khảo sát sự kháng kháng sinh của klebsiella pneumoniae tại viện pasteur tp hồ chí minh

Chúng xâm nhập vào đường hô hấp hít thở và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi, Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc bệnh viện

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

LU ẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành ph ố Hồ Chí Minh – 2014

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết

trình nào khác

Tác giả

L ỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ

ơn chân thành đến

Ban giám hiệu cùng thầy cô Khoa Sinh – Trường Đại học Sư Phạm Thành phố

Ban Giám đốc Viện Pasteur và đặc biệt là TS Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur Tp HCM đã tạo điều kiện cơ sở vật chất tốt

ThS Vũ Lê Ngọc Lan, ThS Uông Nguyễn Đức Ninh cùng các Cô, Anh và Chị trong Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng - Viện Pasteur

Tp HCM đã hết lòng chỉ dẫn, đóng góp ý kiến và cùng đồng hành, tạo mọi điều kiện

thực hiện khóa luận này

những người đã luôn bên cạnh ủng hộ em

Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người

Phạm Thị Hoài An

M ỤC LỤC

Trang

Mục lục

Danh mục các bảng

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Klebsiella pneumoniae 4

1.1.1 Đặc điểm vi sinh học 4

1.1.1.1 Hình thái và cấu trúc 4

1.1.1.2 Cấu trúc kháng nguyên 4

1.1.1.3 Cấu trúc bộ gen 5

1.1.1.4 Tính chất nuôi cấy 5

1.1.1.5 Tính chất hóa sinh 6

1.1.2 Khả năng gây bệnh 6

1.1.2.1 Cơ chế gây bệnh 6

1.1.2.2 Biểu hiện lâm sàng 6

1.1.3 Chẩn đoán vi sinh vật 6

1.1.4 Phòng bệnh và điều trị 6

1.2 Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh 7

1.2.1 Định nghĩa kháng sinh 7

1.2.2 Phân loại kháng sinh 7

1.2.2.1 Dựa vào khả năng tác dụng 7

1.2.2.2 Dựa vào phổ tác dụng 8

1.2.2.3 Dựa vào nguồn gốc 8

1.2.2.4 Dựa trên cấu trúc hóa học 9

1.2.2.5 Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh 11

1.3 Cơ chế tác động của kháng kháng sinh 11

1.4 Cơ chế kháng kháng sinh 14

1.4.1 Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen 14

1.4.1.1 Đề kháng tự nhiên 15

1.4.1.2 Đề kháng mắc phải 15

1.4.2 Cơ chế kháng kháng sinh 16

1.4.2.1 Tạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh 17

1.4.2.2 Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn 20

1.4.2.3 Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận 21

1.4.2.4 Bơm đẩy 22

1.4.3 Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm 22

1.4.3.1 Kháng Penicillin và Cephalosporin 22

1.4.3.2 Kháng Carbapenemes 23

1.4.3.3 Kháng Aminoglycoside 23

1.4.3.4 Kháng Fuoroquinolones 24

1.4.3.5 Kháng Tetracyclin 24

1.4.3.6 Kháng Sulfonamid 24

1.5 Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong nước 25

1.5.1 Trên thế giới 25

1.5.1 Tại Việt Nam 29

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.1 Đối tượng 32

2.1.2 Cỡ mẫu 32

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 32

2.1.4 Địa điểm thực hiện đề tài 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Vật liệu 33

2.2.2 Phương pháp thực hiện 36

2.2.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu

39

2.2.2.2 Nhuộm Gram: xác định vi khuẩn Gram âm 42

2.2.2.3 Dùng các thử nghiệm sinh hóa để định danh Klebsiella pneumoniae 43

2.2.2.4 Làm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby- Bauer 47

2.2.2.5 Thử nghiệm đĩa đôi 50

2.2.2.6 Thử nghiệm Hodge test 51

2.2.2.7 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng kháng sinh 52

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 57

3.1 Đặc tính mẫu 57

3.1.1 Đặc tính về giới tính của bệnh nhân 57

3.1.2 Đặc tính về tuổi bệnh nhân 57

3.2 Sự phân bố vi khuẩn Klebsiella pneumoniae trong các loại bệnh phẩm 58

3.3 Khảo sát mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae 59

3.4 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng 63

3.5 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase 67

3.6 Kết quả PCR 68

3.6.1 Gen CMY-2 69

3.6.2 Gen bla OXA -1 72

3.6.3 Gen blaNDM-1 75

3.6.4 Gen blaIMP 78

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

PH Ụ LỤC

DANH M ỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMC Amoxiclline/clavalanic acid

DNT Dịch não tủy

EPM Etapenem

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam……… 9

Bảng 1.2 Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler……… 18

Bảng 1.3 Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush……… 18

Bảng 2.1 Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm……… 39

Bảng 2.2 Các đoạn mồi dùng trong PCR phát hiện gen kháng kháng sinh……… 53

Bảng 2.3 Các thành phần trong phản ứng PCR……… 54

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho từng gen mục tiêu……… 55

Bảng 3.1 Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo giới tính……… 57

Bảng 3.2 Tỉ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae theo độ tuổi……… 58

Bảng 3.3 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae phân lập từ các loại bệnh phẩm……… 59

