Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây kháo (phoebe tavoyana)

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “ Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây Kháo Phoebe tavoyana” Dưới sự hướng dẫn của

KHOA HÓA HỌC -

CAO THỊ LIỄU

CÁC HỢP CHẤT KAEMPFEROL PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY KHÁO

(PHOEBE TAVOYANA)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm

ơn đến TS.Hoàng Lê Tuấn Anh – Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam đã định hướng và hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo và các anh, chị cán bộ Viện Hóa Sinh biển đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện cho em được sử dụng các thiết bị tiên tiến của viện để nghiên cứu, học tập và hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn

Bằng người đã tận tình, chu đáo dạy bảo em trong suốt những năm học ở

trường, hướng dẫn và giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học – Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện và giúp đỡ, dạy dỗ em trong quá trình học tập tại trường Xin cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè đã động viên, khích lệ giúp

đỡ trong quá trình học tập và làm khóa luận

Trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót Vì vậy em kính mong nhận được ý kiến đóng góp chỉ bảo của các quý thầy, cô

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Cao Thị Liễu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận:

“ Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana)”

Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung thực

và không trùng với kết quả của tác giả khác

Sinh viên

Cao Thị Liễu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

[α]D Độ quay cực Specific Optical Rotation

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1: Cây Kháo 3

Hình 1.2: Hoa Kháo 3

Hình 1.3: Quả Kháo 4

Hình 1.4: Công thức của flavonoit 7

Hình 1.5: Dị vòng C của flavonoit 8

Hình 1.6: Kaempferol 10

Hình 3.1: Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Kháo (Phoebe tovoyana) 26

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước của lá cây Kháo (Phoebe tovoyana) 28

Hình 4.1.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 351

Hình 4.1.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 1 32

Hình 4.1.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 1 32

Hình 4.1.4: Phổ DEPT hợp chất 1 33

Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 35

Hình 4.2.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 2 36

Hình 4.2.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 2 36

Hình 4.2.4: Phổ DEPT hợp chất 2 37

Hình 4.3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 39

Hình 4.3.2: Phổ 1H-NMR hợp chất 3 40

Hình 4.3.3: Phổ 13C-NMR hợp chất 3 41

Hình 4.3.4: Phổ DEPT hợp chất 3 42

Bảng 1: Số liệu phổ NMR của chất 1 và chất tham khảo 34

Bảng 2: Số liệu phổ NMR của chất 2 và chất tham khảo 38

Bảng 3: Số liệu phổ NMR của chất 3 và chất tham khảo 42

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Kháo 3

1.1.1 Mô tả 3

1.1.2 Phân bố, sinh thái 4

1.1.2.1 Phân bố 4

1.1.2.2 Sinh thái 4

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Hoạt tính sinh học 5

1.1.5 Công dụng 6

1.2 Hợp chất Kaempferol, thành phần hoá học có trong lá cây Kháo 6

1.2.1 Giới thiệu flavonoit 6

1.2.2 Hợp chất Keampferol 8

1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 10

1.3.1 Chọn dung môi chiết 11

1.3.2 Quá trình chiết 12

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 14

1.4.1 Đặc điểm chung 14

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí 14

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí 15

1.4.3.1 Sắc kí cột (C.C) 17

1.4.3.2 Sắc kí lớp mỏng 19

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ… 19

1.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 20

1.5.2 Phổ khối lượng (MS) 20

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 21

1.5.3.1 Phổ 1H-NMR 21

1.5.3.2 Phổ 13C-NMR 22

1.5.3.3 Phổ DEPT 22

1.5.3.4 Phổ 2D-NMR 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 24

2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 24

2.2.3 Sắc kí cột (CC) 24

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 24

2.4 Dụng cụ và thiết bị 24

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 24

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 25

2.5 Hoá chất 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Phân lập các hợp chất 26

3.2 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất 28

3.2.1 Hợp chất 1 28

3.2.2 Hợp chất 2 29

3.2.3 Hợp chất 3 29

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 31

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 31

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 31

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 3 39

KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa hay còn gọi là khí hậu nhiệt đới ẩm, địa hình ba phần tư là đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng thay đổi từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển hình ở những vùng đất thấp phía nam đến các đặc điểm mang tính chất cận nhiệt đới ở vùng núi cao phía bắc

