tiểu luận “ nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm metarhizium và khả năng diệt mối của bào tử nấ

Tiểu luận Đề tài: “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium và khả năng diệt mối của bào tử nấm qua lây nhiễm” Phần I Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Mối (isoptera) là loài côn trùng có phạm vi phân bố rộng, ưa nhiệt chúng sống ở vùng có điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng sống trong thân đê, thân đập, trong rừng, đồi, các thân cây gỗ, đồ dùng bằng gỗ , khác với nhiều loại côn trùng đơn sinh mỗi tổ mối là một “đơn vị sống” hoặc được coi là một “x• hội” riêng biệt, trong mỗi tổ mối tuỳ theo từng loài có từ vài trăm đến chục triệu con, chúng sinh sản rất nhanh và có phạm vi phân bố rộng. Trên thế giới đ• giám định được trên 2700 loài, ở nước ta đ• giám định được 106 loài. Thức ăn chủ yếu của mối là xenllulo cho nên người ta đ• khám phá được vai trò của mối như nó giúp cho sự phân huỷ thảm thực vật nhanh chóng, chúng góp phần cải tạo tính chất vật lí của đất thông qua việc đào bới thường xuyên. Ngoài ý nghĩa về mặt tự nhiên mối còn cung cấp nguyên liệu cho ngành y tế như làm thuốc chữa bệnh thấp khớp và tổ mối được các nhà kiến trúc sư áp dụng trong các công trình kiến trúc Nhưng xét về tổng thể thì mối vẫn là loài gây hại. Do mối là côn trùng chuyên dinh dưỡng trên các nguồn thức ăn có chứa xenlullo nên mối gây hại nhà cửa, công trình xây dựng bằng gỗ, đê điều nhưng đặc biệt nguy hiểm hơn mối được xem là “ẩn hoạ thân đê”, đe doạ nghiêm trọng đến cuộc sống của con người. Theo nghiên cứu sơ bộ nước ta thì sức phá hoại của chúng thật ghê gớm. Ngoài ra, mối còn phá hại cây công nghiệp và cây hoa màu như: cao su, cà fê, chè, bông, cây lạc, sắn làm cho cây chết hoặc sinh trưởng kém, còi cọc từ đó ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây trồng. Trong các loài mối gây hại phải kể đến các loài mối nhà Coptotermes, chúng phá hại các trang thiết bị đồ dùng bằng gỗ, đặc biệt hơn là các di tích lịch sử. Hàng năm mối làm cho hàng chục ngôi nhà và các di tích lịch sử có nguy cơ bị sụp . Chính vì vậy chúng ta cần phòng và trừ mối. Hiện nay có nhiều phương pháp phòng và diệt mối như phương pháp hoá học, vật lý, thủ công… Tuy nhiên các phương pháp trên còn tồn tại những hạn chế. Phương pháp hoá học do thuốc không thể tác dụng trực tiếp đến tổ mối được, khó tìm tổ mối chính, mùi vị bị mối phát hiện nhanh chóng, chi phí cho mỗi lần như thế tốn kém, đồng thời dẫn đến tính kháng thuốc và nguy hiểm hơn là phương pháp này ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe con người và môi trường nếu lượng thuốc sau xử lí thừa hoặc phân huỷ không hết còn tồn dư lại. Phương pháp vật lí gặp khó khăn trong việc xác định tổ mối vì trên các con đê đập tổ mối thường nằm sâu trong lòng đất. Hiện nay, một hướng phòng trừ mối mới đang được mở ra đó là biện pháp phòng trừ sinh học, hiện nay phương pháp này đ• và đang có rất nhiều công trình khoa học ngiên cứu đ• chỉ ra rằng mối cũng bị kí sinh và gây bệnh do nấm (Metarhizium, Beauveria) và vi khuẩn Bacillus, gây ra. Trong các chủng vi sinh vật kể trên thì Metarhizium là chủng nấm có hiệu lực diệt mối mạnh nhất. Mặt khác bào tử nấm có kích thước bé (trung bình vài ) chúng lại không có mùi vị nên mối khó phát hiện. Cơ chế gây hại của bào tử nấm Metarhizium như sau: Khi bào tử nấm bám dính trên cơ thể mối, gặp điều kiện thích hợp sau 24 giờ sẽ nảy mầm thành ống đâm xuyên qua lớp vỏ kitin hút dinh dưỡng đồng thời tiết chất độc giết chết mối. Đây là cơ sở khả năng diệt mối một cách lâu dài, hiệu quả và rất an toàn đối với môi trường và con người. Đây là một phương pháp diệt trừ mối rất hay và đang là một hướng đi mới rất khả thi, tuy nhiên các công trình nghiên cứu trước chỉ mới giải quyết ở