L ỜI CẢM ƠN
5. Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài
1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu sự kháng kháng sinh của Acinetobacter trên thế
thế giới và trong nước 1.4.1. Trên thế giới
Từ tháng 4/2007- 4/2008, Federico Perez và cộng sự với đề tài: ”Acinetobacter
baumannii và Klebsiella pneumonia kháng Carbapenem qua một hệ thống bệnh viện: tác
động của các cơ sở chăm sóc đặc biệt với sự lan rộng vi khuẩn này”, tại 6 bệnh viện bang Ohio (Mỹ), kết quả: trong 39 chủng A. baumannii phân lập được, hai kiểu gene chiếm ưu thế liên quan đến dòng Châu Âu số II được tìm thấy. 18 chủng chứa blaOXA-23 và 4 chủng có blaOXA-24/40. Trong số 29 chủng K. pneumonia với sự nhạy cảm với Carbapenem giảm, 2 kiểu gene riêng biệt chứa blaKPC-2 hoăc blaKPC-3 được tìm thấy. Những bệnh nhân nhiễm A.
baumannii và K. pneumoniae kháng Carbapenem thì lớn tuổi, mang đồng thời nhiều bệnh,
thường vào và ra các cơ sở chăm sóc đặc biệt và thời gian ở bệnh viện dài (trên 25 ngày) với tỷ lệ tử vong cao (trên 35%) [29].
Từ 7/2007-6/2009, Paviz Vahdani và CS tại bệnh viện Loghman Hakim, với đề tài: “Sự
nhiễm Acinetobacter baumannii đa kháng kháng sinh trong một bệnh viện 400 giường tại
Tehran, Iran”, kết quả: Acinetobacter được phân lập phổ biến từ các mẫu bệnh phẩm thuộc cơ quan hô hấp. Vi khuẩn này kháng với Ceftazidime (96%), Ceftizoxime (95%), Ceftriaxone (93%), Amikacin (58%), Gentamicin (68%), Co-terimoxazole (85%) và Ciprofloxacin (85%). Tỷ lệ Acinetobacter kháng Imipenem thấp nhất (9%) [49].
Năm 2011, Pfeifer Y, Wilharm G, Zander E, Wichelhaus TA, Göttig S, Hunfeld KP, Seifert H, Witte W, Higgins PG, với đề tài: “Đặc tính phân tử của blaNDM-1 trong 1 chủng Acinetobacter baumannii phân lập ở Đức năm 2007”, kết quả: A. baumannii đa kháng phân lập được mang gene β-lactamase blaNDM-1 và blaOXA-64, nhưng ngoài ra đoạn xen
34
ISAba1 thường nằm ở vùng thượng nguồn. Sự chuyển giao khả năng kháng Carbapenem bằng tiếp hợp và biến nạp không thành công. Sự lai của ADN plasmid phân tách với mẫu dò blaNDM không thành công. Clon hóa toàn bộ ADN genome và phân tích trình tự cho thấy blaNDM-1 nằm giữa 2 yếu tố xen của ISAba125 [62].
Năm 2012, Pawel Nowak, Paulina Paluchowska, Alicja Budak, với đề tài: “Sự phân bố của các gene blaOXA giữa các chủng Acinetobacter baumannii kháng Carbapenem ở bệnh viện Phần Lan”, kết quả: Nghiên cứu bao gồm 104 chủng A. baumannii kháng Carbapenem đã phân lập, gồm những bệnh nhân trong ICU và BTU thuộc khu đặc biệt trong bệnh viện ở Krakow. Multiplex PCR được dùng để tìm ra gene mã hóa cho enzyme Carbapenemase OXA được chọn. Phân tích PCR thể hiện sự hiện diện của nhóm gene blaOXA-51và ISAba1 trong tất cả các chủng phân lập. 46 chủng mang nhóm gene blaOXA-51và blaOXA- 23 trong khi 48 chủng mang nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-40. 3 chủng phân lập mang nhóm gene blaOXA-51, blaOXA-23 và blaOXA-40. 7 chủng mã hóa OXA-51 Carbapenemase nhưng không có enzyme thuộc vào các họ khác được kiểm tra. So sánh các chủng phân lập ở ICU và BTU biểu hiện sự trội hơn của nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-40 ở ICU trong khi nhóm gene blaOXA-51 và blaOXA-23 ở BTU [50].
