L ỜI CẢM ƠN
5. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài
2.2. Đối tượng nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng
Dân số mục tiêu: Tất cả các mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
Dân số chọn mẫu: Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo tiêu chuẩn CDC (Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo CDC [20] [65] (Phụ lục 1)) được mang đến và được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
2.2.2. Cỡ mẫu
Tất cả các chủng Acinetobacter được phân lập trên các bệnh phẩm: Đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu 2.3.1. Vật liệu
- Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, tâm bông vô trùng, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp, pipette Pasteur, thước kẹp Sylvac dùng đo đường kính vòng vô khuẩn (serial N0
211047, Thụy Sĩ), pipetman (Gilson), khay và lượt dùng đổ gel,…
- Thiết bị
+ Thiết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn
* Kính hiển vi dùng để soi: Leitz Biomed, kiểu loại 020-501-010, Đức; Olympus CH20, kiểu loại CH20bIMF200, Nhật * Kính hiển vi soi và chụp hình: Olympus CX41, U-CTR 30-2, 3K04189. * Tủ an toàn sinh học
* Tủ ấm 370C Memmert, Model: 600, Đức * Tủ ấm 420C Napco, Mỹ
38
* Máy li tâm bàn EBA III (6tube), kiểu loại 2009, Đức * Máy vortex Heidolph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức
* Máy đo độ đục Densi-La-Metr II, kiểu loại: Densi-2, sản phẩm từ EU * Tủ đông sâu giữ chủng Gram -200
C, Nhật
* Tủ lạnh bảo quản kháng sinh, môi trường, test định danh API: Tủ Jean (100l), Hàn Quốc.
+ Thiết bị dùng trong tách ADN và PCR
* Tủ an toàn sinh học cấp 2: nhãn hiệu EHRET, mã hiệu sản xuất: AuRA- U-130, Đức * Tủ an toàn sinh học: nhãn hiệu Nuaire, mã hiệu sản xuất: NU 427-400E, Mỹ
* Máy li tâm lạnh Hermle, Đức
* Buồng thao tác PCR (PCR UV sterilization), hãng sản xuất: Scien- Plas * Máy PCR 2720 Thermal Cycler, hãng sản xuất ABI
* Microwave, SanYo, mã hiệu EM –S2086W.
* Máy điện di GelMate 2000, hãng sản xuất To Yo Ro, mã hiệu J005956 * Máy chụp gel Sygene, Mỹ.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và hóa chất
+ Môi trường: Thạch máu CO(Bio-rad) +5% máu cừu, thạch chocolate CA (CO +5% máu cứu được chưng cách thủy đến màu nâu đất), BCP (Bio-rad), chai cấy máu (Cty Nam Khoa, Việt Nam), MH (Liofilchem, Ý), LB (BD, Mỹ), TSA (Merck, Đức), BHI (BD, Mỹ).
+ Hóa chất:
*Hóa chất cho định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ: Nước muối sinh lý (0,85%); dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch safranin; dầu soi cédre; thuốc thử oxidase của BioMerieux (Pháp); H2O2; khoanh giấy kháng sinh của BioRad; API 20E của BioMerieux (Pháp).
*Hóa chất cho tách chiết ADN, PCR, điện di:
◦ Nước sinh học phân tử (DNase free, RNase free), hãng sản xuất Qiagen;
◦ Kit tách DNA của Qiagen
◦ Toptaq Master mix 2x, nước không có RNase, hãng sản xuất Qiagen;
◦ Agarose Nuseive, hãng sản xuất Lonza;
39
◦ TE 1x (Tris- EDTA), hãng sản xuất Sigma, Mỹ;
◦ Loading dye 10x (Bromothymol Blue), hãng sản xuất Qiagen;
◦ Ethidiume Bromide, hãng Invitrogen, nồng độ 10mg/ml
2.3.2. Phương pháp thực hiện
Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh và thực hiện kháng sinh đồ theo quy trình của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007.