Bảng 3.4 Tính nhạy cảm kháng sinh của Klebsiella pneumoniae……… 60

Bảng 3.5 So sánh tỉ lệ kháng kháng sinh với các nghiên cứu trước……… 61

Bảng 3.6 Tỷ lệ đa kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae… 63

Bảng 3.7 Kết quả của một số nghiên cứu về Klebsiella pneumoniae sinh ESBL……64

Bảng 3.8 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL theo mẫu bệnh phẩm………… 64

Bảng 3.9 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL kháng với các kháng sinh……….65

Bảng 3.10 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase……… 67

Bảng 3.11 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase theo mẫu bệnh phẩm…67 Bảng 3.12 Kết quả PCR phát hiện 4 gen kháng kháng sinh……… 68

Bảng 3.13 Kết quả điện di gen CMY-2……… 70

Bảng 3.14 Kết quả điện di gen bla OXA-1………71

Bảng 3.15 Kết quả điện di gen blaNDM-1……… 74

DANH M ỤC CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ

Trang

Hình 1.1 Klebsiella pneumoniae………4

Hình 1.2 Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA……….5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam……… 9

Hình 1.4 Cơ chế tác động của kháng sinh……… 12

Hình 1.5 Các phương thức lan truyền gen đề kháng……… 16

Hình 1.6 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn……… 17

Hình 2.1 Klebsiella pneumoniae bắt màu hồng trên phết nhuộm Gram………… 42

Hình 2.2 API định danh vi khuẩn của BIOMERIEUX – Pháp………46

Hình 2.3 Kết quả định danh API 20E của Klebsiella pneumoniae……… 47

Hình 2.4 Kháng sinh đồ của Klebsiella pneumoniae……… 50

Hình 2.5 Thử nghiệm đĩa đôi……… 51

Hình 2.6 Thử nghiệm Hodge test……… 52

Hình 3.1 Kết quả PCR gen CMY-2 đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….69

Hình 3.2 Kết quả PCR gen blaOXA-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)…….72

Hình 3.3 Kết quả PCR gen blaNDM-1đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)… 76

Hình 3.4 Kết quả PCR gen blaIMP đọc bằng máy chụp gel (GelDOc-It2 – Mỹ)… 79

Sơ đồ 2.1 Phương pháp nghiên cứu sự kháng kháng sinh của K pneumoniae………37

Sơ đồ 2.2 Quy trình nuôi cấy Klebsiella pneumoniae từ bệnh phẩm: đàm, mủ, máu, dịch não tủy, nước tiểu……… 38

Sơ đồ 2.3 Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán kháng sinh trên mặt thạch……… 48

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae……….61

Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ Klebsiella pneumoniae sinh β-lactamase phổ rộng……… 63

M Ở ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Klebsiella là một loại vi khuẩn Gram âm thường được tìm thấy trong ruột của người (mà không gây bệnh), phân người hoặc ở đường hô hấp Chúng xâm nhập vào đường hô hấp (hít thở) và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây viêm phổi,

Ngày nay, có nhiều vi khuẩn Klebsiella đã kháng thuốc, nhất là với loại thuốc

bệnh viện Hàn Quốc cho thấy Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin thế hệ 3 là

Tình hình kháng thuốc của Klebsiella pneumoniae không chỉ xuất hiện ở Israel

được mô tả lần đầu tiên vào năm 1996 gây chết người liên tiếp Kể từ đó lan rộng ra 41

[63]

Riêng Việt Nam, theo kết quả tìm hiểu thực trạng sử dụng kháng sinh trong

Pseudomonas spp., E.coli, Klebsiella spp 4 chủng này đều là vi khuẩn đa kháng kháng sinh

Hiện nay, sự kháng thuốc của chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae cực kì nguy

cấu trúc hóa học của kháng sinh [27] β lactamase phổ rộng có khả năng phân giải hầu

khả năng sản sinh được carbapenemase phân giải carbapenem như imipenem,

meropenem , trong khi carbapenem được xem như là cứu cánh cuối cùng trong việc lựa chọn kháng sinh để điều trị [69] Để tránh tình trạng đa kháng trên lâm sàng, điều

càng tốt giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp nhất để điều trị cho bệnh nhân

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự kháng kháng sinh của Klebsiella

pneumoniae tại viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh”

2 Mục đích nghiên cứu

Xác định đặc tính kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae tại Viện Pasteur

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát tỷ lệ nhiễm Klebsiella pneumoniae ở giới tính, các lứa tuổi, bệnh

- Sàng lọc các chủng Klebsiella pneumoniae sinh ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi,

pneumoniae

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp thu mẫu, nuôi cấy, phân lập, định danh, làm kháng sinh đồ, sàng lọc chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae sinh carbapenemase, β-lactamases phổ

Tp HCM đạt chuẩn ISO 15189:2007

hóa sinh hoặc API 20E

- Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer

- Thử nghiệm đĩa đôi, thử nghiệm Hodge test sàng lọc các chủng Klebsiella

pneumoniae sinh β-lactamases phổ rộng, carbapenemase

6 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

Tp Hồ Chí Minh

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Klebsiella pneumoniae

Năm 1882, Fridlander C.Uber đầu tiên phát hiện ra Klebsiella là tác nhân gây

bệnh viêm phổi [45]