mức độ hoàn thành một khâu trong cả quá trình. Do vậy để khẳng định và đánh giá hiệu lực diệt mối của chế phẩm Metarhizium. Vì vậy chúng tôi quyết định thực hiện đề tài. “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium và khả năng diệt mối của bào tử nấm qua lây nhiễm” 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích: - Hoàn thành quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium (m4; m5) trong phòng trừ mối. - Đánh giá khả năng diệt mối bằng trực tiếp và lây nhiễm của chế phẩm Metarhizium (m4; m5) sau lên men kết hợp. 1.2.2. Yêu cầu: - Xác định được đặc điểm hình thái của nấm Metarhizium (M4; M5). - Quan sát sự phát triển của bào tử nấm Metarhizium trên môi trường nuôi cấy kết hợp khác nhau. - Xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố: Lượng mẫu, thời gian lên men kết hợp đến sự hình thành bào tử nấm Metarhizium. - Thử khả năng diệt mối của bào tử chủng Metarhizium (M4; M5) sau khi lên men kết hợp bằng phương pháp lây nhiễm và trực tiếp. Phần II Tổng quan tài liệu 2.1. Giới thiệu về Metarhizium anisopliae Sorok. 2.1.1. Sơ lược về lịch sử ra đời của Metarhizium. Từ những năm 70 của thế kỷ xix, các nhà khoa học trên thế giới đ• nghiên cứu và nhận thấy nhiều loại côn trìng bị nhiễm bệnh và chết bởi các chủng vi nấm thuộc lớp nấm bất toàn (Deutermyceter). Năm 1878, nhà bác học người Nga Metschnhikov trong khi nghiên cứu bệnh của bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phòng trừ đ• phát hiện bệnh “nấm xanh” (nấm Entomophthora, nay đổi tên là Metarhizium anisopliae). ông đ• cùng người học trò của mình là Isac Craxinstic nghiên cứu môi trường nuôi cấy loài nấm này cho việc thử nghiệm hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử thuần khiết và đem thử nghiệm sâu non bọ đầu dài (Boxthinoderes punctriventric) hại củ cải đường. Kết quả là sau khi dùng bào tử và chất bột nền để tung ra đồng ruộng diệt sâu non đ• cho hiệu quả gây chết 55-80% sau 10-14 ngày. Kể từ đó nhiều công trình nghiên cứu lớn, nhỏ về khả năng ứng dụng Metarhizium cho phòng trừ nhiều đối tượng gây hại khác nhau đ• được tiến hành. Cho đến nay đ• xác định được hơn 200 loài côn trùng là đối tượng tấn công của loại nấm này trong đó có cả loài mối là loại côn trùng đặc biệt nguy hại đối với chúng ta. 2.2.2. Đặc điểm hình thái của Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae thuộc họ moniliaceae, bộ nấm bông moniliales, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes (Fungi imperfecty), có kiểu phát sinh bào tử trần của nhóm Hyphomycetes [4]. Trong chi Metarhizium có hai loại nấm được xác định nhiều trong việc kí sinh gây bệnh cho côn trùng đó là Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride. Nấm Metarhizium có màu lục hoặc xanh lục nên người ta gọi là nấm lục cương. Đặc điểm hình thái: Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn, mọc tỏa tròn trên đầu sợi nấm dày đặc. Bào tử trần hình que 3,5 x 6, 4 x 7,2 . Màu từ lục xám đến oliu đến lục. Bào tử xếp thành hình chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường người ta có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục [14]. Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh hoặc hồng. Chúng phát triển nhanh trên môi trường Czapek- Dox khi nuôi ở nhiệt độ 28oC (nuôi trong tủ định ôn) sau 8 – 10 ngày nuôi cấy thì khuẩn lạc có đường kính 7 - 8,5 cm. Loại nấm Metarhizium anisopliae có hai loài là dạng bào tử nhỏ và lớn. Tuy nhiên Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất trên côn trùng thuộc bộ cánh cứng Coleoptera. 2.