1.4.2. Trong nước
Từ tháng 8/2005 đến tháng 8/2007, Cao Minh Nga,Nguyễn Thanh Bảo, Vũ T. Kim Cương, với đề tài: “Nhiễm khuẩn do Acinetobacter và tính kháng thuốc”, kết quả: Phân lập được 355 chủng vi khuẩn Acinetobacter từ bệnh phẩm đàm, mủ-dịch, nước tiểu và máu. Tỷ lệ các loài Acinetobacterđịnh danh được: A. baumannii (94,37%), A. haemolyticus (4,79%)
và A. loffii (0,85%). Vi khuẩn Acinetobacter kháng đa kháng sinh nhưng đều ở mức dưới
35% và tỷ lệ kháng thấp nhất với Imipenem (17,73%). Mức độ kháng thuốc của A.
baumanniicao hơn A. haemolyticus và A. loffii. Mức độ kháng Imipenem tăng dần theo thời
gian (năm) [12].
Từ 1/2008 – 6/2008, Cao Xuân Minh, Cao Xuân Thục, Trần Văn Ngọc, Phạm Hùng Vân, với đề tài: ”Đặc điểm lâm sàng và mối liên quan giữa kiểu gen và tính kháng thuốc của vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong viêm phổi bệnh viện tại bệnh viện Chợ Rẫy”. Kết quả: Với 143 bệnh nhân được chẩn đoán viêm phổi bệnh viện do vi trùng A. baumannii, nghiên cứu cho thấy mức độ đa kháng thuốc của vi khuẩn này chiếm tỉ lệ cao (83%). A.
35
baumannii gần như kháng thuốc hoàn toàn (>80%) với các kháng sinh thuộc nhóm
Cephalosporine III và Ciprofloxacine; mức độ kháng thuốc cao (>50%) và gia tăng qua các năm với các kháng sinh nhóm Levofloxacine và Carbapenem. Bằng kĩ thuật khuếch đại phân đoạn ngẫu nhiên ADN (RAPD – PCR) với sự trợ giúp của phần mềm toán sinh học (UPGMA) đã xác định có 7 nhóm kiểu gene của vi khuẩn A. baumannii với mức độ kháng thuốc khác nhau tại bệnh viện Chợ Rẫy [11].
Từ 5/2008 đến 11/2009, Phạm Hùng Vân và nhóm nghiên cứu MIDAS, với đề tài: “Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn Gram [-] dễ mọc, kết quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam”, một trong những kết quả thu được: Có 47,3% Acinetobacter baumanii kháng Meropenem, 51,1% kháng Imipenem trong số đó có 7,5% là nhạy cảm và nhạy vừa với Meropenem. Chỉ có 11,1% Burkholderia
cepacia kháng Meropenem, nhưng có đến 48.9% kháng Imipenem và trong số đó có 72,7%
và 4,5% là nhạy vừa với Meropenem [18].
Năm 2011, Lại Văn Hoàn, với đề tài: ”Đánh giá thực trạng nhiễm trùng bệnh viện tại trung tâm chống độc- bệnh viện Bạch Mai”, một trong những kết quả đạt được: Vi khuẩn Gram âm chiếm 84,2 % trong đó: A. baumannii 31,7%, P. aeruginosa 18,7%, K.
pneumoniae 14,2%, E. coli 6,1%. Vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện cao nhất là A.
baumannii 36,0%. Vi khuẩn gây nhiễm trùng ống thông hay gặp nhất là A. baumannii
47,1%. A. baumannii còn nhạy cảm 100% với Colistin, Minocyclin 88,3% [8].