Vào năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram

Loài: Klebsiella pneumoniae [90]

Klebsiella pneumoniae là thành viên quan trọng nhất của chi Klebsiella trong họ

Enterobacteriaceae Klebsiella pneumoniae là một loại trực khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, kích thước 0,5-2 µm, hình que, không có lông, không di động, có vỏ, không sinh nha bào [75] [85]

1.1.1.2 Cấu trúc kháng nguyên

Gồm hai loại kháng nguyên trên bề mặt tế bào

+ Kháng nguyên O

Đây là kháng nguyên của vách tế bào Kháng nguyên O bản chất là

cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên,

đến 8 monosaccharid khác nhau Dựa trên sự có mặt hay thiếu hụt của kháng nguyên

Hình 1.1 Klebsiella pneumoniae

thường nhỏ, màu trong, mặt lồi, bờ đều, bóng) hoặc R (dạng R - Rough: xù xì, khuẩn lạc thường dẹt, bờ đều hoặc nhăn nheo, mặt xù xì, khô) khi vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch Agar Kháng nguyên O không bị huỷ ở 100°C trong hai giờ hoặc trong

biết có 9 serotypes khác nhau của Klebsiella pneumoniae Kháng nguyên O có tính đặc

+ Kháng nguyên K: là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, mang

Cả hai góp phần vào khả năng gây bệnh và cơ sở hình thành serogrouping [4][6] [72] [76]

1.1.1.3 Cấu trúc bộ gen

Bộ gen hoàn chỉnh đã được xác định vào năm 2006 tại trung tâm giải trình tự gen

subsp pneumoniae MGH 78.578 Nó bao gồm một nhiễm sắc thể là 5,3 Mbp Có năm

plasmid là 0,18 Mbp, 0.11 Mbp, 0,089 Mbp, 0,0043 Mbp, và 0,0035 Mbp ADN là

1.1.1.4 Tính ch ất nuôi cấy

Klebsiella pneumoniae là loài sống hiếu kỵ khí tùy nghi Phát triển dễ dàng trên

môi trường nuôi cấy thông thường [6] [17]

thước 3-4mm, dạng M, tuy nhiên vẫn có thể gặp một số khuẩn lạc dạng R

Hình 1.2 Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên môi trường CA

bởi một nang Nang này che các kháng nguyên làm cơ thể phát hiện tác nhân xâm lấn

đóng vai trò là nội độc tố và làm tăng độ nặng của phản ứng viêm, có thể gây sốc nhiễm khuẩn [4] [6]

1.1.2.2 Bi ểu hiện lâm sàng

Trong những năm gần đây, Klebsiella pneumoniae đã trở thành tác nhân quan

trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện, gây nhiễm trùng cơ hội ở những bệnh nhân bị suy giảm miễm dịch hoặc ở các bệnh nhân đang hồi sức hô hấp (đang dùng máy hô hấp nhân tạo), gây nhiễm trùng đường hô hấp dưới như viêm phổi, viêm phế quản thứ phát, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu, đường mật, đường sinh dục, viêm màng não, viêm xoang, viêm nội tâm mạc [4] [6]

1.1.3 Chẩn đoán vi sinh vật

Chủ yếu dựa vào chẩn đoán trực tiếp từ các bệnh phẩm khác nhau: đàm, mủ,

xác định vi khuẩn dựa vào hình thể, tính chất nuôi cấy đặc biệt (khuẩn lạc nhầy, dính), tính chất sinh hóa, khả năng gây bệnh Xác định type bằng phản ứng ngưng kết hoặc phản ứng phình vỏ với kháng huyết thanh đặc hiệu type [4] [6]

1.1.4 Phòng bệnh và điều trị

+ Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp phòng bệnh đặc hiệu Thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung Chủ yếu là tránh những điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng cơ hội xuất hiện bằng cách nâng cao sức đề kháng của người bệnh và dự phòng tốt các nhiễm trùng bệnh viện [4] [6]

+ Điều trị

Sử dụng kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn Tuy nhiên Klebsiella pneumoniae thường có sức đề kháng cao với kháng sinh Nên cần cẩn thận, cân nhắc để lựa chọn

1.2 Kháng sinh và cơ chế tác động của kháng sinh

1.2.1 Định nghĩa kháng sinh

trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicilium thì khuẩn lạc gần

dùng trong điều trị

vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật khác,

hợp các kháng sinh tự nhiên và nhân tạo, do đó định nghĩa kháng sinh đã thay đổi: kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng

diệt được vi khuẩn Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí

[14]

1.2.2 Phân loại kháng sinh

khoảng 100 loại dùng trong y khoa và thú y [38]

1.2.2.1 Dựa vào khả năng tác dụng

ß-lactams: Penicillin, Ampicillin, Amoxcillin, Cephalosporin

Aminosid: Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Spectinomycin

Quinolon: Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Marbofloxacin Polypeptid: Colistin, Bacitracin, Polymycin

Tetracyclin: Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlotetracyclin, Doxycyclin

