nghiên cứu quy trình lên men rượu vang khóm cầu đúc hậu giang

Nội dung thực hiện gồm có: sản xuất bột men thuần từ chủng nấm men Saccharomyces CKV1, nghiên cứu ảnh hưởng của độ Brix và pH đến khả năng lên men, xác định thời gian và nhiệt độ thích h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM CẦU ĐÚC - HẬU GIANG

MSSV: 3113734 LỚP: VSV K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG KHÓM CẦU ĐÚC - HẬU GIANG

MSSV: 3113734 LỚP: VSV K37

Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

ThS Huỳnh Xuân Phong Lê Ngọc Ngân

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô

đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến thầy Huỳnh Xuân Phong – người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài nghiên cứu

Xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Phạm Hồng Quang và cô Nguyễn Thị Liên cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học khóa 37 Sự hỗ trợ nhiệt tình của các thầy và

cô đã giúp cho chúng em hoàn thành tốt quá trình học tập của mình

Xin chân thành cảm ơn cô Ngô Thị Phương Dung, thầy Trần Vũ Phương, anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Bùi Hoàng Đăng Long – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, đã đóng góp ý kiến và hỗ trợ điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Xin ghi ơn gia đình, anh chị cán bộ các phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học và tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua

Kính chúc Quý Thầy Cô được nhiều sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực và luôn có những cống hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài nhằm nghiên cứu quy trình lên men rượu vang khóm Cầu Đúc – Hậu Giang Nội dung thực hiện gồm có: sản xuất bột men thuần từ chủng nấm men Saccharomyces CKV1, nghiên cứu ảnh hưởng của độ Brix và pH đến khả năng lên men, xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men rượu Kết quả nghiên cứu cho thấy với bột men thuần từ chủng Saccharomyces CKV1 có khả năng lên men rượu tốt, hàm lượng ethanol thu được 16,36% v/v Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men cho thấy ở điều kiện độ Brix 30 và pH 4, bột men thuần với mật số vi sinh vật 2,4x10 8

CFU/g là thích hợp cho lên men rượu vang khóm Thời gian lên men là 13 ngày ở nhiệt độ phòng mát (22 o C) cho kết quả độ rượu cao nhất (16,36% v/v) Kết quả phân tích các chỉ tiêu lý hóa và vi sinh vật của sản phẩm sau lên men cũng cho thấy rượu vang khóm cũng là một sản phẩm đạt yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm về vi sinh vật theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) và

lý hóa theo quy chuẩn Việt Nam (QCVN 6-3:2010/BYT)

Từ khóa: bột men thuần, lên men rượu, rượu vang khóm, Saccharomyces

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về cây khóm 2

2.1.1 Nguồn gốc và chủng loại 2

2.1.2 Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng 3

2.1.3 Các sản phẩm chế biến từ khóm 4

2.2 Sơ lược về nấm men 4

2.2.1 Đặc điểm chung của nấm men 4

2.2.2 Hình dạng và kích thước 5

2.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men 5

2.2.4 Sự sinh sản của nấm men 6

2.2.5 Vai trò của nấm men 7

2.2.6 Các chủng nấm men thường sử dụng trong sản xuất rượu vang 7

2.3 Giới thiệu về rượu vang quả 8

2.3.1 Định nghĩa rượu vang quả 8

2.3.2 Thành phần hóa học của rượu vang 8

2.3.3 Quá trình sản xuất rượu vang quả 9

2.3.4 Tình hình sản xuất rượu vang 13

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Thời gian và địa điểm 16

3.1.2 Vật liệu 16

3.1.3 Dụng cụ thiết bị 16

3.1.4 Hóa chất 17

3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.2.1 Sơ đồ quy trình lên men rượu vang 17

3.2.2 Sản xuất bột nấm men 18

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu 19

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men 19

3.2.5 Sản xuất thử nghiệm mẻ 2 lít và 5 lít 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Sản xuất bột men 22

4.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu 22

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men 25

4.4 Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng mẻ rượu 2 lít và 5 lít 26

4.5 Quy trình sản xuất rượu vang khóm 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Thành phần hóa học của 100g khóm 3

Bảng 2: Thành phần hóa học trong rượu vang 8

Bảng 3: Kết quả độ rượu, pH, Brix sau lên men 22

Bảng 4: Kết quả đánh giá cảm quan 24

Bảng 5: Kết quả độ rượu, pH, Brix sau lên men theo thời gian và nhiệt độ 25

Bảng 6: Kết quả độ rượu sau khi lên men mẻ rượu 2 lít và 5 lít 26

Bảng 7: Kết quả đánh giá cảm quan ở mẻ 2 lít và 5 lít 27

Bảng 8: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang khóm 27

Bảng 9: Kết quả phân tích mẫu rượu vang khóm 30

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Khóm Cầu Đúc - Hậu Giang 2

Hình 2: Nấm men Saccharomyces 5

Hình 3: Quy trình lên men rượu vang 17

Hình 4: Quy trình sản xuất bột men từ nấm men Saccharomyces 18

Hình 5: Biểu đồ trung bình đánh giá cả quan của các nồng độ rượu điều vị 28

Hình 6: Biểu đồ trung bình đánh giá cảm quan của rượu vang khóm và sản phẩm điều vị 29

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trên thế giới, rượu vang đã có từ lâu đời và được dùng rất phổ biến ở nhiều nước Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu vang vẫn chưa được quan tâm nhiều, năng suất cũng như chất lượng sản phẩm chưa cao

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ sản xuất rượu, bia cũng đã có sự phát triển mạnh mẽ Theo đó, kỹ thuật sản xuất rượu vang cũng có những bước phát triển mới: chất lượng ngày càng tốt, số lượng ngày càng nhiều, mẫu

mã ngày càng đẹp, giá cả vừa phải phù hợp với nhu cầu của số đông người tiêu dùng Ngoài nho là loại quả chủ yếu được dùng để sản xuất rượu vang, nhiều nước trên thế giới đã sử dụng nhiều loại trái cây khác như: dâu, cam, bưởi, mận, khóm, mít,… để sản xuất rượu vang

Khóm là một trong những cây ăn quả quan trọng trên thế giới Ở Việt Nam, khóm được trồng từ Bắc đến Nam Tổng sản lượng khóm năm 2007 đạt 529.100 tấn Tuy nhiên, thực tế các khâu bảo quản, chế biến và tiêu thụ còn tồn tại nhiều yếu kém

