3.1.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian: từ tháng 06 đến tháng 11 năm 2014.
- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu
Khóm chín Cầu Đúc – Hậu Giang: - Độ Brix ban đầu là 13-14,
- pH ban đầu là 3,8
- Khóm có khối lượng 500-600g có thể cho 400-450 mL dịch khóm
Nấm men thuần CKV1 thuộc chi Saccharomyces lưu trữ tại Viện NC&PT CNSH, Trường Đại học Cần Thơ.
Đường cát tinh luyện, khoai tây, agar,…
3.1.3. Dụng cụ thiết bị
Các thiết bị và dụng cụ cần thiết cho các thí nghiệm. - Máy ép nguyên liệu (Panasonic MJ- 68MWRA, Nhật) - Tủ cấy vô trùng (Pháp)
- Kính hiển vi (Olympus Optical, BH-2, Nhật) - Water bath & Shaker (Gesellschaft, Đức) - Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)
- Nồi thanh trùng nhiệt ướt (Breukelen, Hà Lan) - Tủ ủ vi sinh (Henrich, Đức).
- Cân điện tử với độ chính xác 0,01g (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ) - Máy đo pH với độ chính xác 0,01 (Jenway 9500, Anh)
- Khúc xạ kế
- Buồng đếm hồng cầu - Dụng cụ chưng cất, cồn kế
- Các dụng cụ thông dụng như: bình lên men, bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, pipet,...
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.1.4. Hóa chất
- Hóa chất thanh trùng NaHSO3 (Trung Quốc). - Hóa chất điều chỉnh pH: acid citric, NaHCO3
- Môi trường nuôi cấy nấm men (glucose 2%, peptone 0,5%, yeast extract 0,5%).
3.2.Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Sơ đồ quy trình lên men rượu vang
Rượu vang khóm sẽ được lên men theo quy trình sau: Khóm trái ↓ Dịch khóm ↓ Lọc bã ↓
Đo độ Brix và pH ban đầu
↓
Điều chỉnh độ Brix và pH
↓
Thanh trùng bằng NaHSO3 (140 mg/L trong 2 giờ)
↓ Nấm men → Chủng giống ↓ Lên men ↓ Lắng lọc, làm trong ↓ Thành phẩm rượu vang
Hình 3: Quy trình lên men rượu vang
(Hứa Hữu Danh, 2011)
Giải thích quy trình: từ nguồn nguyên liệu khóm ban đầu, gọt bỏ vỏ, rửa sạch, ép lấy nước và lọc sạch bã. Tiến hành đo độ Brix, bổ sung đường kiểm tra lại độ Brix
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
và chỉnh pH phù hợp với từng yêu cầu thí nghiệm. Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ. Bổ sung nấm men theo tỷ lệ 1 mL dịch nấm men cho 99 mL dịch khóm. Quá trình lên men được tiến hành trong bình tam giác 250 mL với 100 mL dịch lên men từ 10-12 ngày. Đậy bình bằng water-lock. Sau đó sẽ tiến hành lọc, làm trong sản phẩm, để sản phẩm ổn định. Cuối cùng ta được thành phẩm rượu vang khóm.
3.2.2. Sản xuất bột nấm men
Mục đích thí nghiệm: cung cấp chủng nấm men tốt nhất cho quá trình lên men rượu vang khóm. Có thể dự trữ nấm men trong thời gian dài.
Quy trình sản xuất bột men:
Cơ chất bột gạo 200g
↓
Dịch men Sấy 100oC, 17 giờ
↓ ↓
100 mL môi trường YPG Xay thành bột
↓ ↓
Ủ 24-48 giờ → Chủng men giống → Để nguội 30-40oC ←
↓ ↓
2 mL vào eppendorf Trộn đều
↓ ↓ Đếm mật số Ủ 30oC ↓ Sấy 17 giờ, 42o C ↓
Xay nhuyễn, rây qua lưới đường kính 0,5 mm
↓
Thu hoạch bột men thuần
Hình 4: Quy trình sản xuất bột men từ nấm men Saccharomyces cerevisiae
(Ngô Thị Phương Dung, 2010)
Tiến hành: xay nhuyễn 200g gạo đã được sấy ở 100oC trong 17 giờ và cho vào mâm inox, để nguội đến nhiệt độ 30-40oC. Chủng men giống S. cerevisiae được tăng sinh trong 100 mL môi trường nuôi cấy nấm men trong 24 giờ (mật số tế bào đạt 106 tb/mL), bổ sung khoáng (glucose 1%, (NH4)2SO4 0,2%, MgSO4 0,05%, CaSO4 0,02%,
Bổ sung khoáng
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
KH2PO4 0,1%, nước cất), nước muối sinh lý 0,85% tạo ẩm cho bột (khoảng 40%). Cho các mâm vào bọc, dùng que sắt nhọn đã khử trùng đục lỗ trên bọc và đem ủ ở 30oC trong 2 ngày. Thu hoạch khối bột đã ủ men, đánh tơi khối bột, sấy khô bột ở 42o
C trong 17 giờ, xay bột và rây qua lỗ rây có đường kính 0,5 mm, thu hoạch bột men thuần và trữ trong bao PP ép miệng, trữ ở điều kiện môi trường xung quanh.