Macrolid: Erythromycin, Spiramycin, Tylosin, Tiamulin, Josamycin

Lincomycin, Phenicol: Chloramphenicol, Thiamphenicol, Florfenicol

Pyrimethamin

1.2.2.2 D ựa vào phổ tác dụng

kháng sinh đặc hiệu, kháng sinh phổ rộng, kháng sinh phổ hẹp

khuẩn hay một nhóm vi khuẩn nhất định (Spectinomycin tác động lên vi khuẩn lậu)

Piperacillin/tazobactam; Levofloxacin, Gatifloxacin, Moxifloxacin, Ciprofloxacin; Streptomycin; Tetracycline; Chloramphenicol; Ticarcillin

1.2.2.3 Dựa vào nguồn gốc

Gồm kháng sinh tổng hợp tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp

Benzylpenicilin là một penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi cấy nấm

Penicillium chrysogenum Aztreonam (Azactam): là chất duy nhất của nhóm

Monobactam được phân lập từ Chromobacterium violacerum

quinolones, oxazolidinones

trong tự nhiên như là beta-lactams (trong đó bao gồm penicillins được sản suất bởi

nấm trong chi Penicillium, cephalosporins, carbapenems)

1.2.2.4 Dựa trên cấu trúc hóa học

 Nhóm beta lactam:

Các kháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm dựa theo cấu trúc hóa học:

- Các penam: vòng A có 5 cạnh bão hòa, gồm các penicilin và các chất ức chế lactamase

- Các penem: vòng A có 5 cạnh không bão hòa, gồm các imipenem, ertapenem

aztreonam

Hình 1.3 C ấu trúc hóa học của 4 nhóm β-lactam

Bảng 1.1 Lớp, phân lớp kháng sinh beta lactam Lớp kháng sinh Phân nhóm kháng sinh Kháng sinh tiêu biểu

Penicillinase-stable penicillins

Cloxacillin, Dicloxacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin

cephalophin, cephapirin…

cefaclor, cefuroxim, cetotetan, cefonicid, caforanid, cefamandol, cefprozil, cefoxitin, cefmetazol…

Nhóm lincosamid: lincomycin, clidamycin,…

Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol

Nhóm tetracyclin: tetracyclin, doxycyclin

Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin,…

Nhóm co-trimoxazol: co trimoxazol

Nhóm peptid: glucopeptid: vancomycin, polypeptid: polymyxin, bacitracin

1.2.2.5 Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh

kháng sinh như: bacitracin, cephalosporin, cycloserine, penicillin, rostocetin, vancomycin

polymyxin, gentamicin

chloramphenical, erythromycins, lincomycins, tetracylines, aminoglycoside,

nalidixic acid, novobiocin, pyrimethamine, rifampin, sulfonamides, trimethoprim

1.3 Cơ chế tác động của kháng kháng sinh

bằng cách:

Hình 1.4 Cơ chế tác động của kháng sinh 1.3.1 Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn

bào có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở

vách tế bào bị ức chế Các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có

trong đó có một số thụ thể là những enzyme tranpeptidase Những thụ thể khác nhau

có những áp lực khác nhau đối với một loại thuốc

làm ngăn chặn việc tổng hợp peptidoglycan, một thành phần quan trọng của các tế bào

Cơ chế của việc phong bế tranpeptidase tương tự với acyl – alanyl – D – alanyl, một

trường ưu trương, những tế bào bị biến đổi thành protoplast hay spherolast chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào nên dễ vỡ

1.3.2 Ức chế chức năng của màng tế bào

ngoài Màng có tính thấm chọn lọc để kiểm soát các thành phần bên trong tế bào Nhưng nếu màng này bị tổn thương, các phân tử lớn và ion sẽ thoát ra ngoài nên vi

tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài Polymyxin và các kháng sinh thuộc

1.3.3 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

chế peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide

mRNA

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide

trình dịch mã không chính xác

Những tiểu đơn vị của mỗi loại ribosome khác nhau về chức năng và thành phần hóa

1.3.4 Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

- Actinomycin: ức chế hiệu quả sự tổng hợp ADN Thuốc gắn vào ADN tạo nên

một phức hợp, các phức hợp này ức chế các ARN tương ứng đặc biệt là mARN Mitomycin gắn vào 2 chuỗi ADN ngăn cản chuỗi tách rời làm ADN không được chép

nên ít được dùng trong điều trị

- Rifampin: Rifamin ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng cách gắn chặt vào

-gyrase, ức chế tác dụng của enzyme ADN-gyrase làm cho hai mạch đơn của

- Các sulfonamide: đối với nhiều vi sinh vật, acid para-aminobenzoic (viết tắt là PABA) là một chất chuyển hoá cần thiết trong quá trình tổng hợp acid folic cần thiết

để tổng hợp purin trong ADN Sulfonamide do có cấu trúc tương tự PABA) có tác

tính tổng hợp acid dihydrofolic được tạo thành và ngăn cản quá trình tổng hợp acid

- Trimethoprin: ức chế hydrofolic reductase, enzyme này biến đổi acid hydrofolic

1.3.5 Ức chế chuyển hoá

Cotrimoxazole (sulfamehtoxazol và trimethoprime) là chế phẩm phối hợp hiệu quả

[1] [10]