Do đó, việc nghiên cứu tạo thêm sản phẩm từ khóm sẽ giải quyết được nguồn nguyên liệu quá thừa vào mùa vụ chính tạo ra sản phẩm mới làm tăng tính đa dạng sản phẩm, cải thiện thu nhập cho nhà nông là hết sức cần thiết Một trong những hướng nghiên cứu là ứng dụng cho lên men để sản xuất rượu vang Từ lâu, khóm Cầu Đúc - Hậu Giang đã vang danh khắp trong và ngoài nước nhờ chất lượng, hương vị hơn hẳn cây khóm trồng ở các vùng miền khác Khóm Cầu Đúc có vị ngọt thanh, ăn ít rát lưỡi, ăn giòn và ngọt, giàu chất khoáng và vitamin rất có lợi cho sức khỏe Do đó khóm Cầu

Đúc - Hậu Giang phù hợp làm nguyên liệu sản xuất rượu vang Vì vậy, đề tài ”Nghiên cứu quy trình lên men rượu vang khóm Cầu Đúc - Hậu Giang” được nghiên cứu 1.2 Mục tiêu của đề tài

Thiết lập quy trình sản xuất rượu vang khóm Cầu Đúc - Hậu Giang đạt hiệu quả

và chất lượng, góp phần đa dạng hóa sản phẩm thức uống từ nguồn nguyên liệu của địa phương

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây khóm

2.1.1 Nguồn gốc và chủng loại

Cây khóm (dứa) có tên khoa học là Ananas Comousus (L) Merr, họ

Bromeliaceae Khóm là cây ăn quả vùng nhiệt đới, nguồn gốc Nam Mỹ (Brazil, Paraguay) Trên thế giới, khóm được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới, các nước trồng nhiều là: Philippines, Thái Lan, Malaysia, Ở Việt Nam, khóm được trồng từ Bắc tới Nam, các tỉnh có sản lượng khóm cao: Tiền Giang, Kiên Giang, Ninh Bình, Nghệ An, Cây khóm sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-35oC, lượng mưa trung bình khoảng 1.500 mm/năm, độ pH từ 4,5 đến 5,5 kể cả trên đất phèn có pH bằng hoặc dưới 4 khóm vẫn sống tốt Cây khóm có thể trồng ở nhiều loại đất, đặc biệt nó có khả năng sinh trưởng, phát triển trên đất cằn khô

Theo Trần Thế Tục và Vũ Minh Hải (2000) các giống khóm hiện nay chia làm

3 nhóm chính là:

- Nhóm khóm Queen (Ananas comousus Queen): rất được ưa chuộng ở các

nước phương Tây Quả bé, mắt lồi nhưng có mùi thơm mạnh, thịt quả vàng đậm, giòn, chứa nhiều đường, giàu chất khoáng và vitamin rất có lợi cho sức khỏe Đặc biệt khóm Cầu Đúc tỉnh Hậu Giang đã vang danh khắp trong và ngoài nước

Hình 1: Khóm Cầu Đúc - Hậu Giang

(Nguồn:

http://www.favri.org.vn/vi/tin-tuc/tin-tuc-cap-nhat/873 ong-trum-khom-cau-duc.htm, ngày 06/12/2014)

- Nhóm khóm Cayen (Ananas comousus Cayenne): quả to, thịt quả vàng ngà,

chứa nhiều nước, ít ngọt, kém thơm hơn khóm Queen Trồng nhiều ở Kiên Giang, TP

Hồ Chí Minh, duyên hải Nam Trung Bộ

- Nhóm khóm Spanish (Ananas comousus Spanish): quả có kích thước trung

bình, mắt sâu, thịt quả vàng nhạt có chỗ trắng không đều, vị hơi chua nhưng chứa nhiều nước hơn Queen, có chất lượng kém nhất Nhóm này được trồng tập trung ở Vĩnh Phúc

2.1.2 Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng

Khóm là một loại nông sản vô cùng quan trọng, chỉ đứng thứ ba - sau chuối và các loạiquả họ citrus Tùy thuộc độ chín của quả, loại quả, điều kiện chăm sóc, kỹ thuật gieo trồng, thời tiết, thu hoạch và bảo quản quả Thành phần hóa học của quả được trình bày trong Bảng 1

Sắt 0,28 mg Vitamin E (alpha-tocopherol) 0,02 mg

Phospho 7 mg Fatty acids, total saturated 0,008 g Kali 124 mg Fatty acids, total monounsaturated 0,014g Natri 1 mg Fatty acids, total polyunsaturated 0,04

(Nguồn:http://ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/show/2385?fg=&man=&lfacet=&format=&count=&max= 25&offset=&sort=&qlookup=pineapple ngày 21/11/2014)

2.1.3 Các sản phẩm chế biến từ khóm

Khóm được lưu thông rộng rãi trên thế giới dưới dạng khóm hộp và nước khóm Khóm hộp gồm có khóm khoanh, khóm miếng, khóm nghiền, Nước khóm gồm nước khóm cô đặc và nước khóm thường

Theo PGS.TS Nguyễn Minh Thủy – Trường Đại học Cần Thơ (2013), ở Việt Nam khóm còn tạo ra các sản phẩm như: rượu vang, nước ép khóm, khóm sấy, bánh khóm, khóm tươi, khóm đóng hộp, mứt đông khóm,… Khóm còn có bromelin giúp cho việc tiêu hóa rất tốt Người ta đã chiết và sản xuất bromelin từ khóm dùng trong công nghiệp thực phẩm, thuộc da, vật liệu làm phim,

Một số biện pháp làm trong và ổn định sản phẩm rượu vang khóm Kết quả nghiên cứu cho thấy rượu vang khóm đạt chất lượng cao khi bổ sung enzyme pectinase 0,2% vào dịch khóm khoảng 20 giờ trước khi lên men Thanh trùng dịch lên men bằng metabisulfite natri 0,01% có thể tạo sản phẩm có độ rượu cao và hàm lượng đường sót thấp Bentonite (nồng độ 2%) được xem là chất làm trong hiệu quả rượu sau lên men

và rượu được ổn định (màu sắc) khi bổ sung 0,0025% acid ascorbic (Nguyễn Minh Thủy, 2013)

Ngoài ra còn có hàm lượng chất khô hòa tan từ 23-24oBrix, pH 4,5 và mật số nấm men 105-106 CFU/mL cũng làm tăng cao chất lượng của rượu vang khóm (hàm lương ethanol cao 15,3-15,95% v/v và hàm lượng đường sót thấp) Các chỉ tiêu chất lượng khác như hàm lượng acid bay hơi, ester, SO2 và methanol đều đạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7045:2009 (Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Minh Thủy, 2013)