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix và pH nhằm tìm được giá trị của độ Brix và pH thích hợp cho lên men rượu vang khóm.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: độ Brix: 24, 26, 28 và 30; pH dịch quả: 3,5; 4,0; 4,5 và pH tự nhiên của dịch quả. Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 x 3 = 48.
Tiến hành: cho vào bình tam giác 99 mL dịch khóm với pH và hàm lượng đường như bố trí thí nghiệm. Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ. Chủng 1 gram bột men đã sản xuất vào mỗi bình tam giác. Đậy kín bình bằng water-lock và cho lên men trong 11 ngày ở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi: độ Brix, pH, xác định độ rượu (ở 20oC) sau lên men bằng phương pháp chưng cất. Xử lý thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS XVII.
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men
Mục đích thí nghiệm: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men rượu vang khóm.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: nhiệt độ lên men: nhiệt độ phòng (30-32o
C), nhiệt độ phòng mát (22oC); thời gian lên men: 7, 9, 11, 13 ngày. Tổng số nghiệm thức: 2 x 4 = 8 nghiệm thức. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, tổng số đơn vị thí nghiệm: 8 x 3 = 24.
Tiến hành: cho vào bình tam giác 99 mL dịch khóm với pH và hàm lượng đường thích hợp ở thí ngiệm 2. Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ là 140 mg/L trong 2 giờ. Chủng 1 gram bột men đã sản xuất vào mỗi bình tam giác. Đậy kín bình bằng water-lock và tiến hành lên men ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men theo bố trí thí nghiệm.
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chỉ tiêu theo dõi: độ Brix, pH, xác định độ rượu (ở 20oC) sau lên men bằng phương pháp chưng cất. Xử lý thống kê bằng chương trình STATGRAPHICS XVII.
3.2.5. Sản xuất thử nghiệm mẻ 2 lít và 5 lít a. Sản xuất thử nghiệm mẻ 2 lít và 5 lít a. Sản xuất thử nghiệm mẻ 2 lít và 5 lít
Mục đích thí nghiệm: sản xuất thử nghiệm rượu vang khóm để đánh giá chất lượng sản phẩm cũng như đánh giá khả năng lên men ở thể tích 2 lít và 5 lít.
Sau khi tìm được cách xử lý nguyên liệu tốt nhất cho quá trình lên men, chọn được độ Brix, độ pH, thời gian và nhiệt độ tốt nhất. Tiến hành lên men rượu vang khóm ở quy mô phòng thí nghiệm (2 lít và 5 lít dịch khóm), thu hoạch và cho điều vị, đánh giá cảm quan, phân tích vi sinh vật và các chỉ tiêu lý hóa.
b.Điều vị
Mục đích thí nghiệm: tạo hương vị hài hòa cho sản phẩm, nâng cao giá trị cảm quan cho sản phẩm rượu vang khóm.
Thực hiện điều vị theo 2 hướng:
Tỷ lệ phối chế vào rượu 29% v/v:
Rượu 29% v/v
5% 10% 15% 20% 25%
Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố có 5 mức tỷ lệ phối chế của dịch vang khóm (5, 10, 15, 20 và 25%).
Tiến hành: Cho cồn thực phẩm với độ pha loãng tới 29% v/v vào 5 bình tam giác. Sau đó cho tiếp dịch khóm lên men vào mỗi bình ở các nồng độ 5, 10, 15, 20 và 25%.
Điều vị với ethanol:
Điều vị
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Thí nghiệm được bố trí với một nhân tố có 3 mức độ rượu điều vị (24, 29 và 35% v/v).
Tiến hành: Dịch khóm được cho vào các bình tam giác. Sau đó cho tiếp cồn thực phẩm (43% v/v) vào mỗi bình để đạt được các nồng độ 24, 29 và 35% v/v.