1.4 Cơ chế kháng kháng sinh

1.4.1 Bản chất di truyền của tính đề kháng và các phương thức chuyển tải gen

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc ở gen Các gen kháng

động như các plasmide, các yếu tố có thể chuyển vị trí hoặc integron (đề kháng ngoài nhiễm sắc thể) Sự đề kháng có thể tự nhiên hoặc mắc phải [3] [5] [77] [87]

1.4.1.1 Đề kháng tự nhiên

- Các gen đề kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn Đề kháng tự nhiên là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài vi khuẩn, đã có tính kháng trước khi

và phổ tác dụng của thuốc kháng sinh

Gram âm kháng vancomycine đều là tự nhiên Đây là sự đề kháng thường xuyên và có

ngang) [3] [5] [77] [87]

1.4.1.2 Đề kháng mắc phải

- Vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh, sau một thời gian tiếp xúc trở thành

sau: đột biến nhiễm sắc thể nhất thời hoặc mắc phải các gen đề kháng từ một vi khuẩn khác

a) Đột biến nhiễm sắc thể nhất thời (diễn tiến dọc)

- Đột biến nhiễm sắc thể nhất thời là cơ chế đề kháng kháng sinh của khoảng

biến chỉ ảnh hưởng đến một đặc tính là sự đề kháng Nói chung, chỉ liên quan đến một

lây lan các thể biến dị đề kháng này bằng cách dùng phối hợp hai hoặc nhiều kháng sinh

- Ví dụ: đề kháng với kháng sinh rifampicine và các quinolone luôn luôn là do đột biến

b) Mắc phải các gen kháng thuốc từ một vi khuẩn khác (diến tiến ngang)

thấy ở cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm Việc mắc phải yếu tố di truyền mới có

di truyền di động Trường hợp thứ hai này, các gen đề kháng có ở trong một đoạn ADN của vi khuẩn nằm ở bên ngoài hay trên một số yếu tố di động, như các plasmid Dạng

đề kháng này có thể chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác và thậm chí ở các vi khuẩn thuộc các loài khác nhau Sự chuyển giao của một plasmide đơn độc cũng làm

tăng nguy cơ đề kháng với nhiều thuốc Ví dụ : Vi khuẩn Shigella, gây bệnh tiêu chảy,

Các plasmid thường được chuyển bằng cách giao nạp Giao nạp là một tiến trình trong

đó ADN được chuyển từ một vi khuẩn cho sang một vi khuẩn nhận theo một cơ chế

[5] [77] [87]

Hình 1.5 Các phương thức lan truyền gen đề kháng 1.4.2 Cơ chế kháng kháng sinh

đề kháng này đã được nghiên cứu và ghi nhận với các cơ chế chủ yếu sau [51] [56]

[68] [74]:

Hình 1.6 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 1.4.2.1 T ạo enzyme phân hủy kháng sinh làm bất hoạt kháng sinh

- Vi khuẩn sản xuất ra enzyme gây phân hủy hoặc làm bất hoạt kháng sinh Sự

hưởng bởi kích thích bên ngoài

- Sự sinh beta-lactamase:

làm bất hoạt các kháng sinh nhóm beta-lactam bằng cách phá hủy nối amide của vòng

kháng sinh nhóm này rất đáng lo ngại Trong số các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng

biệt là trực khuẩn Gram âm đường ruột, cũng sản xuất nhiều loại beta-lactamases, được phân thành nhiều nhóm nhỏ, và chúng liên tục được phát hiện ra các nhóm mới

Phân loại enzyme β-lactamase

chia β-lactamases thành 4 lớp A, C, D và B Chúng được phân thành 2 nhóm chính,

trong đó, trung tâm hoạt động của lớp A, C, D là serine, lớp B (metallo-β-lactamases)

Lớp C AmpC (CMY, FOX, )

Đến năm 1995, dựa vào chức năng thủy phân thuốc kháng sinh và tính nhạy cảm của các β-lactamases đối với các chất ức chế enzyme, Karen Bush xếp β-lactamases thành 4 nhóm 1,2,3 và 4

Bảng 1.3 Phân loại enzyme β-lactamase theo Karen Bush Nhóm

Có serine ở trung tâm hoạt động

Enterococci

oxyimino-cephalosporins và monobactams

2br A Inhibitor-resistant β-lactamase các enzyme TEM,

SHV

Carbenicillin

Cloxacillin/Oxacillin, ít bị ức chế bởi acid clavulanic

Carbapenem

Metalloenzymes

Có kim loại (kẽm) ở trung tâm hoạt động

Không bị ức chế bởi acid clavulanic

xác định

Penicillinases bị ức chế bởi acid clavulanic

Ngày nay, người ta đã tìm ra hơn 200 loại β-lactamase khác nhau

β-lactamase phổ rộng (ESBL): Nhóm các enzyme đang nổi lên như một vấn đề

Cho đến gần đây các enzyme này bị ức chế bởi acid clavulanic, sulbactam, và tazobactam