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hoá của Metarhizium anisopliae. Nấm Metarhizium anisopliae sinh trưởng rất tốt trên nền cơ chất có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng ở nơi tích lũy nhiều CO2và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày. ở nhiệt độ nhỏ hơn 100C và lớn hơn 450C thì nấm không thể hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 280C và pH = 6,8 - 70 hoặc dao động từ 3,3 – 8,5. Nấm có khả năng phân giải xenlulose và kitin (lông và lớp vỏ ngoài của côn trùng) [14]. Độc tố diệt côn trùng của nấm: Gồm một số độc tố có tên là DestruxinA, B, C, hay D. Các ngoại độc tố này là sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyn, L –leucine, anhydrie, L-prolyn, L-valine anhydride và Desmethyl Destruxin B [12]. 2.1.4. Cơ chế gây bệnh của Metarhizium Bào tử nấm phát tán trong gió hoặc lây nhiễm qua tiếp xúc giữa các cá thể mang mầm bệnh. sau khi bám vào cơ thể côn trùng, gặp ẩm độ nhiệt độ thích hợp (xâm nhập qua đường hô hấp) bào tử nấm nảy mầm tiết ra độc tố Destruxin làm tê liệt hệ thần kinh côn trùng và sử dụng dinh dưỡng của côn trùng từ đó làm cho các cơ hệ cơ quan côn trùng suy yếu dần đi và chết sau 2-5 ngày phụ thuộc vào kích cỡ của côn trùng. Xác côn trùng chết thường khô, không có mùi thối. Sau vài ngày sợi nấm sẻ đâm qua lớp vỏ kitin lại phát tán bào tử ra ngoài và tiếp tục một chu trình gây bệnh mới với côn trùng kế tiếp. 2.2. Tình hình nghiên cứu sử dụng Mertarhizium trong phòng trừ mối 2.2.1. Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium trên thế giới Những năm cuối của thế kỷ xx, rất nhiều công trình nghiên cứu đ• khẳng định trong điều kiện tự nhiên vi nấm là một nhân tố gây chết quan trọng đối với nhiều loài côn trùng. Mỗi nhóm côn trùng có thể bị ảnh hưởng bởi một số vi nấm nhất định. Người ta đ• xác định hơn 700 loài vi nấm là mầm bệnh cho các loài côn trùng. Tuy nhiên, căn cứ vào mức độ gây chết, điều kiện nuôi cấy, điều kiện sản xuất và phổ tác dụng, người ta chỉ tập trung nghiên cứu vào 4 nhóm vi nấm: Metarhizium, Beauveria, Verticilum và Paecilomyces [14], [15]. Metarhizium được xác định là mầm bệnh nguy hiểm của hơn 200 loài côn trùng. Tuy Metarhizium chỉ có 3 loài nhưng lại có rất nhiều chủng khác nhau và mỗi chủng thích nghi cao đối với nhóm côn trùng xác định. Trong nghiên cứu ứng dụng, vấn đề quan trọng hàng đầu là phải tuyển chọn được các chủng thích nghi, có hiệu lực cao đối với một nhóm côn trùng xác định (Hanel 1982, Tanada và Kaya 1993) theo Milner và cộng sự [15]. Những năm gần đây, xuất hiện ngày càng nhiều các công trình nghiên cứu sử dụng vi nấm để diệt trừ côn trùng, nhất là nghiên cứu sử dụng Metarhizium để phòng trừ mối. và kết quả là 11 chế phẩm vi nấm diệt côn trùng đ• được đưa vào sử dụng, trong đó có 3 chế phẩm Metarhizium: chế phẩm BioBlast của Mỹ dùng để diệt mối đất Đài Loan (Coptotermes formosanus); chế phẩm GreenMuscle của Nam Phi để diệt châu chấu (Locusts); chế phẩm BioGreen của úc để diệt bọ ngô đầu đỏ (Red- headed cokchafer). ở úc, nhóm nghiên cứu thuộc viện nghiên cứu côn trùng của thành phố Canbera, do tiến sỹ Milner (1998) chủ trì đ• nghiên cứu tuyển chọn từ 97 chủng Metarhizium, phân lập từ các nguồn khác nhau, nhưng chỉ có 2 chủng FI-1186 và FI- 610 là có hiệu lực mạnh và ổn định đối với 2 loài mối Nasutitermes exitosus và Coptotermes lacteus. Họ đ• tiến hành hàng loạt thí nghiệm và cho thấy rằng nấm không lây nhiễm vào các vật chủ bằng con đường tiêu hóa, mà nó trực tiếp xâm nhập qua vỏ cơ thể, cho nên cả ấu trùng còn non cũng có thể bị tiêu diệt. Xác mối bị chết do nấm sẽ khô cứng, đầy sợi nấm trắng, sau đó tạo thành thế hệ bào tử mới màu xanh đậm. Các bào tử chỉ nảy mầm khi gặp độ ẩm cao và thời tiết thích hợp. Tuy nhiên các thử nghiệm này mới chỉ được thực hiện trong phòng thí nghiệm ở quy mô nhỏ. Tại Canada, nhóm nghiên cứu do tiến sỹ Bary H.Track (1999) đứng đầu thuộc phòng thí nghiệm côn trùng học, trường đại học tổng hợp Toronto đang thử nghiệm một số chủng nấm Metarhizium để diệt các