Mẫu bệnh phẩm
(Đàm, mủ, máu, DNT, nước tiểu)
Phân lập, định danh tác nhân Acinetobacter theo quy trình của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007 Thử nghiệm kháng sinh đồ Bảo quản chủng ở -200 C Đọc và phân tích kết quả
kháng sinh đồ theo tiêu chuẩn CLSI 2012
PP đĩa đôi: IMP- EDTAđể sàng lọc nhanh các chủng có khả năng sản xuất enzyme thuộc lớp B metallo-β-lactamase PCR phát hiện gene kháng kháng sinh Giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm: Proseq, DNA Club, Blast, Local Alignment,…-> chủng mang gene kháng kháng sinh.
40
2.3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm
a/ Bệnh phẩm đàm
- Dùng tâm bông hay pipette Pasteur lấy một ít đàm trãi đều thành một phết 2x3 cm trên 1 tấm lame, để khô tự nhiên, sau đó gắn nhẹ trên lửa và thực hiện nhuộm Gram. Đánh giá mẫu đàm đạt độ tin cậy để cấy theo thang điểm Barlett.
Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm
Tính chất đại/vi thể Điểm Mẫu đàm 10-25ạch cầu >25 bạch cầu Nhầy, mủ, mủ nhầy 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2
Mẫu đàm hút qua mũi, nội soi phế quản
10-25 bạch cầu >25 bạch cầu Tế bào trụ 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2 Thang điểm để đánh giá là cộng tất cả các điểm lại rồi đánh giá như sau: ≤ 0 Không tin cậy để cấy
1-2 Tin cậy vừa ≥ 3 Rất đáng tin cậy.
Tiến hành cấy khi mẫu được đánh giá hoàn toàn tin cậy. Riêng mẫu tin cậy vừa, có thể yêu cầu lấy mẫu lại hay cũng có thể tiến hành nuôi cấy nhưng phải cố lấy mầm cấy là vùng đàm mủ, tránh lấy nhớt hay nước bọt để nuôi cấy.
- Dùng tâm bông lấy đàm cấy vào ống thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm.
41
- Làm lỏng đàm bằng nước muối sinh lý theo tỷ lệ đàm/nước muối= 1/1. Dùng máy vortex trộn đều đàm và nước muối sinh lý. Lấy 10µl cấy 3 chiều trên thạch máu, ủ ở 35±20C/24h.
- Lấy 10µl mẫu bệnh phẩm đã pha loãng ½ ở trên để pha loãng vào ống nước muối sinh lý 10ml, vortex đều. Sau đó lấy 10µl cấy hình sao (cấy đếm) trên thạch chocolate, ủ trong bình nến 35±20
C/24h.
- Sau 24h, quan sát hình thái khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc ưu thế và xác định vi khuẩn gây bệnh.
b/ Bệnh phẩm mủ
- Bệnh phẩm được chuyển đến phòng xét nghiệm ở dạng tâm bông được phết đầy mủ của bệnh nhân hoặc 1 ống chứa mủ. Dùng tâm bông để lấy mủ phết lên lame và thực hiện nhuộm Gram, cấy vào BHI để tăng sinh vi khuẩn, phết lên thạch chocolate và thạch máu. Sau đó cấy 3 chiều để thu khuẩn lạc riêng rẻ. Cuối cùng cấy lên thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm. Ủ ở 35±20C/ 24h (riêng CA ủ trong bình nến).
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ.
c/ Bệnh phẩm máu
- Theo chỉ định của bác sĩ thì máu bệnh nhân được lấy và cấy trực tiếp vào chai cấy máu. Máu được cấy với tỷ lệ 1 phần máu/10 phần canh thang trong canh thang Trypticase soy có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu động vật khác và 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate, là chất chống tạo áo máu và làm giảm tác dụng của các chất ức chế vi khuẩn có trong máu bệnh nhân), ủ 35±20
C/24h. Khi có dấu hiệu dương tính trong chai cấy máu, ta tiến hành đồng thời:
+ Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ. +Cấy chuyển lên môi trường thạch máu và thạch chocolate, ủ ở điều kiện 35±20
C/24h.
d/ Bệnh phẩm dịch não tủy
- Dùng kim tiêm hoặc pipette nhựa vô trùng hút DNT cho vào BHI, nhỏ 2 giọt lên thạch máu và 2 giọt lên thạch chocolate, trong đó 1 giọt sẽ ria ra và 1 giọt để nguyên. Đến khi dung dịch trên mặt thạch đã khô đem ủ 35±20C/24h (ủ bình nến với CA). Cấy lên thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm. Nhỏ giọt dịch vào buồng đếm để đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu.