+ Vào đầu thập niên 1980, các cephalosporines thế hệ thứ 3 được lưu hành trên

các biến đổi nhỏ trong chuỗi gen gốc đã làm thay đổi đáng kể tính ái lực của các enzyme đối với cơ chất, và đã hình thành một nhóm beta-lactamase phổ rộng, hay còn được gọi là ESBL (Extend Spectra Beta-Lactamases) Phần lớn các ESBL này đến từ phổ TEM-1 và SHV-1 Thực tế có trên 90 types beta-lactamase TEM và 25 types beta-

lactamase SHV Nhiều họ ESBL mới được mô tả gần đây là: CTX-M, OXA…

+ Sự đề kháng này diễn tiến nhanh và việc thay thế một lượng nhỏ acid amin của

quá mức các cephalosporinase từ nhiễm sắc thể ở cấp độ rất cao đã tạo nên một loại

loài vi khuẩn tự sản sinh cephalosporinase do cảm ứng (trực khuẩn đường ruột,

Pseudomonas aeruginosa), sau khi xảy ra đột biến, các vi khuẩn sản xuất ra một lượng

hiện men ESBL, đồng thời với việc sản sinh carbapenemase gây thu hẹp đáng kể “kho

1.4.2.2 Thay đổi tính thấm của tế bào vi khuẩn

- Các vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào: màng tế bào chất phân cách tế bào chất

bên trong Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi ngang qua lớp vỏ này để thấm vào

Sự giảm tính thấm của tế bào làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác

ngăn cản sự khuyếch tán của kháng sinh vào đúng vị trí tác dụng Dạng đề kháng này

khác nhau nhưng có thể dùng chung một loại lỗ Mặt khác, sự đề kháng này là đặc hiệu khi một kháng sinh chỉ dùng riêng một loại lỗ Ví dụ sự đề kháng của

Pseudomonas aeruginosa với imipenem là sự đề kháng đặc hiệu gây ra do mất đi các

lỗ riêng dành cho các carbapeneme

đặc biệt sự giảm kích thước lỗ hoặc giảm số lượng các lỗ Tính thấm liên quan đến các

lỗ thường phối hợp với việc tổng hợp các beta-lactamase tạo nên sự đề kháng cho vi

imipeneme là do sự biến đổi đồng thời tính thấm tế bào và tăng tổng hợp các

1.4.2.3 Thay đổi cấu trúc receptor của kháng sinh làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận

- Biến đổi các protein liên kết với penicillin (PBP): Giảm ái lực của các PBP với

gen bên ngoài có các PBP mới Cơ chế này thường gặp với các cầu khuẩn Gram

dương, như Staphylococcus aureus và Streptococcus pneumoniae, nhưng rất hiếm gặp

ở vi khuẩn Gram âm Trong số các vi khuẩn Gram âm, cơ chế đề kháng này được thấy

ở Neisseria và hiếm gặp hơn ở Haemophilus influenza

- Bi ến đổi vị trí gắn kết ở ribosom: Biến đổi bên trong tế bào vi khuẩn ở tiểu đơn

nhóm aminosides, hoặc chloramphenicol Sự biến đổi này làm cho kháng sinh không

đủ khả năng ức chế tổng hợp protein cũng như sự tăng trưởng của vi khuẩn, do không thể gắn kết vào vị trí tác dụng ở ribosom

- Bi ến đổi ADN-gyrase và topoisomerase: ADN-gyrase là enzyme cần thiết cho

- Bi ến đổi các tiền chất đích ở thành tế bào vi khuẩn: Hiện tượng này có thể bị

vancomycine

- Bi ến đổi các enzyme đích: Sự biến đổi của dihydropteroate synthetase kháng lại

sự gắn kết với sulfamide và của dihydropteroate reductase làm mất nhạy cảm với

1.4.2.4 Bơm đẩy

- Kháng sinh không thể đạt đến vị trí tác dụng do bơm đẩy chủ động đẩy kháng

bình thường của tế bào vi khuẩn và góp phần lớn cho tính đề kháng nội sinh của vi khuẩn chống lại nhiều thuốc kháng sinh Các bơm này hoạt động cần năng lượng Việc

mang, làm tăng mạnh tính đề kháng của vi khuẩn Đây cũng có thể là nguyên nhân gây

đề kháng chéo Ví dụ, ciprofloxacine có thể làm thuận lợi việc phát tán đề kháng với

có mang bơm đẩy gây kháng thuốc là E.coli và Shigella Staphylococcus aureus cũng

có bơm đẩy làm cho vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm macrolides

1.4.3 Cơ chế kháng một số nhóm kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

1.4.3.1 Kháng Penicillin và Cephalosporin

Đối với vi khuẩn Gram âm sinh β-lactamase phân hủy kháng sinh được tiết vào

- Vi khuẩn sinh ra penicillinase và cephalosporinase có khả năng thủy phân các

bởi các chất ức chế beta-lactamase là clavulanic acid và sulbactam Do đó, khi phối

được sự đề kháng của các vi khuẩn sinh beta-lactamase [28]

- Vi khuẩn gram âm đường ruột sinh men ESBL (+) [34] [40]