Những điều kiện thuận lợi trên đã tạo nên nguồn tài nguyên sinh vật dồi dào, đặc biệt hệ thực vật Việt Nam rất phong phú, đa dạng Theo ước tính số loài thực vật bậc cao ở nước ta có thể lên đến 12000 loài, trong đó đã biết khoảng

4000 loài là cây thuốc mọc tự nhiên, được nhân dân dùng làm thảo dược [2] Chính vì thế mà các ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác ngày càng phát triển Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh nhưng có một số hạn chế, gây ra tác dụng phụ không mong muốn Mặt khác, nước ta đang là nước phát triển, thu nhập còn thấp mà các thuốc chữa bệnh gần như nhập khẩu từ nước ngoài và giá thành cao Vì vậy, nhà nước ta khuyến khích tăng cường sản xuất thuốc trong nước Một trong các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy từ thiên nhiên bởi đặc tính ít gây ra tác dụng phụ, ít độc, dễ hấp phụ và không làm tổn hại đến môi trường Do đó, vấn

đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên

Cây Kháo (Phoebe tavoyana) thường phân bố ở miền nam Trung Quốc và

miền bắc Việt Nam Theo kinh nghiệm dân gian thì lá của cây được dùng để tiêu mụn nhọt và nước sắc vỏ cây được dùng để trừ phong thấp [5] Trên thế giới đã

có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong cây Kháo

có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư

Xuất phát từ các cơ sở trên nên tôi đã chọn đề tài khóa luận tốt nghiệp là

“ Các hợp chất kaempferol phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana)”

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Xử lí mẫu và tạo dịch chiết methanol

2 Nghiên cứu phân lập các hợp chất Kaempferol từ lá cây Kháo

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Kháo

1.1.1 Mô tả

Tên khoa học: Phoebe tavoyana

Tên tiếng việt: Cây Kháo (Sụ lá to, Bời lời cơm)

Họ: Long não (Lauraceae)

Bộ: Long não (Laurales)

Lớp (nhóm): Cây gỗ nhỏ

Là loại cây gỗ nhỏ, cao 10 m, cành nhỏ, phủ lông dày màu nâu chồi non có vảy, nhánh non có lông sét Lá có phiến thon gọn ở 2 đầu, hình mác ngược, dài 20- 27 cm, rộng 7- 13 cm, đầu nhọn, gốc hình nêm, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông, có 8-11 đôi gân bậc hai Cuống lá dài 1,5- 2,5 cm, có lông

Chùm tụ tán ở nách lá, hoa trắng, cụm hoa chùy ở đầu cành, dài 6 – 10 cm, phủ lông dày, cuống hoa dài 5 – 7 mm Mảnh bao hoa 6, các mảnh của vòng ngoài nhỏ hơn của vòng trong, phủ lông nâu Nhị hữu thụ 9, 6 nhị ở hai vòng ngoài không lông, 3 nhị vòng trong có lông, ở gốc chỉ nhị có hai tuyến hình tim có chân Nhị lép hình đầu mũi tên có lông Bầu hình cầu, vòi hình đầu Quả hình cầu, đường kính khoảng 1 cm Gỗ cứng, màu đỏ tươi

Hình1.1: Cây Kháo Hình 1.2: Hoa Kháo

Hình 1.3: Quả Kháo 1.1.2 Phân bố, sinh thái

1.1.2.1 Phân bố

Chi Kháo có khoảng 23 loài, phân bố ở miền nam Trung Quốc và miền bắc Việt Nam Cây thường mọc trong rừng lá rộng thường xanh nhiệt đới ở độ cao 700- 2500 m Ở nước ta, cây Kháo phân bố ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo) và Như Xuân, Thanh Hóa Ngoài ra, còn phân bố ở Ấn Độ, Malaixia, Myanmar, Lào,

Thái Lan, Inđônêxia [5]

1.1.2.2 Sinh thái

Mọc rất rải rác dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh mưa mùa ẩm, ở độ cao khoảng 300 m trở lên, cùng với một số loài của các họ khác như Na