Năm 2011, Võ Thị Ngọc Điệp, với đề tài: ”Sự hiện diện của các vi khuẩn Gram âm mang gene bla NDM-1 phân lập tại bệnh viện Nguyễn Đình Chiểu năm 2011”, một trong những kết quả quan trọng là: trong 1727 mẫu bệnh phẩm phân lập được 55,81% là vi khuẩn Gram (-), trong đó Acinetobacter spp. chiếm 14,95%. Nghiên cứu phát hiện 4 chủng
Acinetobacter mang gene bla NDM-1 và sự hiện diện đồng thời các gene ESBL (Extended-
spectrum beta-lactamase) (TEM(1 chủng), VER(3 chủng)). Và kết quả nghiên cứu cho thấy sự khác biệt với ghi nhận thế giới: A. baumanniiđã kháng với Colistin và Aztreonam 100% [7].
Từ 06/2011 đến 04/2012, Phạm Văn Dũng, Nguyễn Sĩ Tuấn và Hứa Mỹ Ngọc, với đề tài: “Khảo sát kháng kháng sinh của các dòng vi khuẩn gây bệnh tại bệnh viện đa khoa Thống Nhất Đồng Nai từ 06/2011 đến 04/2012”, kết quả nghiên cứu khẳng định: “Có tới 67,97% chủng Acinetobacter baumannii kháng hết các loại kháng sinh (trừ Colistin)” [6].
37
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2013 đến 06/2013 tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng 2.2.1. Đối tượng
Dân số mục tiêu: Tất cả các mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
Dân số chọn mẫu: Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo tiêu chuẩn CDC (Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện theo CDC [20] [65] (Phụ lục 1)) được mang đến và được xét nghiệm tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM, viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh.
2.2.2. Cỡ mẫu
Tất cả các chủng Acinetobacter được phân lập trên các bệnh phẩm: Đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu của bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm trùng bệnh viện.
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu 2.3.1. Vật liệu
- Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, tâm bông vô trùng, đèn cồn, que cấy, lame, lamelle, kẹp, pipette Pasteur, thước kẹp Sylvac dùng đo đường kính vòng vô khuẩn (serial N0
211047, Thụy Sĩ), pipetman (Gilson), khay và lượt dùng đổ gel,…
- Thiết bị
+ Thiết bị dùng trong phân lập, nuôi cấy, định danh vi khuẩn
* Kính hiển vi dùng để soi: Leitz Biomed, kiểu loại 020-501-010, Đức; Olympus CH20, kiểu loại CH20bIMF200, Nhật * Kính hiển vi soi và chụp hình: Olympus CX41, U-CTR 30-2, 3K04189. * Tủ an toàn sinh học
* Tủ ấm 370C Memmert, Model: 600, Đức * Tủ ấm 420C Napco, Mỹ
38
* Máy li tâm bàn EBA III (6tube), kiểu loại 2009, Đức * Máy vortex Heidolph, kiểu loại: Top-mix 94323, Đức
* Máy đo độ đục Densi-La-Metr II, kiểu loại: Densi-2, sản phẩm từ EU * Tủ đông sâu giữ chủng Gram -200
C, Nhật
* Tủ lạnh bảo quản kháng sinh, môi trường, test định danh API: Tủ Jean (100l), Hàn Quốc.
+ Thiết bị dùng trong tách ADN và PCR
* Tủ an toàn sinh học cấp 2: nhãn hiệu EHRET, mã hiệu sản xuất: AuRA- U-130, Đức * Tủ an toàn sinh học: nhãn hiệu Nuaire, mã hiệu sản xuất: NU 427-400E, Mỹ
* Máy li tâm lạnh Hermle, Đức
* Buồng thao tác PCR (PCR UV sterilization), hãng sản xuất: Scien- Plas * Máy PCR 2720 Thermal Cycler, hãng sản xuất ABI
* Microwave, SanYo, mã hiệu EM –S2086W.
* Máy điện di GelMate 2000, hãng sản xuất To Yo Ro, mã hiệu J005956 * Máy chụp gel Sygene, Mỹ.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn và hóa chất
+ Môi trường: Thạch máu CO(Bio-rad) +5% máu cừu, thạch chocolate CA (CO +5% máu cứu được chưng cách thủy đến màu nâu đất), BCP (Bio-rad), chai cấy máu (Cty Nam Khoa, Việt Nam), MH (Liofilchem, Ý), LB (BD, Mỹ), TSA (Merck, Đức), BHI (BD, Mỹ).