ß-lactam đặc biệt là kháng cephalosporin thế hệ thứ ba Việc sinh beta-lactamases phổ rộng (ESBL) lây truyền qua plasmide được phát hiện lần đầu tiên ở Đức năm 1983 và

sau đó ở Mỹ ESBL lần đầu tiền được xác định ở chủng Klebsiella pneumoniae Sau

đó, chúng được lây truyền nhanh chóng và dễ dàng cho các vi khuẩn Gram âm đường ruột khác như Escherichia coli Hiện nay, đây là 2 chủng vi khuẩn Gram âm đường

tại các bệnh viện là bao nhiêu Mặc dù các báo cáo về các đợt nhiễm trùng bệnh viện

chưa xác định được các vi khuẩn sinh ESBL

1.4.3.2 Kháng Carbapenemes

đa kháng, chẳng hạn như vi khuẩn Escherichia coli ( E coli ) và Klebsiella

pneumoniae đã kháng cephalosporin thế hệ thứ ba Gần đây, báo động đã được nâng

chúng sản xuất carbapenemase, bao gồm KPC ( Klebsiella pneumoniae carbapenemase) và NDM (New Delhi Metallo-beta-lactamase) KPC và NDM là các

hiện để chống lại vi khuẩn đề kháng với carbapenems, và sự lây lan trên toàn thế giới

Người ta cũng đã phân lập được carbapenemase từ các vi khuẩn Pseudomonas

aeruginosa và Acinetobacter baumanii [24] [71]

serine tác động vào amino acide serine tại vị trí 70 hoạt động trong cấu trúc phân tử

ion kim loại có hóa trị 2, thông thường là kẽm [69]

1.4.3.3 Kháng Aminoglycoside

- Biến đổi thuốc bằng quá trình phosphoryl hóa, adenyl hóa được mã hóa bởi

plasmid và acetyl hóa các enzyme làm thay đổi thuốc kháng sinh Đây là cơ chế quan trọng nhất

- Giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn đối với kháng sinh

1.4.3.4 Kháng Fuoroquinolones

được lựa chọn trong điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm đường ruột Cùng

fluoroquinolones cũng đang càng ngày phát triển

đồng để điều trị viêm phổi, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng da và mô mềm Cơ chế

đề kháng với nhóm fluoroquinolones theo 2 kiểu: biến đổi đích tác dụng của kháng

1.4.3.5 Kháng Tetracyclin

khuẩn kháng lại thuốc [69]

1.4.3.6 Kháng Sulfonamid

Vi khuẩn kháng thuốc nhờ hai cơ chế [69]:

bào

- Đột biến nhiễm sắc thể ở tế bào gan mã hóa các enzyme đích như

1.5 Tình hình kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae trên thế giới và trong

nước

1.5.1 Trên thế giới

thấy tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae là ampicillin 95%, cefotaxime 84%, ceftazidime 83%, co-trimoxazole70%, ceftriaxone 70%, amikacin 60%, tetracyclin 58%, gentamycin 55%

Theo nghiên cứu ở Đại học Gulbarga (Ấn Độ) từ năm 2008-2010, trong 1064

amoxicillin/clavalunic acid (81,63%), ceftazidime (70,40%), cefotaxime (65,30%),

Sự kháng thuốc của là do chúng sản xuất các enzyme phân giải kháng sinh

+ Klebsiella pneumoniae sinh ESBL (extended-spectrum beta-lactamases)

Châu Âu

Vi khuẩn đường ruột, đặc biệt là Klebsiella spp và E coli sản xuất ESBL được

sinh, đặc biệt là nhóm cephalosporin [53] Ở Pháp và Italia có đến 40% chủng

Klebsiella pneumoniae kháng ceftazidime [32]

điều này được cho là do sự phổ biến của ESBL trong các bệnh viện và cộng đồng [41]

kháng sinh khác nhau bao gồm tất cả β-lactam, fluoroquinolones và aminoglycosides [46]

North America

Tại Bắc Mỹ, tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL dao động từ 8,5 và 8,8% [46]

Latin America

Chương trình giám sát kháng khuẩn SENTRY vào năm 2001 lưu ý, trong khoảng

pneumoniae sản sinh ESBL [86]

Châu Phi

Ở những bệnh nhân được điều trị tại các bệnh viện châu Phi, tỷ lệ vi khuẩn sinh

viện Tunis, Tunisia (thời gian nghiên cứu: 1999-2005 và 2010), ESBL đã tăng 77,8% [42]

nhưng plasmid mã hóa AmpC (AmpC) thuộc lớp C cũng có mặt [73]

đồng; các gen mã hóa ESBL liên quan là lớp A [51]

Châu Á

nằm trong khoảng từ 20-40% trên toàn khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc và Nhật

phổ rộng trong Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae và các yếu tố nguy cơ liên

63,6% E coli và 66,7% K pneumoniae Trong đó kiểu gen blaCTX-M là phổ biến

14,7 %, gentamicin 66,7 %, trimethoprim / sulphamethoxazole 79,1 % và ciprofl oxacin 93,8% [30]

Từ năm 2000, sự lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn Gram âm là căn

cephalosporin đã được ghi nhận trên toàn thế giới [15] [16] Carbapenem là nhóm

kháng sinh mạnh nhất được sử dụng để điều trị cho các trường hợp bị nhiễm khuẩn bệnh viện nặng do các chủng vi khuẩn Gram âm sinh ESBL Tuy nhiên do sử dụng

trên thế giới Enzyme OXA-48 phân giải carbapenem tập trung chủ yếu ở các quốc gia vùng Địa Trung Hải, châu Âu và Ấn Độ [59]