42
- DNT được ly tâm, lấy cặn cho lên 3 lame để nhuộm Gram, nhuộm mực Tàu và nhuộm Ziehl- Nelson.
- Sau 24h, khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch ở vị trí có ria và cả vị trí giọt dịch không ria thì khẳng định bệnh nhân bị nhiễm khuẩn. Quan sát hình thái vi khuẩn, tiến hành các test sinh hóa định danh và làm kháng sinh đồ.
e/ Bệnh phẩm nước tiểu
- Trộn đều nước tiểu rồi nhỏ một giọt trực tiếp lên lame 1 để soi tươi và nhỏ 1 giọt lên lame 2 chờ khô tự nhiên rồi nhuộm Grame. Nếu có ít nhất một tế bào vi khuẩn và/hay bạch cầu hiện diện trên 1 quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm trùng tiểu. Nếu toàn phết nhuộm không hay phát hiện được rất ít tế bào vi khuẩn hay bạch cầu, bệnh nhân chắc chắc không bị nhiễm trùng tiểu.
- Dùng vòng cấy định lượng 10µl, lấy đầy một vòng cấy nước tiểu, trãi toàn bộ lên bề mặt hộp thạch BCP, ủ 35±20 C/24h.
- Sau 24h ủ thạch, đọc kết bằng cách đếm số khúm trùng để biết số lượng vi khuẩn trong mầm cấy ban đầu, sau đó suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống (CFU) trong 1ml nước tiểu. Nếu có:
. ≤ 104 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng tiểu.
. ≥ 105 CFU/ml nước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu, định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
. 104 - ≤105 CFU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng tiểu. Trong trường hợp này, nếu bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng chắc chắn bị nhiễm trùng tiểu tái phát nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và làm kháng sinh đồ.
2.3.2.2. Định danh Acinetobacter
Tất cả các mẫu bệnh phẩm, sau khi cấy lên thạch, ủ 35±20 C/24h. Nếu có khuẩn lạc hình thành thì bước tiếp theo là định danh và làm kháng sinh đồ.
a/ Quan sát hình thái
Dựa vào kết quả nhuộm Gram ban đầu (Phụ lục 2)và hình thái khuẩn lạc mọc trên các đĩa môi trường nuôi cấy.
43
*Trên đĩa môi trường thạch máu: Các khuẩn lạc có kích thước 0,5-2 mm, màu sáng đều đến đục, lồi và nguyên vẹn, không sinh sắc tố, không gây tan huyết (trừ A.
haemolyticus)
*Trên môi trường chocolate: Khuẩn lạc A. baumannii có hình tròn, bờ đều, trắng đục và hơi lồi.
*Trên môi trường cấy máu: Khuẩn lạc A. baumannii có màu trắng đục, tròn, bờ đều. *Nhuộm Gram kiểm tra lại hình dạng vi khuẩn từ các khuẩn lạc đặc trưng phát triển trên môi trường. Hình thái A. baumannii trên phết nhuộm Gram có dạng cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn Gram âm.
b/ Thử nghiệm sinh hóa định danh Acinetobacter
Sau khi quan sát khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn được nhuộm Gram, nhận thấy hình dạng giống với Acinetobacter nên tiến hành các bước tiếp theo.
1* Thử nghiệm catalase
Mục đích: Phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
Cơ sở sinh hoá: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý
◦ H2O2 H2O + O2 (bọt khí)
Thực hiện: Lấy tube 10ml đã tiệt trùng, cho vào tube khoảng 2-4ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2 3% ), sử dung pipette Pasteur lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ, đặt dầu pipete có vi khuẩn vào H2O2. Quan sát sự sủi bọt sau 1-2 giây. Thử nghiệm được tiến hành đồng thời với khuẩn lạc của Staphylococcus aureusđể làm chứng dương.
Kết quả: Có hiện tượng sủi bọt: phản ứng dương tính (+). Không có hiện tượng sủi bọt: phản ứng âm tính (-).