loài kiến và loài mối Reticulitermes flavipes (loài mối gây hại nghiêm trọng cho công trình kiến trúc ở thành phố Toronto). Họ đ• phân lập được một số chủng vi nấm của loài Metarhizium anisopliae có hoạt lực cao với mối Reticulitermes flavipes. Họ quan sát thấy bào tử vi nấm bám lên vỏ cơ thể của mối, mọc xuyên vào các mô và hệ tuần hoàn, rồi giết chết mối trong vòng 24-48 giờ, tùy thuộc vào liều lượng và tác dụng. Bào tử vi nấm có thể lây truyền từ cá thể này sang cá thể khác thông qua hàng loạt các hoạt động tiếp xúc trực tiếp với nhau giữa các cá thể trong quần thể như việc trao đổi thức ăn, sự tiêu thụ chất tiết, việc làm vệ sinh cho nhau Vấn đề đang được họ quan tâm là nghiên cứu khả năng phát hiện và ngăn chặn các con mối đ• bị nhiễm bào tử vi nấm của quần thể mối. ở Mỹ, tại trung tâm của hiệp hội nghiên cứu mối ngầm Đài Loan, M. Guadalupe Rojas và cộng sự (2000), đ• chứng minh các bào tử của các loài vi nấm này có thể bám vào vỏ kitin của cơ thể mối Coptotermes formosanus để nảy mầm, sau đó sợi nấm phát triển đâm xuyên vào cơ thể mối và diệt mối rất tốt. Họ khẳng định bào tử nấm không độc với người, động vật và môi trường. Hướng nghiên cứu của họ là sử dụng bào tử vi nấm trộn với diflubensuzon trong các vị trí đặt bả hỗn hợp. Năm 2002, Tiến sỹ Haimanot Abebe đ• tiến hành thử nghiệm bào tử Metarhizium trên mối Macrotermes subhyalinus ở vùng Lenkemt Zuria (Ethiopia). Ông đ• thử nghiệm bào tử ở ba nồng độ là 4,6; 9,3 và 20 gram bào tử / tổ, các tổ Macrotermes thử nghiệm có tuổi từ 2 đến 3 năm. Sau 60 ngày thử nghiệm tỷ lệ mối chết đạt 61%, 64% và 74% ở các nồng độ tương ứng. Sau 75 ngày tác giả còn quan sát thấy nấm Xylaria mọc trên các tổ mối đ• thí nghiệm. Tại hội nghị hoá học của mỹ tháng 4/2002 người ta đ• đưa ra và nhất trí là phải thay thế các phương pháp phòng trừ mối và côn trùng, hiện nay bằng b• mối và các chế phẩm sinh học như vi nấm Metarhizium, beauveria và vi khuẩn bacillus. Chế phẩm Bio Blast của mỹ do Ecoscience sản xuất bán ra thị trường dựa vào kết quả thử nghiệm trên mối Coptotemes fomosanus ở 1000 điểm khắp 11 bang bị mối hại ở nước mỹ, chế phẩm này được sản xuất theo phương pháp lên men xốp và được sử dụng ở hai dạng bột mịn và huyền phù, hiện nay người ta đang tiến hành nghiên cứu cho thêm chất phụ gia để tăng tính dính bám và làm sao đưa được lượng bào tử Metarhizium vào ít nhất là 10% số cá thể của quần thể mối. 2.2.2. Nghiên cứu ở trong nước Việc nghiên cứu nấm gây bệnh trên côn trùng đ• được các cán bộ khoa học kỹ thuật ở một số trường đại học và viện nghiên cứu bắt đầu tìm hiểu và đi sâu nghiên cứu chúng từ những năm 70 của thập kỷ XX. Theo Phạm Bình Quyền (1994), cơ sở khoa học của phòng trừ sinh học, phòng trừ tổng hợp là hiểu đúng quy luật cơ chế tự nhiên của sự điều chỉnh số lượng côn trùng, nhằm sử dụng tối ưu các cơ chế đó vào việc hạn chế tác hại do côn trùng gây nên nói chung và mối nói riêng. Tác giả đ• phân tích rất sâu sắc quan hệ giữa vật chủ và vật ký sinh thông qua yếu tố quần thể của vật chủ và vật ký sinh. Đối với các nhóm côn trùng không có đời sống x• hội, vai trò điều chỉnh số lượng côn trùng của dịch bệnh thường chỉ thể hiện khi mật độ quần thể gia tăng đến mức gần cực đại [12]. Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục cương Metarhizium mô tả hình thái, phân tích cơ chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập, nuôi cấy và phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium [4]. Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy và cộng sự thuộc viện Bảo vệ Thực vật đ• phân lập, nuôi cấy và thử nghiệm các chủng Metarhizium thuộc 2 loài Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride để phòng trừ cho các loài sâu bọ hại cây nông, lâm nghiệp bằng phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium trên đồng ruộng [5], [6], [7], [8]. Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đ• phân lập, nuôi cấy một số chủng Metarhiziumanisopliae và thử nghiệm để diệt châu chấu di cư và các loài sâu bệnh hại cây nông nghiệp. Tác giả cũng thử nghiệm bào tử M. anisopliae trên mối Coptotermes formosanus và cho biết mối chết do nấm sau 3 ngày là 91,35% ở mật độ 18 x 107 bào tử / ml. Ngoài ra, tác giả còn thử nghiệm trên châu chấu di cư (Locusta mirgratioria) và hiệu quả đạt tới 92,2%. Năm 1997, Đại học Quốc gia Hà Nội đ• nghiệm thu đề tài: “Nghiên cứu vi nấm Metarhizium ansopliae chống mối hại cây trồng”. Trong đó đ• phân lập được nhiều chủng nấm có khả năng chống mối quan trọng và được bảo quản tại Bảo tàng giống vi sinh vật của trường. Năm 1998 Dương Ngọc Khê và cộng sự thuộc viện khoa học lâm nghiệp đ• nghiên cứu và tuyển chọn một số chủng nấm Metarhizium để thử khả năng diệt mối coptotemes fomosanus trong phòng thí nghiệm, các nghiên cứu đ• đưa ra được các chế phẩm LT50 , LT100 , LD50, LD100 của các chủng Metarhizium đ• tuyển chọn đối với Coptotemes fomosanus và cho biết có 3 chủng có hiệu lực diệt mối cao nhất [2] Phạm Thị Thùy và cộng sự (2002- 2003) đ• nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định bằng phương pháp phun trực tiếp. Kết quả cho thấy chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae đều có hiệu quả cao với sâu non và trưởng thành của bọ dừa, đặc biệt là hiệu quả kéo dài đến 8 tuần sau phun, hiệu quả thể hiện rõ khi cây dừa phục hồi màu xanh trở lại, điểm giá trị nhất của chế phẩm nấm là hiệu quả kéo dài, nấm không gây ô nhiễm môi trường và nguy hiểm đối với con người, không làm mất đi những loài kí sinh thiên địch có ích khác. Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh và cộng sự ở Trung tâm nghiên cứu phòng trừ mối đ• nghiên cứu tuyển chọn các chủng Metarhizium có hiệu lực cao để phòng trừ các loài mối gây hại điển hình ở nước ta, như loài mối nhà nguy hiểm nhất Coptotermes formosanus Shiraki; loài mối hại đê Odontotermes hainanensis và loài mối hại đập Macrotermes annandalei. Khi nuôi cấy trên môi trường Czapek - Dox và môi trường Sabouraud có bổ sung kitin đ• thu được hàng trăm gram bào tử với khối lượng trung bình từ 1,9 x 109 đến 8,25 x 1010 bào tử/g. Kết quả thử nghiệm trực tiếp và lây nhiễm đối với mối trong điều kiện phòng thí nghiệm và trên mô hình như sau [9], [10]. Từ 23 chủng vi nấm thu thập và phân lập từ các nguồn khác nhau đ• tuyển chọn được 9 chủng Metarhizium trong đó có 2 chủng phân lập từ tổ mối chết ngoài hiện trường có khả năng gây bệnh làm chết mối trong điều kiện phòng thí nghiệm. Với 3 chủng chọn lọc có hiệu lực diệt mối cao nhất là M1, M2, M3 thì LT50 đối với mối Coptotermes formosanus trung bình là 2,6 ngày sau khi nhiễm bào tử Metarhizium. Bào tử của các chủng M1, M2, M3 không chỉ có khả năng diệt mối C. formosanus khi tiếp xúc trực tiếp mà còn được truyền từ cá thể này sang cá thể khác trong đàn mối, tỷ lệ số cá thể mối bị nhiễm bào tử lúc đầu đóng vai trò quyết định. Hiệu quả của phương pháp thử nghiệm diệt mối C. formosanus bằng lây nhiễm bào tử M1 rất rõ ràng. Tỷ lệ nhà dân thử nghiệm hết mối đạt gần 90%. Kết quả này mở ra triển vọng trong việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt mối C. formosanus bằng lây nhiễm thay thế các biện pháp dùng hoá chất như hiện nay. Mối cánh O. hainanensis bị chết 100% sau 5 - 10 ngày ở trong đất đ• rắc bào tử M3 cho phép nghĩ tới khả năng nghiên cứu sản xuất chế phẩm để phun phòng mối cánh trên mặt đê vào mùa mối bay phân đàn. Một phần của kết quả nghiên cứu trên đ• được trình bày tại Hội nghị Quốc tế về Vi sinh vật tại Bangkok, Thái Lan tháng 7 / 2000. Năm 1997 đại học quốc gia hà nội đ• nghiệm thu đề tài “ nghiên cứu vi nấm Metarhizium anisopliae chống mối