2.2 Sơ lược về nấm men

2.2.1 Đặc điểm chung của nấm men

Theo Lương Đức Phẩm (2005), nấm men (yeast) chỉ là tên chung để chỉ nhóm

vi nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản bằng phương pháp nảy chồi hoặc phân cắt Nấm men sống đơn độc hay từng đám không di động, chúng phân bố rộng rãi khắp nơi, đặc biệt hiện diện nhiều trong đất trồng hoa quả và các nhà máy chế biến đường Ngoài ra, chúng còn xuất hiện trong trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang Trong môi trường dinh dưỡng có đủ oxy thì tế bào nấm men sẽ tăng sinh khối Trường hợp thiếu oxy nấm men lên men đường cho ra

rượu Nấm men lên men ethanol thường được phân lập từ quá trình lên men bã quả, mật rỉ của củ cải đường hay mía đường,…

2.2.2 Hình dạng và kích thước

Hình dạng: tế bào nấm men thường có hình cầu, hình ellipse, hình trứng (ovan),

hình bầu dục và cả hình dài Một số loài nấm men như Endomycopsis, Candida có tế

bào hình dài nối với nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn

ty giả (pseudomycelium) Hình dạng nấm men không ổn định phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy

Hình 2: Nấm men Saccharomyces

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?term=saccharomyces%20cerevisiae, ngày 18/6/2014)

Kích thước: kích thước trung bình của tế bào thay đổi trong khoảng chiều dài

9-10 µm và chiều rộng 2-7 µm Kích thước cũng thay đổi và không đồng đều ở các loài khác nhau, thay đổi theo điều kiện nuôi cấy và theo tuổi sinh lý Loài nấm men thường

được sử dụng trong sản xuất rượu, bia là Saccharomyces cereviceae có kích thước

khoảng 2,5-10 x 4,5-21 µm Thời gian thế hệ khoảng 120 phút (Nguyễn Lân Dũng, 1998)

2.2.3 Cấu tạo tế bào nấm men

Theo Nguyễn Lân Dũng (1998), tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau:

- Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Trong đó chủ yếu là glucan, mangan, protein, lipid và một số thành phần khác như kitin, volutin,

- Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid, emzyme permease,

- Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protein, glucid, lipid và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan bên trong

- Nhân tế bào: hình bầu dục, được bao bọc bởi dịch nhân

- Volutin: thường thấy trong không bào, không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chỉ xuất hiện khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydrate carbon và phosphate vô

cơ

- Những thành phần, cơ quan khác: không bào, ty lạp thể, lạp thể, ribosome,…

2.2.4 Sự sinh sản của nấm men

Theo Lê Xuân Phương (2001) nấm men có một số hình thức sinh sản sau:

- Sinh sản bằng cách nảy chồi: bình thường đến một giai đoạn nào đó, tế bào phân chia và tạo thành những tế bào con, lúc đầu những tế bào này nhỏ hơn tế bào mẹ, sau đó lớn dần, hoặc tách khỏi tế bào mẹ hoặc không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi trưởng thành tạo thành chuỗi tế bào gọi là khuẩn ty giả Đây là hình thức sinh sản vô tính chủ yếu ở nấm men

- Sinh sản bằng cách phân chia: một số loài phân đôi tế bào thành hai tế bào con, lúc đầu chất nhân phân chia làm hai phần, sau đó ở giữa tế bào xuất hiện thành tế bào, thành này lớn dần lên và màng nguyên sinh chất lọt vào trong Lúc này thành tế bào phát triển hoàn thiện chia tế bào mẹ làm hai tế bào con độc lập

- Sinh sản hữu tính bằng túi bào tử: bào tử túi của nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi gọi là túi nang (ascus) mỗi túi chứa 4 – 8 bào tử túi Túi bào tử có thể sinh ra theo ba phương thức:

+ Tiếp hợp đẳng giao: do 2 tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành

+ Tiếp hợp dị giao: do 2 tế bào nấm men có hình thái, kích thước khác nhau tiếp hợp với nhau tạo thành

+ Sinh sản đơn tính: tạo thành bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng lẻ không qua tiếp hợp

2.2.5 Vai trò của nấm men

Theo Lương Đức Phẩm (2005), nấm men sinh ra enzyme có khả năng khử đường sucrose thành fructose và glucose Vì vậy trong lên men rượu ta có thể bổ sung loại đường này vào dịch quả

Trong quá trình lên men, bên cạnh ethanol được tạo ra thì các sản phẩm khác như glycerol, ester (góp phần tạo hương vị cho rượu), các acid hữu cơ,… cũng được tạo ra Việc tạo ra các sản phẩm này là tùy thuộc vào chủng mấm men và điều kiện lên men Vì thế, để có mùi vị đặc trưng thì cần chọn chủng nấm men thích hợp cho từng sản phẩm

2.2.6 Các chủng nấm men thường sử dụng trong sản xuất rượu vang

Saccharomyces uvarium: nấm men này được phân lập từ quả nho và nước quả

lên men tự nhiên, về hình thái nó không khác các loại nấm men khác, chủng này có thể

sử dụng được các loại đường glucose, fructose, saccharose, maltose và galactose để lên men và tạo độ rượu từ 12-13%

Saccharomyces ovifomis: về hình thái các chủng này có hình dang ellipse hoặc

ellipse kéo dài Chúng có khả năng lên men được nhiều loại đường glucose, fructose,

saccharose, maltose nhưng chúng không có khả năng lên men galactose

Saccharomyces cerevisiae: là tế bào hình cầu, hình trứng hay hình oval, có kích

thước nhỏ thay đổi từ 2,5-10 µm, sinh sản bằng cách nẩy chồi và tạo bào tử Chủng

này có khả năng lên men đường glucose, fructose, saccharose, maltose và galactose S

cerevisiae có tính kỵ khí không bắt buộc, chúng có khả năng hô hấp và lên men Khi

lên men tạo thành đám tế bào nổi trên bề mặt nên gọi là nấm men nổi S cerevisiae là

loại nấm men quan trọng nhất trong quá trình lên men rượu vang (Fleet và Heard, 1993) Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm đến 80% tổng

số nấm men có trong nước quả lên men (Lương Đức Phẩm, 2005) Các loài nấm men

thuộc chi Saccharomyces được cho là có khả năng chịu được tính kháng khuẩn của

SO2 cao hơn các loài khác và hàm lượng rượu lớn hơn so với quá trình lên men tự nhiên (Eugene et al., 2007) Loài này lên men rượu có nồng độ tới 16% v/v, nếu dịch lên men này là đường hay siro có thể làm cho nấm men tạo ra 18% v/v rượu hoặc cao hơn (Pretorius, 2000) Hàm lượng protein của nấm men này thông thường cao hơn 60%, với hàm lượng acid amin tương đối như lysine, tryptophan, threonine, giàu vitamin nhóm B với hàm lượng acid nucleic dao động từ 4-10% (Boze et al., 1992)