Dung dịch lên men có độ Brix, pH phù hợp qua kết quả thí nghiệm 2; nhiệt độ và thời gian phù hợp qua kết quả thí nghiệm 3. Sau đó cho lên men với lượng lớn và điều vị bằng cồn thực phẩm.
Dịch lên men được điều vị theo hệ phương trình:
Trong đó:
x: thể tích rượu vang trong 1 lít rượu thành phẩm (sau điều vị) y: thể tích rượu nếp dùng điều vị trong 1 lít rượu thành phẩm a: nồng độ rượu vang ban đầu chưa điều vị
b: nồng độ rượu nếp dùng điều vị
d: nồng độ rượu cần đạt được sau điều vị
Sau khi điều vị sản phẩm được đánh giá cảm quan để đánh giá chất lượng và sự chấp nhận của sản phẩm. Xử lý thống kê bằng chương trình EXCEL 2010
Các chỉ tiêu vi sinh theo TCVN 7045:2002
Định lượng E. coli
Định lượng Coliforms Tổng số vi sinh vật hiếu khí
Các chỉ tiêu hóa lý theo QCVN 6-3:2010/BYT
pH, Brix Hàm lượng ethanol Hàm lượng methanol Hàm lượng acid tổng Hàm lượng SO2 Hàm lượng acetaldehyde
Các chỉ tiêu cảm quan theo TCVN 3217:1997
Màu sắc và độ trong Mùi và vị
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Sản xuất bột men
Nấm men được nuôi trong bình 250 mL với 100 mL môi trường, dịch huyền phù nấm men sau thời gian nuôi cấy được trộn với bột gạo với tỷ lệ 1:1, sấy khô ở 42oC và xay nhỏ. Bột men thuần được trữ dưới điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên và chứa trong bọc PP, ép miệng.
Bột men được pha loãng đến nồng độ 10-7. Lấy 0,1 mL dịch pha loãng ở các nồng độ cấy trãi trên môi trường YPD-agar. Ủ ở 30oC trong 48 giờ và đếm mật số. Kết quả xác định được mật số nấm men là 2,4x108
CFU/g.
4.2. Ảnh hưởng hàm lượng đường và pH ban đầu
Kết quả khảo sát các nhân tố độ Brix và pH ban đầu lên quá trình lên men rượu vang khóm được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3: Kết quả độ rượu, pH, Brix sau lên men
Nghiệm thức Tổ hợp Brix-pH Brix sau
lên men pH sau lên men Độ rượu 1 24 - 3,86 13,83 4,22 9,11i 2 24 - 3,5 13,50 3,82 7,81j 3 24 - 4 12,83 4,21 12,75e 4 24 - 4,5 12,17 4,33 11,84f 5 26 - 3,86 14,67 4,21 11,11g 6 26 - 3,5 15,00 3,84 10,36h 7 26 - 4 14,17 4,17 13,82c 8 26 - 4,5 13,50 4,25 13,34d 9 28 - 3,86 15,67 4,24 12,06f 10 28 - 3,5 15,83 3,82 10,66h 11 28 - 4 14,17 4,25 15,12b 12 28 - 4,5 14,83 3,62 12,45e 13 30 - 3,86 16,33 4,25 12,49e 14 30 - 3,5 17,17 3,86 12,53e 15 30 - 4 15,00 4,14 16,16a 16 30 - 4,5 15,83 4,33 13,96c
*Ghi chú: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Từ kết quả ở Bảng 3 cho thấy độ rượu chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố độ Brix và pH ban đầu. Độ Brix giảm vì nấm men sử dụng đường trong dịch ép khóm chuyển hóa thành rượu, pH có sự thay đổi về khoảng pH 4-4,3 vì đây là khoảng pH thích hợp cho lên men rượu vang. Dựa vào thống kê giá trị trung bình của độ rượu sau 3 lần lặp lại trên nhân tố độ Brix, pH ở Bảng 3 và kết quả đánh giá cảm quan ở Bảng 4 cho thấy: - Với những nghiệm thức có cùng độ Brix, pH ban đầu thay đổi, thì nồng độ ethanol được tạo ra cao nhất ở mức pH ban đầu là 4. Ở 24o
Brix, độ cồn là 12,75% v/v đồng thời cho kết quả đánh giá cảm quan cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,6/5 điểm; mùi là 4,6/5 điểm; vị là 4,2/5 điểm). Ở nghiệm thức 26oBrix, độ cồn là 13,82% v/v và kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,5/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,2/5 điểm). Độ Brix là 28 thì độ cồn là 15,12% v/v ở mức pH 4 tuy nhiên kết quả đánh giá cảm quan thấp hơn mức pH 3,5 do vị đắng hơn. Khi Brix lên đến 30, độ cồn là 16,16% v/v, kết quả đánh giá cảm quan bằng với nghiệm thức 14 có Brix là 30 và pH 3,5 (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm). Từ kết quả so sánh cho thấy kết quả nồng độ ethanol cao và vị của sản phẩm được ưa thích ở mức pH ban đầu là 4.