hại cây trồng”. Trong đó đ• phân lập được nhiều chủng nấm có khả năng chống mối quan trọng và được bảo quản tại bảo tàng giống vi sinh vật của trường. Đ• có nhiều công trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính của Enzym ngoại bào của các chủng nấm Metarhizium như là: - Năm 1995 tác giả Smithson S.L và cộng sự đ• nhân vô tính và đặc trưng của gen m• hoá enzym Protease phân giải cutin từ nấm gây bệnh cho côn trùng Metarhizium anisopliae [17]. - Năm 2000 tác giả Gillespie J.P; Charnley A.K đ• nêu vai trò của Protease phân giải cutin từ nấm gây bệnh cho côn trùng Metarhizium anisopliae. Mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sinh học trong việc phòng chống bệnh do côn trùng gây ra [18]. Mới đây, sinh viên Lê Thùy Quyên, trường é?i h?c Phuong éông, đ• nghiên cứu thành công d? tài: “Nghiên cứu công ngh? s?n xu?t ch? ph?m n?m Metarhizium anisopliae sorok d? ?ng d?ng phòng tr? sâu hại cây tr?ng”. Chế phẩm nấm Metarhizium từ nghiên cứu của Lê Thuỳ Quyên diệt trừ các loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn lá và đặc biệt là khả năng tiêu diệt được một số loài côn trùng hại cây sống trong đất như bọ hung, mối đất ứng dụng thực tế của nấm Metarhizium để tiêu diệt bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, bồ đề, hại cây điều, cây ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang hại cà chua cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%. Một hướng mới đang được các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất sinh khối của nấm Metarhizium trên các nguồn cơ chất rẻ tiền mà vẫn thu được sinh khối lớn [5]. Nghiên cứu sử dụng Metarhizium để phòng trừ mối là một hướng nghiên cứu đang được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Các kết quả nghiên cứu về phân lập, nuôi cấy, tuyển chọn và thử nghiệm bào tử thuần khiết để diệt trừ trực tiếp một cá thể mối nhất định trong điều kiện phòng thí nghiệm đ• làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh và hiệu lực diệt mối cao của nấm đối với mối. Tuy nhiên, điều quan trọng không chỉ là tuyển chọn được các chủng Metarhizium có hiệu lực diệt mối cao trong phòng thí nghiệm mà còn phải nghiên cứu được quy trình lên men để sản xuất thu bào tử được nhiều. Trong quá trình sản xuất thu bào tử phải sử dụng được nguồn nguyên liệu thô, rẻ tiền mà vẫn thu được lượng bào tử nhiều từ đó lựa chọn ra được môi trường thích hợp nhất để sản xuất trên qui mô rộng với một giá thành phải rẻ. Để lựa chọn được quy trình lên men kết hợp thích hơp cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng Metarhizium thì đề tài chúng tôi đáp ứng được một phần tuy nhiên để có quy trình lên men kết hợp thích hơp nhất thì cần nghiên cứu thêm. 2.2. Mối nhà Coptotermes foramsanus Shiraki Loài mối Coptotermes là giống mối phân bố rộng r•i trên thế giới. Chúng thuộc họ Rhinotermitidae hay còn gọi là nhóm mối ngầm đô thị (Urban subterranean termite). Đến nay đ• xác định được 28 loài thuộc giống mối này [1], [3]. Đặc trưng của giống mối này là mối lính có hình ovan hoặc hình trứng. Trên đầu có một lỗ trán lồi ra phía trước. Từ đó mối lính tiết ra dịch màu trắng sữa. Dịch này sẽ chuyển thành một chất co gi•n như cao su khi tiếp xúc với không khí. Râu có từ 14-16 đốt, tấm lưng ngực trước bằng phẳng. Mối cánh đầu hình trứng, râu có từ 18-23 đốt. Tấm lưng ngực trước hẹp hơn đầu, vẩy cánh trước hẹp hơn phía cánh sau, gân cánh hình lưới màu nhạt, mặt cánh có lông [1]. Coptotermes là giống mối gây nhiều thiệt hại cho con người do khả năng thích nghi cao với điều kiện môi trường. Chúng có thể tấn công trực tiếp các vật liệu, đồ dùng bằng gỗ hoặc đi xuyên qua mạch vữa xi măng mác thấp, đi ngầm dưới lớp bê tông, nhựa đường vào làm tổ trong các công trình xây dựng, gây ảnh hưởng đến sự ổn định, an toàn và mỹ quan công trình. Vì vậy, mối Coptotermes được xếp vào nhóm mối hại công trình xây dựng (còn gọi là mối nhà). Tuy nhiên, một số loài thuộc nhóm này còn gây hại cho cây và làm tổ trong thân đê, đập [11]. 