Tại Việt Nam, S cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp

thực phẩm để sản xuất cồn, rượu, bia, Bên cạnh đó, việc tạo CO2 của nấm men còn

có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm nở bột được ứng dụng trong công nghiệp

làm bánh mì và các loại bánh khác làm cho bánh có cấu trúc xốp, nhẹ S cerevisiae

cũng được dùng nhiều trong sản xuất thịt nhân tạo và các enzyme khác nhau (Lê Xuân

Phương, 2001) Trong những năm gần đây, S cerevisiae cũng được sử dụng nhiều

trong nuôi trồng thủy sản như một chất kích thích miễn dịch của tôm, cá nuôi, cải thiện

hệ tiêu hóa, tăng năng suất nuôi

2.3 Giới thiệu về rượu vang quả

2.3.1 Định nghĩa rượu vang quả

Rượu vang quả là loại rượu được sản xuất từ dịch trái cây không qua chưng cất

có độ rượu từ 10-18% Theo quy định thì đa số các nước sản xuất rượu vang chỉ được phép cho thêm đường và một số chất khác đã được xác định vào nước quả trước khi lên men Sau khi lên men, rượu được gạn lọc và ổn định, không được cho thêm bất cứ chất gì (đường, rượu, acid, chất màu, dầu thơm, ) vào để đảm bảo tính chất tự nhiên của sản phẩm (Vũ Công Hậu, 2004)

2.3.2 Thành phần hóa học của rượu vang

Bảng 2: Thành phần hóa học trong rượu vang

(Nguồn: Vũ Công Hậu, 2004)

Thành phần hóa học của rượu vang được trình bày ở Bảng 2, tuy nhiên tùy thuộc vào thành phần của nguyên liệu sử dụng, những biến đổi trong quá trình lên men, quá trình chín của rượu, hoạt lực của nấm men Thành phần chính của rượu vang bao gồm: rượu ethanol, đường, acid tổng số, tro và muối khoáng, chất gây mùi thơm, vitamine, polyphenol,

Phân loại rượu vang

Theo Bùi Ái (2003) có các phương pháp phân loại rượu vang sau:

* Phân loại theo màu sắc:

- Vang trắng: vang lên men từ các quả nho khi chín vỏ không màu hoặc màu lục nhạt, hoặc lên men từ các dịch quả khác mà không có xác quả

- Vang đỏ: vang lên men từ các quả nho khi chín có màu đỏ - tím ở những mức

độ khác nhau, hoặc lên men từ quả lấy cả dịch quả và xác quả

* Phân loại theo hàm lượng đường:

- Vang khô (khi lên men gần hết đường): chứa hàm lượng rượu ethylic tích tụ

do lên men có thể từ 9-14%, và hàm lượng đường sót lại không quá 3%

- Vang bán ngọt: ethylic từ 12-17%, đường từ 21-35%

* Về mặt công nghệ: sảm phẩm rượu vang được chia làm hai nhóm: nhóm vang

có gas (CO2) và nhóm vang không có gas

2.3.3 Quá trình sản xuất rượu vang quả

a Quá trình chọn nguyên liệu (Vũ Công Hậu, 2004)

Nguyên liệu là một yếu tố rất quan trọng trong sản xuất rượu vang và nhân tố quan trọng nhất trong lựa chọn nguyên liệu chính là chất lượng quả Trong công nghệ lên men, yêu cầu các loại quả đạt độ chín chế biến, có hương vị đặc trưng Ở độ chín chế biến hàm lượng đường tăng, hàm lượng acid giảm phù hợp với yêu cầu trong công nghệ lên men

Tiêu chuẩn chọn quả dùng trong chế biến rượu vang:

- Đường tổng số trong nước quả cao, độ Brix phải từ 20-22, đối với quả có độ Brix cao thì ta chỉ cần bổ sung một ít đường, nếu quả kém ngọt thì phải thêm khá nhiều đường, nếu không độ rượu sẽ thấp

- Hàm lượng acid hữu cơ tương đối cao, pH thấp (2,8-3,8) Nếu không có một lượng acid tối thiểu thì rượu sẽ lạt vì thiếu chua; quan trọng hơn, nếu thiếu acid, pH cao thì tạp khuẩn phát triển mạnh gây khó khăn cho hoạt động của nấm men Nhưng nếu lượng acid này quá cao cũng không tốt vì sẽ khó lên men và rượu khó uống

- Thành phần của nước quả thích hợp cho hoạt động của men với một lượng tối thiểu các chất sau: acid amin, vitamin, muối khoáng thực hiện vai trò xúc tác với một

lượng rất nhỏ, polyphenol - tannin làm cho rượu có màu sắc hấp dẫn và đóng góp vào việc ức chế hoạt động của vi khuẩn có hại

b Khái quát quá trình lên men (Farkas, 1988)

Lên men là một quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của vi sinh vật) Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí

và lên men hiếu khí

- Lên men hiếu khí: là sự thủy phân đường với sự có mặt của O2 như quá trình lên men acid acetic, acid citric,

- Lên men yếm khí: là sự thủy phân đường không có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men lactic, lên men rượu ethylic, butylic, Quá trình lên men rượu, bia hay còn gọi là quá trình rượu, cồn hóa đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu ethylic và CO2

Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm 2 thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2, tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng)

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

Cơ chế lên men rượu

Sản xuất rượu vang dựa trên cơ sở các quá trình hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng enzyme của nấm men

Trong quá trình lên men, đường trong dịch quả được nấm men sử dụng để tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm Nấm men đóng vai trò chủ chốt trong việc biến đường thành rượu Song song với quá trình này là quá trình chuyển hóa đường, các acid hữu cơ thành các sản phẩm phụ khác

Rượu được tạo ra chủ yếu nhờ các tế bào nấm men phân giải glucose thông qua con đường Embden-Meyerhoff Quá trình lên men rượu là quá trình phức tạp Đầu tiên đường thẩm thấu vào tế bào nấm men, ở đó đường được chuyển hóa qua hàng loạt các

sản phẩm trung gian và tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic dưới tác dụng của enzyme pyruvate decarboxylase sẽ bị mất CO2 và tạo thành acetaldehyde

Sau đó, acetaldehyde bị khử thành ethanol và CO2 do enzyme alcohol dehydrogenase xúc tác Phương trình tóm tắt quá trình lên men rượu:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 +113,4 kJ Đường và các chất dinh dưỡng của môi trường lên men được hấp thu và khuếch tán vào tế bào nấm men qua màng tế bào Trong khi nước được tự do ra vào màng tế bào thì đường và các chất dinh dưỡng khác chỉ được màng tế bào cho đi vào và không cho đi ra Trong tế bào nấm men nhờ hoạt động sống của tế bào, hoạt động xúc tác của hàng loạt enzyme mà những phản ứng sinh hóa phức tạp xảy ra và dẫn đến tổng hợp chất này, phân hủy chất kia