(Annonaceae), Đậu (Fabaceae), Thầu Dầu (Euphoriaceae)

Sinh học: Mùa quả chín vào tháng 12, cây tái sinh bằng hạt, mỗi quả chỉ có

một hạt giống duy nhất và chúng thường xuyên phân tán bởi các loài chim Kết

quả là những hạt giống này trong điều kiện tốt sẽ nảy mầm

Giá trị: Nguồn gen quý, hiếm

Tình trạng: Loài hiếm Loài vốn hiếm lại có thể bị đe dọa bị tuyệt chủng do

thu hẹp môi trường sống Mức độ đe dọa: Bậc K [6]

1.1.3 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam có ít nghiên cứu và chưa có nghiên cứu chuyên sâu về cây Kháo Trên Tạp chí Hóa học (2005), Nguyễn Văn Hùng và Nguyễn Văn Tuyến [3] đã công bố 7 hợp chất ancaloit phân lập từ vỏ thân cây Kháo là : Corydin, Pronuciferin, Anonain, Norcorydin, Stepharin, N- metyllaurotetenin, N-

metyllaurolitsin

Cho đến nay, thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về các loài

trong chi Kháo ( P.molocella, P Pittier, P.formosana, P Valeriana, P

Grandis…) thuộc họ Long não Người ta đã phân lập và xác định cấu trúc của

rất nhiều aporphin ancaloit từ các chi này [8],[9],[13],[14],[15],[16]

1.1.4 Hoạt tính sinh học

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của aporphin ancaloit có trong cây Kháo Một số aporphin ancaloit có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng đường máu, chống lắng đọng tiểu cầu và hoạt tính chống ung thư Các hợp chất này được tìm thấy trong các loài của chi Kháo (P.pittier, P Chinensis…) [3]

Trong chương trình sàng lọc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật Việt Nam của Viện Hóa Sinh biển đã thử hoạt tính sơ bộ dịch chiết

MeOH của lá cây Kháo Phoebe tavoyana ( Meisn.) Hook.f Kết quả cho thấy,

dịch chiết MeOH này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính gây độc tế bào với 2 dòng tế bào ung thư gan người (Hep- 2) và ung thư màng tim (RD) Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp

chất được phân lập từ lá cây Kháo (Phoebe tavoyana ( Meisn.) Hook.f.) có ý

nghĩa quan trọng giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học và tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cuộc sống

1.2 Hợp chất Kaempferol, thành phần hoá học có trong lá cây Kháo

1.2.1 Giới thiệu flavonoit

Kaempferol là một trong nhiều flavonoit quan trọng nhất và phổ biến nhất (có chứa các cấu trúc C6-C3-C6 điển hình)

Flavonoit là một trong những nhóm chất phân bố rộng nhất trong tự nhiên, có mặt không những ở thực vật bậc cao mà còn ở một số thực vật bậc thấp và các loài tảo Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: hoa, quả,

lá, rễ, gỗ…và khu trú trong thành tế bào Chúng tham gia tạo màu sắc cho cây, nhất là hoa Đó chính là một trong những chức năng sinh lý quan trọng của flavonoit đối với cây cỏ [4]

Trong thực vật, flavonoit tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp hai lá mầm Động vật không tự tổng hợp được flavonoit, nhưng có thể lấy flavonoit từ nguồn thức ăn

Trong thực vật bậc thấp, flavonoit ít gặp hơn Trong ngành rêu, chỉ phát hiện được rất ít chất Trong dương xỉ, số lượng flavonoit ít hơn nhưng có mặt các nhóm: anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon

Ngành hạt trần có mặt các nhóm: anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon Nét đặc trưng của ngành hạt trần khác biệt

với thực vật bậc thấp và hạt kín ở chỗ có sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoit [1], [10], [11]

Flavonoit tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp hai lá mầm Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ, như họ Asteraceae Một số

chi có nét đặc trưng riêng, như trong chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia hay gặp các chalcon và auron Chi Gymnosperma, Ageratum hay gặp các flavon

và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy Họ Fabaceae hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid Họ Rutaceae thường gặp các flavon và các flavonol có nhiều nhóm methoxy Họ Theacea hay gặp các flavan-3-ol Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosit Trong quả của họ