2.2.1. đặc tích sinh học: Trong các loài thuộc giống Coptotermes thì Coptotermes formosanus Shiraki là loài có phân bố rộng nhất trên thế giới. Loài mối này có nguồn gốc từ Đài Loan (Trung Quốc), làm tổ ngầm trong đất và các cấu trúc khác của công trình, nên còn có tên gọi chung là mối ngầm Đài Loan (Formosan subterranean termite-FST). Nó được đưa vào nhật bản, Guam, Srilanka, Nam Phi và Mỹ sau chiến tranh thế giới thứ hai, những chiếc tàu thủy là phương tiện chở loài mối ngầm này phát tán đi khắp thế giới. Đến nơi ở mới, nhờ sự thích ứng cao và khả năng sinh sản lớn mối Coptotermes formosanus đ• nhanh chóng phát triển và mở rộng vùng phân bố của mình. Tuy mối Coptotermes formosanus là một loài bay yếu, nhưng với khả năng thay thế mối chúa và phân đàn nhanh chóng cùng với việc con người di chuyển đất vật liệu đ• bị nhiễm mối cũng góp phần tạo ra sự lan tràn trong nội địa của loài mối này. Phần lớn các đàn mối Coptotermes formosanus làm tổ ngầm dưới đất hay trong các cấu trúc công trình xây dựng. Tổ của chúng khá lớn, xốp thường có hình nón hoặc có thể có hình dạng khác phụ thuộc vào vị trí làm tổ, có màu nâu đen hoặc màu xám tro [1], [3]. Mối sử dụng chất tiết trộn với gỗ vụn và đất làm nguyên liệu xây tổ. Cấu trúc tổ tuân theo một quy định khá chặt chẽ. Các cột đất được xây theo dạng những “cánh sao” và được nối với nhau một cách tinh vi, thuận lợi cho mối di chuyển, nhưng lại cản trở cho những kẻ muốn xâm nhập. Phía dưới đáy tổ, mối tạo ra nhiều phiến mỏng xếp chồng lên nhau, trên các phiến có những lỗ nhỏ để mối có thể chui qua. Giữa các phiến là các khe, hốc rỗng, sống ổn định ở một trong những khoang đó, được gọi là hoàng cung. Coptotermes formosanus là loài mối không làm vườn cấy nấm, nên tổ của chúng có cấu trúc rỗng và đơn giản hơn các loài mối làm tổ có vườn cấy nấm. Việc điều tiết vi khí hậu trong tổ cũng đơn giản. Chúng tập trung số lượng cá thể về tổ khi nhiệt môi trường xuống thấp và phân tán khi nhiệt độ lên quá cao [1]. Hàng năm vào khoảng tháng 4, tháng 5 và tháng 6 có khi sớm hơn đây là lúc mà thời tiết, cũng như khí hậu thuận lợi cho mối bay ra giao hoan, đây là khoảng thời gian mà những tổ mối mới bắt đầu được hình thành. Mối thường bay vào lúc hoàng hôn, độ ẩm khoảng 95%. Vào mùa mối bay có thể bắt gặp hàng ngàn mối cánh bay ở ngoài cửa sổ, xung quanh nguồn sáng cố định. Sau một vài giờ bay, chúng hạ cánh xuống đất hay bất kỳ vị trí nào để tự rụng cánh và cặp đôi. Mỗi tổ Coptotermes formosanus có số lượng mối cánh trưởng thành lớn nhưng chỉ có một [...]... 6% (4% và 6% là lượng mẫu cấy từ môi trường lên men chìm sang môi trường lên men xốp) 2 Thử khả năng diệt mối của bào tử hai chủng nấm Metarhizium thì thấy bào tử chủng M4 có khả năng diệt mối cao hơn bào tử chủng M5 Bào tử chủng M4 mối chết 100% sau 4 ngày, bào tử chủng M5 mối chết 100% sau 5 ngày 3 Xác định khả năng diệt mối của bào tử hai chủng nấm Metarhizium qua lây nhiễm - Khi lõy nhi?m qua mụ... rút ra kết luận là số lượng cá thể của tổ mối và mối nhiễm bào tử, nếu số cá thể nhiễm càng lớn thì khả năng diệt mối càng nhanh Và yếu tố khoảng cách là rất quan trọng đối với tốc độ lây truyền và gây bệnh trong đàn mối, nếu khoảng cách càng ngắn thì khả năng lây nhiễm càng cao tốc độ diệt mối càng nhanh và ngược lại Phần V Kết luận và đề nghị 5.1 Kết luận 1 Lựa chọn được quy trình lên men kết hợp thích... diệt mối qua lây nhiễm của bào tử Metarhizium trên mô hình hộp 4.6 Thử khả năng diệt mối qua lây nhiễm trên mô hình hộp của bào tử Metarhizium M4 Sau khi xác định được khả năng diệt mối của chủng M4 hơn chủng M5 và