Rượu ethanol và CO2 tạo thành liền thoát khỏi tế bào Rượu ethanol tan tốt trong nước do vậy nó khuếch tán rất nhanh vào môi trường xung quanh (Bruce, 1995) Trái với ethanol khí CO2 hòa tan vào môi trường không nhiều, khi đó CO2 sẽ bám vào các tế bào nấm men hình thành các bọt khí, những bọt khí này dính với nhau tạo thành những túi lớn, đến một lúc nào đó các tế bào nấm men sẽ nổi lên bề mặt, các túi khí vỡ

ra khí CO2 phóng thích ra bên ngoài và các nấm men chìm xuống Quá trình này diễn

ra liên tục nên các tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động làm gia tăng khả năng tiếp xúc của nấm men với môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng quá trình lên men

c Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men (Graham, 1993)

Nhiệt độ: thông thường nấm men hoạt động tốt nhất ở 20-30oC, dưới 16o

C lên men rất chậm, trên 35oC các hệ enzyme trong cơ thể nấm men bị giảm hoạt lực đến mức tối thiểu, hoạt động trao đổi chất bị ngưng trệ Nhiệt độ trên 40o

C nấm men bị chết do không tổng hợp được năng lượng cần thiết cho hoạt động sống Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất của nấm men Trong giới hạn nhiệt

độ nấm men hoạt động được, nhiệt độ lên men càng thấp thì thời gian lên men càng dài, hiệu suất chuyển hóa đường thành rượu sẽ cao, chất lượng rượu khi đó sẽ tốt hơn (còn gọi là lên men lạnh)

Lên men

Độ pH: pH thích hợp cho sự lên men là 4,0-4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở

pH 4,2 và cao hơn do đó nên thực hiện lên men trong giới hạn pH = 3,8-4,0

Nồng độ đường trong dung dịch lên men: đường là cơ chất của quá trình lên men nên ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men, nấm men có thể lên men đường thành rượu trong khoảng 22-25°Brix Hàm lượng đường tối đa 30%, khả năng lên men bắt đầu giảm Nguyên nhân là tế bào nấm men bị chết do hiện tượng co nguyên sinh

Nồng độ rượu ethylic: sản phẩm chủ yếu trong quá trình lên men kỵ khí là rượu ethylic Rượu ethylic sẽ ức chế hoạt động của tế bào nấm men, tuy nhiên mức độ ức chế khác nhau đối với các chủng nấm men khác nhau Nồng độ rượu khi đạt 5% thể tích ức chế khả năng sinh sản của nấm men Độ rượu đạt từ 7-8% thể tích thì sự trao đổi chất trong nấm men ngừng lại hầu như hoàn toàn

Ảnh hưởng của oxy: hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu thuộc chi

Saccharomyces Chúng là các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc Trong môi trường đủ

oxy nấm men phân hủy đường dùng làm nguồn năng lượng, cấu tạo tế bào và tăng sinh khối Trường hợp thiếu oxy hoặc không có oxy, nấm men sẽ chuyển từ hoạt động hô hấp sang lên men kỵ khí Khi đó sản phẩm trong môi trường lên men chủ yếu là ethylic

Nguồn nitơ: đa số trong nước có các hợp chất nitơ đủ cung cấp cho nấm men Song cũng có nhiều trường hợp vì hạn hán hoặc tùy từng loại quả không đủ nguồn nitơ cho nấm men sinh trưởng Do đó cần bổ sung thêm nguồn nitơ Trong trường hợp này người ta thường dùng amoni sulfat (NH4)2SO4

Thời gian lên men: quá trình lên men bao gồm lên men chính và lên men phụ, thời gian lên men được tính từ lúc cấy men giống vào môi trường lên men và kết thúc khi không còn bọt khí thoát ra Thời gian lên men thích hợp sẽ tạo ra rượu có độ cồn cao và ổn định Ở cùng nhiệt độ như nhau, pH khác nhau thì thời gian lên men khác nhau Nếu nhiệt độ là 25-30o

C và pH thích hợp thì thời gian lên men kéo dài từ 15-20 ngày Ở nhiệt độ cao 50-60o

C quá trình lên men sẽ ngừng lại, tế bào nấm men chết dần (Trần Minh Tâm, 2000)

2.3.4 Tình hình sản xuất rượu vang

có tên gọi duy nhất là Vang Alsace

Vùng Burgundy nằm ở miền trung nước Pháp với diện tích 47.700 ha Ở đây không có các vườn nho cỡ lớn mà chỉ có các vườn nho thuộc diện gia đình, diện tích khoảng 50 ha nhưng lại có đến 56 ông chủ Phần đông các chủ vườn đều bán nho cho các tiệm rượu để họ pha chế và bán ra thị trường

Vùng Bordeaux, sản xuất rượu vang nổi tiếng và quan trọng của Bordeaux là: Médoc, Haut Médoc, Graves Barsac, Sauternes, St Emilion, Pomerol, Cesrons, Loupiac, Pronsac, Bourg

Vùng Champagne, sản xuất rượu vang tinh tế, quý tộc mà không nơi nào trên thế giới bì kịp Nhờ vào giống nho, điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nhất là kỹ thuật sản xuất và kinh nghiệm nên nước Pháp đã sản xuất loại rượu vang đặc biệt này Phần lớn rượu Champagne được sản xuất từ giống nho đỏ thẫm Pinot Noir có chất đường, nước trắng nên độ rượu mạnh và giống như Chardonnay có màu vàng kim, đem lại vị thanh cao và hương thơm

Rượu vang Mỹ

Rượu vang thương phẩm (Branded Wine)

Rượu vang thông dụng (Generic Wine) như: Vang California Burgundy

Rượu vang pha trộn (Blended Wine), trên nhãn ghi America Wine

Rượu vang Đức

Rượu vang bàn (Deutcher Tafewein)

Rượu vang vùng (Landwein)

Rượu vang Qualitatswein bestimmer Anbuagebiete (QbA)

Rượu vang Qualitatswein mit Pradikat: là loại rượu vang chất lượng cao (QmP)

b Tại Việt Nam

Theo Hồ Thanh Trúc (2010), ở nước ta hiện nay có vài công ty sản xuất rượu vang nổi tiếng như:

+ Rượu vang Đà Lạt (Công ty Ladofoods)

+ Công ty liên doanh Việt - Đức (Van - Gres)

+Vang Thanh Long, vang Thành Long, vang Viết Nghi

- Những khó khăn trong sản xuất rượu vang ở nước ta:

+ Nho vùng nhiệt đới không cho sản phẩm rượu chất lượng cao

+ Nhiệt độ môi trường cao có ảnh hưởng không tốt đến nấm men vang

+ Thị trường tiêu thụ chưa mạnh

+ Thuế rượu nhập khẩu có xu hướng ngày càng giảm

- Tiềm năng phát triển:

+ Việt Nam là một quốc gia đông dân vì thế sức tiêu thụ rất lớn

+ Việt Nam không lạ lẫm với rượu vang bởi ảnh hưởng khá đậm nét của văn hóa Châu Âu, Châu Mỹ, nhất là văn hóa Pháp

+ Việt Nam đang là nước rất có tiềm năng trong thu hút khách du lịch quốc tế

c Một số nghiên cứu rượu vang trong nước

Rượu vang thanh long

Đề tài Khảo sát sự ảnh hưởng của một số chủng nấm men trong sản xuất rượu vang thanh long (Đàm Sao Mai et al., 2009) Kết quả nghiên cứu cho thấy, điều kiện cho sản phẩm rượu thích hợp nhất khi sử dụng phối hợp 50% nấm men

Saccharomyces ovitomis, 50% nấm men Saccharomyces vini, độ Brix ban đầu là 23,7

Sản phẩm rượu vang thanh long thu nhận đạt được hàm lượng ethanol (độ cồn) là 12%v/v, pH là 3,48; độ Brix 6,27

Rượu vang sơ ri

Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu sơ ri (Trần Thị Thùy Trang, 2003) Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là sơ ri, được thực hiện 15 tuần và cho ra những kết quả như sau: pH thích hợp lên men là 4,3; độ Brix là 22, thời gian kết thúc quá trình lên men là

14 ngày

Rượu vang mía

Đề tài Nghiên cứu quy trình sản xuất rượu vang mía (Lý Huỳnh Liên Hương et al., 2009) Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là nước mía, được thực hiện trong 6 tháng và cho ra kết quả như sau: nguồn nấm men sử dụng là nấm men thị trường với mật số là 106 tế bào/mL, thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140mg/L trong 30 phút, độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4, thời gian lên men là 5 ngày ở

30oC

Rượu vang bưởi

Đề tài Nghiên cứu chế biến rượu vang bưởi da xanh (Mai Thị Tươi, 2007) Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là bưởi da xanh, được thực hiện trong 3 tháng và cho ra những kết quả như sau: tỉ lệ pha loãng thích hợp cho quá trình lên men rượu là 1:0,5 (1 lít dịch quả thêm vào 0,5 lít nước), độ Brix thích hợp lên men là 22, pH tối ưu là 4,2; thời gian lên men là 8 ngày

Rượu vang chuối Xiêm

Đề tài Ứng dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối (Trần Ngọc Điệp, 2008) Đề tài có thể sử dụng nguồn nguyên liệu chuối Xiêm, thời gian thực hiện là 12 tháng và cho những kết quả như sau: việc sử dụng chết phẩm pectinase

ở nồng độ 0,02% và chitosan ở nồng độ 0,01% cho sản phẩm có độ trong tốt Tuy nhiên, sử dụng chitosan cho sản phẩm rượu trong hơn so với việc sử dụng pectinase Thời gian lên men phụ ít nhất là 2 tháng và nhiệt độ lên men thích hợp là 10oC

Rượu vang khóm

Đề tài So sánh và ứng dụng nấm men thuần trong lên men rượu vang khóm (Hứa Hữu Danh, 2011) Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu là khóm, được thực hiện trong 6 tháng và cho ra những kết quả như sau: mật số là 105 tế bào/mL, thanh trùng nguyên liệu bằng NaHSO3 140mg/L trong 30 phút, độ Brix thích hợp lên men là 25,

pH tối ưu là 4,19, thời gian lên men là 10 ngày ở 28-30o

C

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: từ tháng 06 đến tháng 11 năm 2014

- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Vật liệu

Khóm chín Cầu Đúc – Hậu Giang:

- Độ Brix ban đầu là 13-14,

- pH ban đầu là 3,8

- Khóm có khối lượng 500-600g có thể cho 400-450 mL dịch khóm

Nấm men thuần CKV1 thuộc chi Saccharomyces lưu trữ tại Viện NC&PT

CNSH, Trường Đại học Cần Thơ

Đường cát tinh luyện, khoai tây, agar,…

3.1.3 Dụng cụ thiết bị

Các thiết bị và dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm

- Máy ép nguyên liệu (Panasonic MJ- 68MWRA, Nhật)

- Tủ cấy vô trùng (Pháp)

- Kính hiển vi (Olympus Optical, BH-2, Nhật)

- Water bath & Shaker (Gesellschaft, Đức)

- Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)

- Nồi thanh trùng nhiệt ướt (Breukelen, Hà Lan)

- Tủ ủ vi sinh (Henrich, Đức)

- Cân điện tử với độ chính xác 0,01g (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)

- Máy đo pH với độ chính xác 0,01 (Jenway 9500, Anh)

3.1.4 Hóa chất

- Hóa chất thanh trùng NaHSO3 (Trung Quốc)

- Hóa chất điều chỉnh pH: acid citric, NaHCO3

- Môi trường nuôi cấy nấm men (glucose 2%, peptone 0,5%, yeast extract

0,5%)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ quy trình lên men rượu vang

Rượu vang khóm sẽ được lên men theo quy trình sau:

Hình 3: Quy trình lên men rượu vang

(Hứa Hữu Danh, 2011)

Giải thích quy trình: từ nguồn nguyên liệu khóm ban đầu, gọt bỏ vỏ, rửa sạch,

ép lấy nước và lọc sạch bã Tiến hành đo độ Brix, bổ sung đường kiểm tra lại độ Brix

và chỉnh pH phù hợp với từng yêu cầu thí nghiệm Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ Bổ sung nấm men theo tỷ lệ 1 mL dịch nấm men cho

99 mL dịch khóm Quá trình lên men được tiến hành trong bình tam giác 250 mL với

100 mL dịch lên men từ 10-12 ngày Đậy bình bằng water-lock Sau đó sẽ tiến hành lọc, làm trong sản phẩm, để sản phẩm ổn định Cuối cùng ta được thành phẩm rượu vang khóm

Thu hoạch bột men thuần

Hình 4: Quy trình sản xuất bột men từ nấm men Saccharomyces cerevisiae

(Ngô Thị Phương Dung, 2010)

Tiến hành: xay nhuyễn 200g gạo đã được sấy ở 100oC trong 17 giờ và cho vào mâm inox, để nguội đến nhiệt độ 30-40oC Chủng men giống S cerevisiae được tăng

sinh trong 100 mL môi trường nuôi cấy nấm men trong 24 giờ (mật số tế bào đạt 106tb/mL), bổ sung khoáng (glucose 1%, (NH4)2SO4 0,2%, MgSO4 0,05%, CaSO4 0,02%,

