MIDAS, với đề tài:

“Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn Gram [-] dễ mọc, kết quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam”, một trong những kết quả thu

được: Có 47,3% Acinetobacter baumanii kháng Meropenem, 51,1% kháng Imipenem trong

số đó có 7,5% là nhạy cảm và nhạy vừa với Meropenem Chỉ có 11,1% Burkholderia

cepacia kháng Meropenem, nhưng có đến 48.9% kháng Imipenem và trong số đó có 72,7%

và 4,5% là nhạy vừa với Meropenem [18]

Năm 2011, Lại Văn Hoàn, với đề tài: ”Đánh giá thực trạng nhiễm trùng bệnh viện tại trung tâm chống độc- bệnh viện Bạch Mai”, một trong những kết quả đạt được: Vi khuẩn Gram âm chiếm 84,2 % trong đó: A baumannii 31,7%, P aeruginosa 18,7%, K

pneumoniae 14,2%, E coli 6,1% Vi khu ẩn gây viêm phổi bệnh viện cao nhất là A

baumannii 36,0% Vi khu ẩn gây nhiễm trùng ống thông hay gặp nhất là A baumannii 47,1% A baumannii còn nhạy cảm 100% với Colistin, Minocyclin 88,3% [8]

Năm 2011, Võ Thị Ngọc Điệp, với đề tài: ”Sự hiện diện của các vi khuẩn Gram âm mang gene bla NDM-1 phân lập tại bệnh viện Nguyễn Đình Chiểu năm 2011”, một trong

những kết quả quan trọng là: trong 1727 mẫu bệnh phẩm phân lập được 55,81% là vi khuẩn Gram (-), trong đó Acinetobacter spp chiếm 14,95% Nghiên cứu phát hiện 4 chủng

Acinetobacter mang gene bla NDM-1 và sự hiện diện đồng thời các gene ESBL spectrum beta-lactamase) (TEM(1 chủng), VER(3 chủng)) Và kết quả nghiên cứu cho thấy

(Extended-sự khác biệt với ghi nhận thế giới: A baumannii đã kháng với Colistin và Aztreonam 100%

[7]

Từ 06/2011 đến 04/2012, Phạm Văn Dũng, Nguyễn Sĩ Tuấn và Hứa Mỹ Ngọc, với

đề tài: “Khảo sát kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn gây bệnh tại bệnh viện đa khoa

Thống Nhất Đồng Nai từ 06/2011 đến 04/2012”, kết quả nghiên cứu khẳng định: “Có tới 67,97% chủng Acinetobacter baumannii kháng hết các loại kháng sinh (trừ Colistin)” [6]

36

37

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2013 đến 06/2013 tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng

Dân số mục tiêu: Tất cả các mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh

phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

Dân số chọn mẫu: Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng

bệnh viện theo tiêu chuẩn CDC (Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo CDC [20] [65] (Phụ lục 1)) được mang đến và được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh

2.2.2 Cỡ mẫu

Tất cả các chủng Acinetobacter được phân lập trên các bệnh phẩm: Đàm, mủ, máu,

dịch não tủy, nước tiểu của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu

- D ụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, tâm bông vô trùng, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp,

pipette Pasteur, thước kẹp Sylvac dùng đo đường kính vòng vô khuẩn (serial N0

211047,

Thụy Sĩ), pipetman (Gilson), khay và lượt dùng đổ gel,…

- Thi ết bị

+ Thi ết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn

* Kính hiển vi dùng để soi: Leitz Biomed, kiểu loại 020-501-010, Đức;

* Kính hiển vi soi và chụp hình: Olympus CX41, U-CTR 30-2, 3K04189

* Tủ an toàn sinh học

* Tủ ấm 370C Memmert, Model: 600, Đức

* Tủ ấm 420C Napco, Mỹ

38

* Máy li tâm bàn EBA III (6tube), kiểu loại 2009, Đức

* Máy vortex Heidolph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức

* Máy đo độ đục Densi-La-Metr II, kiểu loại: Densi-2, sản phẩm từ EU

* Tủ đông sâu giữ chủng Gram -200

C, Nhật

* Tủ lạnh bảo quản kháng sinh, môi trường, test định danh API: Tủ Jean (100l), Hàn

Quốc

+ Thi ết bị dùng trong tách ADN và PCR

* Tủ an toàn sinh học cấp 2: nhãn hiệu EHRET, mã hiệu sản xuất: AuRA- U-130, Đức

* Tủ an toàn sinh học: nhãn hiệu Nuaire, mã hiệu sản xuất: NU 427-400E, Mỹ

* Máy li tâm lạnh Hermle, Đức

* Buồng thao tác PCR (PCR UV sterilization), hãng sản xuất: Scien- Plas

* Máy PCR 2720 Thermal Cycler, hãng sản xuất ABI

* Microwave, SanYo, mã hiệu EM –S2086W

* Máy điện di GelMate 2000, hãng sản xuất To Yo Ro, mã hiệu J005956

* Máy chụp gel Sygene, Mỹ

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và hóa chất

+ Môi trường: Thạch máu CO(Bio-rad) +5% máu cừu, thạch chocolate CA (CO +5% máu

cứu được chưng cách thủy đến màu nâu đất), BCP (Bio-rad), chai cấy máu (Cty Nam Khoa,

Việt Nam), MH (Liofilchem, Ý), LB (BD, Mỹ), TSA (Merck, Đức), BHI (BD, Mỹ)

+ Hóa chất:

*Hóa chất cho định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ: Nước muối sinh lý (0,85%); dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch safranin; dầu soi cédre; thuốc thử oxidase của BioMerieux (Pháp); H2O2; khoanh giấy kháng sinh của BioRad; API 20E của BioMerieux (Pháp)

*Hóa chất cho tách chiết ADN, PCR, điện di:

◦ Nước sinh học phân tử (DNase free, RNase free), hãng sản xuất Qiagen;

◦ Kit tách DNA của Qiagen

◦ Toptaq Master mix 2x, nước không có RNase, hãng sản xuất Qiagen;

◦ Agarose Nuseive, hãng sản xuất Lonza;

◦ TBE 10x (Tris- Borate- EDTA buffer), hãng sản xuất Sigma, Mỹ;