Acinetobacter cho kết quả dương tính (+)
2* Thử nghiệm oxidase
Mục đích: Phát hiện VSV có hệ enzyme oxydase (hệ cytochrom C)
Cơ sở sinh hoá:
Cytochrom C khử + H+ + O2→ Cytochrom C ôxi hoá + H2O Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử → TMPD ôxi hoá (màu xanh)
Thuốc thử:TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
Thực hiện: Thuốc thử đã được tẩm sẵn trong thanh giấy lọc và được cung cấp bời Bio- Rad. Lấy pipette Pasteur gặt 1 khuẩn lạc nghi ngờ và quệt lên thanh giấy đã tẩm thuốc thử
44
oxidase. Thử nghiệm được tiến hành đồng thời với khuẩn lạc của Pseudomonas aeruginosa
để làm chứng dương. Đọc kết quả trong 30 giây đến 1 phút.
Kết quả: Phản ứng (+): vùng giấy được quệt vi khuẩn chuyển màu tím tía Phản ứng (-): vùng giấy được quệt vi khuẩn không đổi màu.
Acinetobacter cho kết quả âm tính (-).
3* Định danh Acinetobacter bằng API 20E
Mục đích: Xác định loài của Acinetobacter
Thực hiện: Lấy ống nước muối sinh lý khoảng 5ml, kiểm tra McFarland trước khi cho vi khuẩn vào. Dùng que cấy lấy 1 khuẩn lạc riêng rẻ từ đĩa môi nuôi cấy cho vào ống nước muối và tạo huyền dịch vi khuẩn đồng nhất.
Dùng pipette nhựa hút huyền dịch và nhỏ vào các giếng vừa đến cổ giếng. + Các giếng ADH, LDC, ODC, URE, H2S thì nhỏ thêm paraffin vào miệng giếng + Giếng CIT, VP, GEL thì nhỏ đến miệng giếng.
Thử nghiệm được tiến hành đồng thời với chủng E. coliATCC 25922 để kiểm tra API.
Kết quả: Đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất, kết hợp phần mềm API Web (để đọc kết quả API) do nhà sản xuất cung cấp và các thử nghiệm bổ sung (Phụ lục 3)
2.3.2.3. Giữ chủng
Sau khi định danh được đến loài, môi trường LB (20% glycerol) được dùng để giữ chủng, tube giữ chủng được bảo quản ở tủ -200
C. Chủng được lưu giữ để tiến hành các nghiên cứu tiếp sau.
Hình 2.2. Các chủng A. baumannii
được giữ trong tủ -200C Hình 2.1. API 20E của Biomeieux (Pháp)
45
2.3.2.4. Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer
Mục đích: Nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân. Đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.
Nguyên lý:Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueller-Hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
Thực hiện
* Các kháng sinh thử nghiệm: Lựa chọn kháng sinh theo tiêu chuẩn của CLSI: AM, AMC, AN, ATM, CAZ, CIP, CN, CS, FT, IPM, MEC, GMN, NET, MEM, PIP, SXT, TCC, TE. Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh.
* Đĩa thạch MH lấy ra từ tủ lạnh (4-80C) được ủ 10 phút trong tủ ấm 420C.
- Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn có độ đục 0,5 McFarland: Dùng que cấy lấy khoảng 2 khuẩn lạc cho vào ống nước muối sinh lý 2ml, vortex, đo độ đục McFaland bằng máy đo độ đục. Điều chỉnh cho đến khi độ đục vi khuẩn đạt 0,5 McFaland.
- Pha loãng 100 lần huyền dịch trên để được huyền dịch nồng độ 106
CFU /ml. Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường BHI (canh thang não tim). Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.
- Láng vi khuẩn lên đĩa thạch: Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 106
CFU/ml dịch pha loãng (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton. Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi. Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
- Đặt khoanh giấy kháng sinh: Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch, sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus) để phân phối kháng sinh lên đĩa thạch. Sau đó dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất giữ, bảo đảm vô trùng.
46
Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch. Lật ngược các đĩa thạch và ủ ở 35±20C/24h.
- Đọc và phân tích kết quả: Sau khi ủ lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước kẹp đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp). So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn theo tiêu