Bổ sung khoáng

KH2PO4 0,1%, nước cất), nước muối sinh lý 0,85% tạo ẩm cho bột (khoảng 40%) Cho các mâm vào bọc, dùng que sắt nhọn đã khử trùng đục lỗ trên bọc và đem ủ ở 30oC trong 2 ngày Thu hoạch khối bột đã ủ men, đánh tơi khối bột, sấy khô bột ở 42o

C trong 17 giờ, xay bột và rây qua lỗ rây có đường kính 0,5 mm, thu hoạch bột men thuần và trữ trong bao PP ép miệng, trữ ở điều kiện môi trường xung quanh

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu

Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix và pH nhằm tìm được giá trị của độ Brix và pH thích hợp cho lên men rượu vang khóm

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại:

độ Brix: 24, 26, 28 và 30; pH dịch quả: 3,5; 4,0; 4,5 và pH tự nhiên của dịch quả Tổng

số nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức

Thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48

Tiến hành: cho vào bình tam giác 99 mL dịch khóm với pH và hàm lượng đường như bố trí thí nghiệm Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ Chủng 1 gram bột men đã sản xuất vào mỗi bình tam giác Đậy kín bình bằng water-lock và cho lên men trong 11 ngày ở nhiệt độ phòng

Chỉ tiêu theo dõi: độ Brix, pH, xác định độ rượu (ở 20oC) sau lên men bằng phương pháp chưng cất Xử lý thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS XVII

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men

Mục đích thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men rượu vang khóm

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng (30-32o

C), nhiệt độ phòng mát (22oC); thời gian lên men: 7, 9, 11, 13 ngày Tổng số nghiệm thức: 2 x 4 = 8 nghiệm thức Thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24

Tiến hành: cho vào bình tam giác 99 mL dịch khóm với pH và hàm lượng đường thích hợp ở thí ngiệm 2 Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ Chủng 1 gram bột men đã sản xuất vào mỗi bình tam giác Đậy kín bình bằng water-lock và tiến hành lên men ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men theo bố trí thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: độ Brix, pH, xác định độ rượu (ở 20oC) sau lên men bằng phương pháp chưng cất Xử lý thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS XVII

b Điều vị

Mục đích thí nghiệm: tạo hương vị hài hòa cho sản phẩm, nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm rượu vang khóm

Thực hiện điều vị theo 2 hướng:

 Tỷ lệ phối chế vào rượu 29% v/v:

 Điều vị với ethanol:

Điều vị

Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố có 3 mức độ rượu điều vị (24, 29 và 35% v/v)

Tiến hành: Dịch khóm được cho vào các bình tam giác Sau đó cho tiếp cồn thực phẩm (43% v/v) vào mỗi bình để đạt được các nồng độ 24, 29 và 35% v/v

Dung dịch lên men có độ Brix, pH phù hợp qua kết quả thí nghiệm 2; nhiệt độ

và thời gian phù hợp qua kết quả thí nghiệm 3 Sau đó cho lên men với lượng lớn và điều vị bằng cồn thực phẩm

Dịch lên men được điều vị theo hệ phương trình:

Trong đó:

x: thể tích rượu vang trong 1 lít rượu thành phẩm (sau điều vị)

y: thể tích rượu nếp dùng điều vị trong 1 lít rượu thành phẩm

a: nồng độ rượu vang ban đầu chưa điều vị

b: nồng độ rượu nếp dùng điều vị

d: nồng độ rượu cần đạt được sau điều vị

Sau khi điều vị sản phẩm được đánh giá cảm quan để đánh giá chất lượng và sự chấp nhận của sản phẩm Xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL 2010

Các chỉ tiêu vi sinh theo TCVN 7045:2002

Định lượng E coli

Định lượng Coliforms Tổng số vi sinh vật hiếu khí

Các chỉ tiêu hóa lý theo QCVN 6-3:2010/BYT

pH, Brix Hàm lượng ethanol Hàm lượng methanol Hàm lượng acid tổng Hàm lượng SO2Hàm lượng acetaldehyde

Các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 3217:1997

Màu sắc và độ trong Mùi và vị

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Sản xuất bột men

Nấm men được nuôi trong bình 250 mL với 100 mL môi trường, dịch huyền phù nấm men sau thời gian nuôi cấy được trộn với bột gạo với tỷ lệ 1:1, sấy khô ở

42oC và xay nhỏ Bột men thuần được trữ dưới điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên

và chứa trong bọc PP, ép miệng

Bột men được pha loãng đến nồng độ 10-7 Lấy 0,1 mL dịch pha loãng ở các nồng độ cấy trãi trên môi trường YPD-agar Ủ ở 30oC trong 48 giờ và đếm mật số Kết quả xác định được mật số nấm men là 2,4x108

CFU/g

4.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu

Kết quả khảo sát các nhân tố độ Brix và pH ban đầu lên quá trình lên men rượu

vang khóm được trình bày trong Bảng 3

Bảng 3: Kết quả độ rượu, pH, Brix sau lên men Nghiệm thức Tổ hợp Brix-pH Brix sau

*Ghi chú: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại có cùng

ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%

Từ kết quả ở Bảng 3 cho thấy độ rượu chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố độ Brix

và pH ban đầu Độ Brix giảm vì nấm men sử dụng đường trong dịch ép khóm chuyển hóa thành rượu, pH có sự thay đổi về khoảng pH 4-4,3 vì đây là khoảng pH thích hợp cho lên men rượu vang Dựa vào thống kê giá trị trung bình của độ rượu sau 3 lần lặp lại trên nhân tố độ Brix, pH ở Bảng 3 và kết quả đánh giá cảm quan ở Bảng 4 cho thấy:

- Với những nghiệm thức có cùng độ Brix, pH ban đầu thay đổi, thì nồng độ ethanol được tạo ra cao nhất ở mức pH ban đầu là 4 Ở 24o

Brix, độ cồn là 12,75% v/v đồng thời cho kết quả đánh giá cảm quan cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,6/5 điểm; mùi là 4,6/5 điểm; vị là 4,2/5 điểm) Ở nghiệm thức 26oBrix, độ cồn là 13,82% v/v và kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,5/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị

là 4,2/5 điểm) Độ Brix là 28 thì độ cồn là 15,12% v/v ở mức pH 4 tuy nhiên kết quả đánh giá cảm quan thấp hơn mức pH 3,5 do vị đắng hơn Khi Brix lên đến 30, độ cồn

là 16,16% v/v, kết quả đánh giá cảm quan bằng với nghiệm thức 14 có Brix là 30 và

pH 3,5 (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm) Từ kết quả so sánh cho thấy kết quả nồng độ ethanol cao và vị của sản phẩm được ưa thích ở mức pH ban đầu là 4