Rosaceae chi Rubrus và Prunus hay gặp các anthocyanin có các mạch đường phân nhánh Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và các

flavonol sulfat [4], [8], [10], [11]

Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng đến nay chỉ tìm thấy khoảng trên 10 họ

có flavonoit: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae [1], [10]

Các flavonoit là một chuỗi polyphenolic dựa trên một khung cơ sở 15 nguyên tử cacbon gồm hai vòng benzen liên kết bởi một mạch có ba cacbon, có thể được mô tả hệ thống như: C6 - C3 - C6 gồm hai vòng benzen A, B và một dị vòng C, với vòng thơm B thứ 2 ở vị trí 2, 3 hay 4

Hình 1.4: Công thức của flavonoit

Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hidroxy tự do hoặc đã thay thế một phần Vì cậy về bản chất, các flavonoid là các polyphenol và các dẫn xuất của polyphenol

Kaempferol là được biết đến nhiều do có hoạt tính chống ung thư [7] Tuy

nhiên, nó còn có nhiều vai trò khác trong cơ thể con người: Keampferol hoạt động như một chất chống oxy hóa và bảo vệ cơ thể khỏi các gốc tự do gây hại Cũng có những trường hợp Keampferol hoạt động như một thuốc chống trầm

Dihidropyran -pyron Dihidro -  - pyron Pyrilium

cảm Ngoài ra, nó có thể hoạt động như một phytoestrogen (một hợp chất điều

hòa mức estrogen trong cơ thể và có thể giúp ngăn ngừa ung thư, bệnh tim, loãng xương (giảm mật độ khoáng của xương) và các triệu chứng mãn kinh tiêu cực), tăng cường sự trao đổi chất (bằng cách thúc đẩy việc sản xuất hormone

thúc đẩy sự trao đổi chất triiodothyronine (còn được gọi là T3)) Kaempferol

ngăn ngừa xơ cứng động mạch (xơ cứng và mất độ đàn hồi bên trong động

mạch), ngăn ngừa một số loại ung thư khác nhau (bao gồm cả ung thư vú , ung thư phổi , ung thư buồng trứng , ung thư tuyến tụy và ung thư tuyến tiền liệt ) Ngăn ngừa các bệnh tim . [7]

Kaempferol phân bố rộng rãi trong nhiều loài thực vật như cây Kháo, Bạch

quả, Bạch thược, Bát giác liên, Bòng bong, Bóng nước, Bông, Cây cứt lợn, Chàm lá nhỏ, Chè, Cỏ lào, Dầu giun, Đại táo, Đào, Đậu tây, Đơn lá đỏ, Địa liền, Gai chống, Hành tây, Hoa ban, Hòe, Khoai lang, Khoai tây, Lão quan thảo, Mạch ba góc, Màn màn trắng, Màn màn vàng, Măng tây, Me rừng, Mỏ quạ, Móng rồng, Mơ, Muồng hôi, Muồng trâu, Nghể răm, Nhãn, Nho, Phan tả diệp, Phù dung, Rau đắng, Rau má, Riềng, Riềng nếp, Sài hồ bắc, Sắn, Sắn thuyền, Sen cạn, Thanh cao hoa vàng, Thảo quyết minh, Thầu dầu, Thiên môn, Thổ phục linh, Thông nước, Thông thiên, Thục quỳ, Thuốc lá, Trà tiên, Tràm, Vối rừng, Xoan, Xoan trà Nhiều loài trong số này là những dược liệu có giá trị sử dụng cao, được sử dụng trực tiếp, dưới dạng thuốc thang, hoặc đã được nghiên cứu để chiết xuất cao dược liệu và đưa vào 13 dạng bào chế hiện đại.[17],[18] Trong nghiên cứu này lá cây Kháo được lựa chọn để chiết xuất Kaempferol

vì cây Kháo là một cây phân bố rộng rãi ở Việt Nam, đã được các tác giả trong nước nghiên cứu về hình thái thực vật, thành phần hóa học, sơ bộ nghiên cứu về phương pháp chiết xuất và phân lập Một số công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài cũng đề cập đến các phương pháp chiết xuất, phân lập