- Cũng giống như độ Brix, những nghiệm thức có cùng mức pH ban đầu, độ Brix thay đổi, thì nồng độ ethanol được tạo ra cao nhất ở 30oBrix. Mức pH tự nhiên của dịch khóm cho độ cồn là 12,49% v/v và kết quả đánh giá cảm quan cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,3/5 điểm; mùi là 4,3/5 điểm; vị là 3,6/5 điểm). Ở mức pH 3,5, giá trị độ cồn là 12,53% v/v, kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm). Ở mức pH 4 thì độ cồn đạt được là 16,16% v/v đồng thời kết quả đánh giá cảm quan cũng cao nhất (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,5/5 điểm; vị là 4,4/5 điểm). Cuối cùng, ở mức pH 4,5 thì độ cồn là 13,69% v/v, kết quả đánh giá cảm quan cao (màu sắc, độ trong là 4,4/5 điểm; mùi là 4,1/5 điểm; vị là 3,5/5 điểm). Như vậy, nồng độ ethanol cao và vị của sản phẩm được ưa thích ở độ Brix ban đầu là 30.
Vậy độ Brix ban đầu là 30 và pH ban đầu là 4 là thích hợp cho quá trình lên men, độ cồn đạt cao nhất là 16,16% v/v.
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 4: Kết quả đánh giá cảm quan
Tổ hợp Brix, pH Màu sắc, độ trong Mùi Vị
24 - 3,86 4,2abcd 4,3abc 3,5bcd
24 - 3,5 4,3abc 4,3abc 4,2ab
24 - 4 4,6a 4,6a 4,2ab
24 - 4,5 4,3abc 3,3d 2,8d
26 - 3,86 3,8bcd 3,7bcd 3,4bcd
26 - 3,5 4,2abcd 4,1abcd 3,8abc
26 - 4 4,5a 4,5ab 4,2ab 26 - 4,5 4,5a 3,7bcd 2,9d 28 - 3,86 3,8bcd 3,6cd 3,2cd 28 - 3,5 3,7cd 3,9abcd 4,1ab 28 - 4 3,6d 3,7bcd 3,5bcd 28 - 4,5 4,2abcd 3,9abcd 3,5bcd
30 - 3,86 4,3abc 4,3abc 3,6abcd
30 - 3,5 4,4ab 4,5ab 4,4a
30 - 4 4,4ab 4,5a 4,4a
30 - 4,5 4,0abcd 4,1abcd 3,5bcd
*Ghi chú: Sự khác biệt ý nghĩa thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại có cùng ký tự thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%.
Theo nghiên cứu của Hứa Hữu Danh (2011), với mức pH ban đầu là 4,19 và độ Brix ban đầu 25 là tối ưu nhất cho quá trình lên men, nồng độ ethanol cao nhất là 13,64% v/v. Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của Đinh Thị Kim Lan (2011) nồng độ ethanol cao nhất là 14,94% v/v khi mức pH ban đầu là 4,57 và Brix ban đầu là 23. Như vậy theo kết quả nghiên cứu hiện tại pH ban đầu là 4 thấp hơn so với hai nghiên cứu
Chuyên Ngành Vi Sinh Vật Học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
trên nhưng gần với pH tự nhiên của dịch khóm (pH 3,86), Brix ban đầu là 30 cao hơn Brix của hai nghiên cứu trên nhưng cho độ cồn cao nhất là 16,16% v/v.
Qua kết quả so sánh cho thấy nghiệm thức 15 với độ Brix là 30oBrix và pH ban đầu là 4 cho độ cồn cao nhất 16,16% v/v được chọn với độ tin cậy 95%. Đồng thời, kết quả đánh giá cảm quan ở Bảng 4 cũng cho thấy khi lên men với 30oBrix và pH là 4