- Cũng giống như độ Brix, những nghiệm thức có cùng mức pH ban đầu, độ Brix thay đổi, thì nồng độ ethanol được tạo ra cao nhất ở 30oBrix Mức pH tự nhiên của dịch khóm cho độ cồn là 12,49% v/v và kết quả đánh giá cảm quan cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,3/5 điểm; mùi là 4,3/5 điểm; vị là 3,6/5 điểm) Ở mức pH 3,5, giá trị

độ cồn là 12,53% v/v, kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm) Ở mức pH 4 thì độ cồn đạt được là 16,16% v/v đồng thời kết quả đánh giá cảm quan cũng cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm) Cuối cùng, ở mức pH 4,5 thì độ cồn là 13,69% v/v, kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,1/5 điểm; vị là 3,5/5 điểm) Như vậy, nồng độ ethanol cao và vị của sản phẩm được ưa thích ở độ Brix ban đầu là 30

Vậy độ Brix ban đầu là 30 và pH ban đầu là 4 là thích hợp cho quá trình lên men, độ cồn đạt cao nhất là 16,16% v/v

Bảng 4: Kết quả đánh giá cảm quan

*Ghi chú: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại có cùng

ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%

Theo nghiên cứu của Hứa Hữu Danh (2011), với mức pH ban đầu là 4,19 và độ Brix ban đầu 25 là tối ưu nhất cho quá trình lên men, nồng độ ethanol cao nhất là 13,64% v/v Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Đinh Thị Kim Lan (2011) nồng độ ethanol cao nhất là 14,94% v/v khi mức pH ban đầu là 4,57 và Brix ban đầu là 23 Như vậy theo kết quả nghiên cứu hiện tại pH ban đầu là 4 thấp hơn so với hai nghiên cứu

trên nhưng gần với pH tự nhiên của dịch khóm (pH 3,86), Brix ban đầu là 30 cao hơn Brix của hai nghiên cứu trên nhưng cho độ cồn cao nhất là 16,16% v/v

Qua kết quả so sánh cho thấy nghiệm thức 15 với độ Brix là 30oBrix và pH ban đầu là 4 cho độ cồn cao nhất 16,16% v/v được chọn với độ tin cậy 95% Đồng thời, kết quả đánh giá cảm quan ở Bảng 4 cũng cho thấy khi lên men với 30oBrix và pH là 4 cho kết quả cảm quan cao Do đó, theo mục đích của thí nghiệm, các nhân tố độ Brix

và pH ban đầu để có độ rượu cao lần lượt là 30o

Brix và pH 4

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men

Trong thí nghiệm này, dịch khóm được tiến hành lên men với thời gian 7, 9, 11

và 13 ngày tại các điều kiện nhiệt độ phòng (30-32o

C) và phòng mát (22oC) Các giá trị độ Brix và pH ban đầu được điều chỉnh theo kết quả tối ưu ở thí nghiệm trên Kết

quả sau lên men được trình bày trong Bảng 5

Bảng 5: Kết quả độ rượu, pH, Brix sau lên men theo thời gian và nhiệt độ Nhiệt độ lên

men ( o C)

Thời gian lên men (ngày)

pH sau lên men

Brix sau lên men

*Ghi chú: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại có cùng

ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%

Độ rượu tỷ lệ thuận với thời gian lên men, nhưng tỷ lệ nghịch với nhiệt độ môi trường lên men Kết quả thống kê ở Bảng 5 cho thấy:

- Khi lên men rượu vang khóm ở nhiệt độ phòng (30-32oC), độ rượu tăng theo thời gian lên men, độ rượu (quy đổi về độ rượu ở 20oC) thấp nhất là 10,32% v/v ứng với thời gian lên men 7 ngày, thời gian lên men tăng lên 13 ngày độ rượu của sảm phẩm tăng thêm 4,88% v/v, đạt 15,2% v/v

- Khi hạ nhiệt độ môi trường xuống nhiệt độ phòng mát (22oC) độ rượu vẫn tăng theo thời gian, sau thời gian 7 ngày lên men cho độ rượu đạt 11,85% v/v, tăng thêm 4,42% v/v và đạt 16,27% v/v khi cho lên men 13 ngày

Ở các khoảng thời gian 7, 9 và 11 ngày không thích hợp cho việc lên men rượu vang khóm Vì chủng nấm men CKV1 lên men chậm nên không phù hợp khi lên men trong thời gian ngắn Do đó thời gian lên men 13 ngày là phù hợp cho quá trình lên men rượu vang khóm

Sau khi lên men 13 ngày thì độ rượu ở mức nhiệt độ phòng (15,2% v/v) thấp hơn 1,07% v/v so với độ rượu ở mức nhiệt độ phòng mát (16,27% v/v) Vậy với các nhân tố nhiệt độ phòng mát là 22oC và thời gian là 13 ngày thì cho độ rượu cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với độ tin cậy 95% so với các nghiệm thức còn lại và cho vị ngon hơn

Tóm lại, thời gian lên men là 13 ngày, nhiệt độ phòng mát 22oC, độ Brix

30oBrix, pH 4 là điều kiện thích hợp để tiến hành lên men rượu vang khóm

4.4 Sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng mẻ rượu 2 lít và 5 lít

4.4.1 Sản xuất thử nghiệm mẻ rượu 2 lít và 5 lít

Các giá trị độ Brix, pH ban đầu, thời gian và nhiệt độ được điều chỉnh theo kết quả ở thí nghiệm 2 và 3 Tiến hành lên men mẻ 2 lít và 5 lít ở quy mô phòng thí

nghiệm cho được kết quả như Bảng 6

Bảng 6: Kết quả độ rượu sau khi lên men mẻ rượu 2 lít và 5 lít

đánh giá cảm quan ở Bảng 7 gần như tương đương, độ chênh lệch các chỉ tiêu ở 2

nghiệm thức không cao màu sắc và độ trong 0,2 điểm, mùi 0,25 điểm, vị 0,1 điểm

Bảng 7: Kết quả đánh giá cảm quan ở mẻ 2 lít và 5 lít

Bảng 8: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang khóm

Chỉ tiêu chất lượng Điểm trung bình chưa

có trọng lượng

Hệ số quan trọng

Điểm đã được hiệu chỉnh

và 25% Hoặc sử dụng cách thứ 2 là điều vị ethanol, cho dịch khóm vào các bình tam giác, sau đó cho tiếp cồn thực phẩm (43% v/v) vào mỗi bình để đạt được các nồng độ

24, 29 và 35% v/v Sau khi điều vị sản phẩm được đánh giá cảm quan để đánh giá chất lượng và sự chấp nhận của sản phẩm Vì 2 sản phẩm sau khi thêm 5% và 10% rượu