nồng độ bào tử 0.04/200 cá thể Chúng tôi đ• tiến hành thử chủng nấm chủng M4 với nồng độ 0.04g với số lượng cá thể khác nhau cụ thể kết quả như sau Để có thể xác định được khả năng diệt mối. .. xốp thích hợp của chủng M4 là 4% , của chủng M5 là 6% 4.5: Thử khả năng diệt mối trực tiếp của bào tử 2 chủng nấm Metarhizium (M4; M5) sau khi lên men kết hợp Sau khi xác định được quy trình lên men kết hợp cho hiệu quả cao thì tiến hành sàng lọc và thu bào tử để đưa vào thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và trên thực tế Tiến hành thử trên đĩa petri nhựa với số lượng 100 con (90 mối thợ và 10 mối lính)... hợp thích hợp cho sự phát sinh bào tử của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) là: + Môi trường lên men kết hợp thích hợp là: Môi trường lên men chìm (CzapekDox) và môi trường lên men xốp (100% cơm từ gạo) + Thời gian lên men chìm thích hợp cho cả hai chủng nấm Metarhizium (M4, M5) là 3 ngày + Lượng mẫu thích hợp khi cấy từ môi trường lên men chìm sang môi trường lên men xốp: Của chủng M4 là 4%, của chủng... phương pháp rắc bào tử trực tiếp trên đĩa petri (lượng bào tử Metarhizium tính theo gam) Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa petri với 100 mối (90 mối thợ với 10 Mối lính): Mỗi công thức nhắc lại 3 lần CT 1 : Đối chứng (không cho bào tử) CT 2 : 0,005g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT 3 : 0,01g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT 4 : 0,03g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT 5 : 0,05g bào tử nấm Metarhizium. .. 9 x 1,5 cm) mối đ• đếm sẵn (10% mối lính+ 90% mối thợ) - Hàng ngày theo dõi và đếm số lượng mối chết trên mỗi đĩa Thống kê số liệu để đánh giá chung - Đánh giá và chọn nồng độ thích hợp nhất các chủng Metarhizium có hiệu lực diệt mối cao và hiệu quả kinh tế nhất 3.2.2.4 Thử hiệu lực diệt mối qua lây nhiễm của các bào tử nấm Metarhizium giữa các tổ mối bằng mô hình hình hộp - Phương pháp lây nhiễm là... vua hoặc mối chúa bị chết hoặc không đáp ứng được khả năng sinh sản cần thiết của quần thể Nhờ sự có mặt của mối chúa thay thế nên khi một phần quần thể của loài mối này bị tách biệt khỏi cá thể sinh sản nguyên thủy vẫn có thể sinh sản và tồn tại để phát triển thành tổ mới [1] Mối không sinh sản: Gồm có hai loại mối thợ và mối lính Mối thợ (hay còn gọi là mối lao động), cũng từ mối non trải qua 5 đến... ngày lấy lamen đem soi dưới kính hiển vi và quan sát đặc điểm hình thái của bào tử, sợi khí sinh của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) - Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển, phát sinh bào tử và đếm bào tử của nấm của hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) trên các môi trường với các điều kiện ta cần xác định từ đó xác định môi trường, thòi gian, lượng mẫu thích hợp Có hai phương pháp đếm bào tử là đếm... hiện đề tài, để đề tài được hoàn thiện hơn tôi có một số đề nghị sau: 1 Cần nghiên cứu thêm quy trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sau khi lên men để có thể đưa ra sản xuất chêt phẩm vi nấm trên quy mô công nghiệp 2 Tiến hành đánh giá và thử hiệu lực của bào tử nấm Metarhizium trên một số loại côn trùng gây hại khác: sâu xanh, sâu tơ, châu chấu, cào cào để mở rộng phạm vi ứng dụng của loại vi nấm này 3 . Tiểu luận Đề tài: “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium và khả năng diệt mối của bào tử nấm qua lây nhiễm” Phần. định và đánh giá hiệu lực diệt mối của chế phẩm Metarhizium. Vì vậy chúng tôi quy t định thực hiện đề tài. “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium và khả năng. năng diệt mối của bào tử nấm qua lây nhiễm” 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích: - Hoàn thành quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium (m4; m5) trong phòng trừ mối.