+ Hóa chất:
*Hóa chất cho định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ: Nước muối sinh lý (0,85%); dung dịch tím kết tinh (crystal violet); dung dịch lugol; cồn tuyệt đối; dung dịch safranin; dầu soi cédre; thuốc thử oxidase của BioMerieux (Pháp); H2O2; khoanh giấy kháng sinh của BioRad; API 20E của BioMerieux (Pháp).
*Hóa chất cho tách chiết ADN, PCR, điện di:
◦ Nước sinh học phân tử (DNase free, RNase free), hãng sản xuất Qiagen;
◦ Kit tách DNA của Qiagen
◦ Toptaq Master mix 2x, nước không có RNase, hãng sản xuất Qiagen;
◦ Agarose Nuseive, hãng sản xuất Lonza;
39
◦ TE 1x (Tris- EDTA), hãng sản xuất Sigma, Mỹ;
◦ Loading dye 10x (Bromothymol Blue), hãng sản xuất Qiagen;
◦ Ethidiume Bromide, hãng Invitrogen, nồng độ 10mg/ml
2.3.2. Phương pháp thực hiện
Phương pháp nuôi cấy, phân lập, định danh và thực hiện kháng sinh đồ theo quy trình của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007.
Mẫu bệnh phẩm
(Đàm, mủ, máu, DNT, nước tiểu)
Phân lập, định danh tác nhân Acinetobacter theo quy trình của viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh đạt chuẩn ISO 15189:2007 Thử nghiệm kháng sinh đồ Bảo quản chủng ở -200 C Đọc và phân tích kết quả
kháng sinh đồ theo tiêu chuẩn CLSI 2012
PP đĩa đôi: IMP- EDTAđể sàng lọc nhanh các chủng có khả năng sản xuất enzyme thuộc lớp B metallo-β-lactamase PCR phát hiện gene kháng kháng sinh Giải trình tự và phân tích kết quả bằng phần mềm: Proseq, DNA Club, Blast, Local Alignment,…-> chủng mang gene kháng kháng sinh.
40
2.3.2.1. Phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm
a/ Bệnh phẩm đàm
- Dùng tâm bông hay pipette Pasteur lấy một ít đàm trãi đều thành một phết 2x3 cm trên 1 tấm lame, để khô tự nhiên, sau đó gắn nhẹ trên lửa và thực hiện nhuộm Gram. Đánh giá mẫu đàm đạt độ tin cậy để cấy theo thang điểm Barlett.
Bảng 2.1. Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm
Tính chất đại/vi thể Điểm Mẫu đàm 10-25ạch cầu >25 bạch cầu Nhầy, mủ, mủ nhầy 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2
Mẫu đàm hút qua mũi, nội soi phế quản
10-25 bạch cầu >25 bạch cầu Tế bào trụ 10-25 tế bào vẩy >25 tế bào vẩy +1 +2 +1 -1 -2 Thang điểm để đánh giá là cộng tất cả các điểm lại rồi đánh giá như sau: ≤ 0 Không tin cậy để cấy
1-2 Tin cậy vừa ≥ 3 Rất đáng tin cậy.
Tiến hành cấy khi mẫu được đánh giá hoàn toàn tin cậy. Riêng mẫu tin cậy vừa, có thể yêu cầu lấy mẫu lại hay cũng có thể tiến hành nuôi cấy nhưng phải cố lấy mầm cấy là vùng đàm mủ, tránh lấy nhớt hay nước bọt để nuôi cấy.
- Dùng tâm bông lấy đàm cấy vào ống thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm.
41
- Làm lỏng đàm bằng nước muối sinh lý theo tỷ lệ đàm/nước muối= 1/1. Dùng máy vortex trộn đều đàm và nước muối sinh lý. Lấy 10µl cấy 3 chiều trên thạch máu, ủ ở 35±20C/24h.
- Lấy 10µl mẫu bệnh phẩm đã pha loãng ½ ở trên để pha loãng vào ống nước muối sinh lý 10ml, vortex đều. Sau đó lấy 10µl cấy hình sao (cấy đếm) trên thạch chocolate, ủ trong bình nến 35±20
C/24h.