Vào năm 2001, Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) thuộc lớp A được

báo cáo đầu tiên trong một mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân ở Bắc Carolina [88]

liên quan đến yếu tố quyết định sức đề kháng cho các kháng sinh khác Mặc dù, K

pneumoniae vẫn là loài vi khuẩn phổ biến nhất mang KPC, enzyme này đã được xác định trong một số trực khuẩn Gram âm khác [52] Các ổ dịch vượt qua khỏi nước Mỹ

New York, 9 chủng K pneumoniae của 602 mẫu bệnh phẩm phân lập được phát hiện

thành phố New York và New Jersey Kể từ đó, KPC đã trở nên phổ biến trên toàn nước

tục đến 38% trong năm 2008 [70] Tại Israel, một số cơ sở báo cáo tăng KPC bắt đầu vào năm 2006 làm 120-200 người tử vong [75] Sau đó, sự bùng phát và lây truyền của

Klebsiella pneumoniae carbapenemase đã được phân lập ở ít nhất 33 quốc gia [52] Sự

Ấn Độ, Thụy Điển, Ý và Phần Lan [66]

hiện từ ngày 15 tháng 5 đến 30 tháng 6 năm 2011 để điều tra sự khuếch tán của CRE

tại Ý từ bệnh nhân nội trú (n = 7154) và bệnh nhân ngoại trú (n = 6595) trên hai mươi lăm phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng lớn từ 23 thành phố của Ý Thu được kết quả

K pneumoniae là loài thường gặp nhất (tỷ lệ phân lập carbapenem không nhạy cảm:

hiện [84]

Đặc biệt, gần đây nhất vào năm 2008, giới khoa học đã công bố thông tin chấn động, gây quan ngại lớn cho toàn thế giới về việc phát hiện ra chủng vi khuẩn mới có sức kháng mạnh bất thường tên gọi K pneumoniae ở bệnh nhân 59 tuổi người Thụy Điển có tiền sử chữa bệnh tại Bệnh viện New Delhi-Ấn Độ Khác với các dòng khuẩn

trước đây từng được biết đến, K pneumoniae kháng thuốc mới được phát hiện đều rất

mạnh và có thể đánh bại bất kỳ loại thuốc kháng sinh nào mạnh nhất từ trước đến nay

vi khuẩn này đã phát triển mạnh và xuất hiện tại hơn 16 quốc gia khác trên khắp thế

Điều đáng lo ngại hơn khi các nhà khoa học lấy mẫu gen của khuẩn K

pneumoniae đem xét nghiệm và phát hiện một chuỗi nhỏ ADN có thể dễ dàng trao đổi

có nghĩa là một khi bị nhiễm khuẩn Klebsiella pneumoniae, bệnh nhân cũng có thể dễ

và nguy hiểm hơn Đây là vấn đề y tế nghiêm trọng mang tính toàn cầu được tổ chức Y

chóng và hiệu quả thì sẽ không có kháng sinh để điều trị hiệu quả cho các vi khuẩn

14 nhóm khuẩn khác nhau trên thế giới, trong đó bao gồm cả nhóm khuẩn gây bệnh lỵ

môi trường và sức khoẻ cộng đồng Trong khi đó, WHO coi sự gia tăng của NDM - 1

là viễn cảnh đen tối của nhân loại khi thuốc kháng sinh không còn tác dụng

1.5.1 T ại Việt Nam

Ở Việt Nam, các báo cáo cho kết quả tại một số bệnh viện tại thành phố Hồ Chí

đã kháng lại cephalosporin thế hệ 3 và gia tăng từ 25% năm 2000-2001 lên đến 42% vào năm 2009 Kháng sinh nhóm carbapenem được đưa vào thị trường Việt Nam vào đầu những năm 2000 và xu hướng sử dụng nhóm kháng sinh này ngày càng gia tăng

kháng sinh tại các bệnh viện đã ở mức độ cao

Năm 2004-2005, tác giả Vũ Thị Kim Cương thực hiện nghiên cứu tại Bệnh Viện

Một nghiên cứu tương tự trong năm 2005 tại Bệnh viện Nhi Đồng 1 cho thấy K

pneumoniae là tác nhân gây nhi ễm khuẩn bệnh viện đứng hàng thứ 2 sau E.coli và

được quan tâm nghiên cứu nhiều do đặc tính kháng kháng sinh của chúng và khả năng

đề kháng chéo rất cao trong trường hợp sử dụng nhiều loại kháng sinh Đặc tính này có được là do vi khuẩn có ESBL kháng được với các cephalosporin thế hệ thứ 3, 4 với tỷ

lệ từ 50 – 70% Điểm đáng chú ý là tỷ lệ kháng imipenem của các chủng trong nghiên

thấy 41,5 % E Coli; 23,1% Klebsiella pneumoniae sinh ESBL Chưa phát hiện thấy

kháng với carbapenem là rất thấp hoặc chưa phát hiện đựơc chủng kháng Trong

với E coli, K pneumoniae kháng đa kháng sinh ở mức cao hơn Tỉ lệ kháng rất thấp

tác giả Hoàng Thị Phương Dung có kết quả: trong 66 chủng vi khuẩn sinh ESBL thì có

năm 2008-2009 của Bộ Y tế - Việt Nam phối hợp với Dự án Hợp tác toàn cầu về kháng