- Sau 24h, quan sát hình thái khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc ưu thế và xác định vi khuẩn gây bệnh.
b/ Bệnh phẩm mủ
- Bệnh phẩm được chuyển đến phòng xét nghiệm ở dạng tâm bông được phết đầy mủ của bệnh nhân hoặc 1 ống chứa mủ. Dùng tâm bông để lấy mủ phết lên lame và thực hiện nhuộm Gram, cấy vào BHI để tăng sinh vi khuẩn, phết lên thạch chocolate và thạch máu. Sau đó cấy 3 chiều để thu khuẩn lạc riêng rẻ. Cuối cùng cấy lên thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm. Ủ ở 35±20C/ 24h (riêng CA ủ trong bình nến).
- Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ.
c/ Bệnh phẩm máu
- Theo chỉ định của bác sĩ thì máu bệnh nhân được lấy và cấy trực tiếp vào chai cấy máu. Máu được cấy với tỷ lệ 1 phần máu/10 phần canh thang trong canh thang Trypticase soy có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu động vật khác và 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate, là chất chống tạo áo máu và làm giảm tác dụng của các chất ức chế vi khuẩn có trong máu bệnh nhân), ủ 35±20
C/24h. Khi có dấu hiệu dương tính trong chai cấy máu, ta tiến hành đồng thời:
+ Quan sát hình thái khuẩn lạc, thử nghiệm sinh hóa để định danh và làm kháng sinh đồ. +Cấy chuyển lên môi trường thạch máu và thạch chocolate, ủ ở điều kiện 35±20
C/24h.
d/ Bệnh phẩm dịch não tủy
- Dùng kim tiêm hoặc pipette nhựa vô trùng hút DNT cho vào BHI, nhỏ 2 giọt lên thạch máu và 2 giọt lên thạch chocolate, trong đó 1 giọt sẽ ria ra và 1 giọt để nguyên. Đến khi dung dịch trên mặt thạch đã khô đem ủ 35±20C/24h (ủ bình nến với CA). Cấy lên thạch Sarbouraud+ Chloramphenicol để tìm nấm. Nhỏ giọt dịch vào buồng đếm để đếm số lượng hồng cầu, bạch cầu.
42
- DNT được ly tâm, lấy cặn cho lên 3 lame để nhuộm Gram, nhuộm mực Tàu và nhuộm Ziehl- Nelson.
- Sau 24h, khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch ở vị trí có ria và cả vị trí giọt dịch không ria thì khẳng định bệnh nhân bị nhiễm khuẩn. Quan sát hình thái vi khuẩn, tiến hành các test sinh hóa định danh và làm kháng sinh đồ.
e/ Bệnh phẩm nước tiểu
- Trộn đều nước tiểu rồi nhỏ một giọt trực tiếp lên lame 1 để soi tươi và nhỏ 1 giọt lên lame 2 chờ khô tự nhiên rồi nhuộm Grame. Nếu có ít nhất một tế bào vi khuẩn và/hay bạch cầu hiện diện trên 1 quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm trùng tiểu. Nếu toàn phết nhuộm không hay phát hiện được rất ít tế bào vi khuẩn hay bạch cầu, bệnh nhân chắc chắc không bị nhiễm trùng tiểu.
- Dùng vòng cấy định lượng 10µl, lấy đầy một vòng cấy nước tiểu, trãi toàn bộ lên bề mặt hộp thạch BCP, ủ 35±20 C/24h.
- Sau 24h ủ thạch, đọc kết bằng cách đếm số khúm trùng để biết số lượng vi khuẩn trong mầm cấy ban đầu, sau đó suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống (CFU) trong 1ml nước tiểu. Nếu có:
. ≤ 104 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng tiểu.
. ≥ 105 CFU/ml nước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu, định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
. 104 - ≤105 CFU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng tiểu. Trong trường hợp này, nếu bệnh nhân có dấu hiệu lâm sàng chắc chắn bị nhiễm trùng tiểu tái phát nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và làm kháng sinh đồ.