Kaempferol từ một số dược liệu khác nhau, hoặc về các phương pháp định tính, định lượng Kaempferol trong dịch chiết dược liệu và chế phẩm

Công thức phân tử: C15H10O6 Khối lượng phân tử: 286,2

Danh pháp (IUPAC): 3,5,7- trihydroxy -2-(4-hydroxyphenyl)-

4H-1-benzopyran-4-on

Tính chất lí – hóa: Kaempferol có dạng tinh thể hình kim hoặc vi tinh thể, màu vàng rất nhạt Tan tốt trong MeOH, EtOH, diethylether, tan trong dung dịch kiềm, hầu như không tan trong nước lạnh, không tan trong benzen, cloroform Ở dạng tinh thể hình kim, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 276 –

2780 C Ở dạng vi tinh thể, Kaempferol có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 278 – 2800C Kaempferol có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 266 nm và 362 nm trong methanol, ở bước sóng 265 nm và 365 nm trong ethanol

Tác dụng dược lí: Kaempferol có khả năng dập tắt các gốc tự do như

HO., ROO.… tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, chống viêm, chống dị ứng, ức chế sự hình thành và phát triển khối u trên da chuột nhắt trắng gây ra bởi benzo-α-pyren và dầu ba đậu, ức chế enzyme cyclooxygenase (COX-1 và COX-2) và quá trình peroxyd hóa lipid (flavan)

Hình 1.6: Kaempferol 1.3 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất có trong các mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, chất phân cực…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.3.1 Chọn dung môi chiết

Trong quá trình chiết các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết đóng vai trò quan trọng trong việc lựa chọn dung môi chiết, tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Vì vậy, việc lựa chọn dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải cẩn thận Điều kiện của dung môi là phải hòa tan được những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, có tính trơ ( không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc Dung môi có lẫn các tạp chất gây ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Trong quá trình sản xuất hoặc khâu bảo quản (trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa) thường thì có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat

Dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)-phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] thường

có trong metanol và clorofoc Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…, clorofoc, metylen clorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn

Một vài hợp chất như các ancaloit có thể phản ứng với những tạp chất của clorofoc như CH2Cl2, CH2ClBr tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương

tự như vậy, sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa với các hợp chất khác có thể xảy ra bởi sự có mặt của lượng nhỏ axit clohidric (HCl) Khi làm việc với clorofoc cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc vì clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo nên các dung môi này sẽ được sử dụng trong quá trình chiết vì các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên để thu được lượng lớn các thành phần trong đó Trái lại, khả năng phân cực của clorofoc thấp hơn,

nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, các chất này cũng bị hòa tan đồng thời khi chiết bằng ancol Thông thường dung môi cồn trong nước có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng metanol trong suốt quá trình chiết Trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân hủy 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong metanol nóng là một ví dụ

Nước thường ít được sử dụng để thu dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó

là dùng dung dịch nước của metanol Trong quá trình chiết thực vật dietyl ete hiếm khi được dùng vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, tạo thành peroxit

dễ nổ Các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid dễ gây phản ứng oxi hóa với peroxit của dietyl ete Trong môi trường axit, axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi

xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sau khi chiết, ở nhiệt độ không quá 30- 400C dung môi được cất ra bằng máy cất quay, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

1.3.2 Quá trình chiết

Quá trình chiết đơn giản được phân thành 4 loại như sau:

 Chiết ngâm

 Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

 Chiết sắc với dung môi nước

 Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian

Để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi người ta sử dụng một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy, dung môi nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Ngày nay máy chiết ngâm có thể dùng bình thủy tinh mà không đòi hỏi phải làm bằng kim loại như trước đây

Quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết

sẽ được lấy ra và quá trình chiết một mẫu thường chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Có các cách khác nhau để xác định sự kết thúc của một quá trình chiết

Ví dụ:

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra

mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

- Đối với việc chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendrofff và tác nhân Maye

- Các lacton của sesquitecpen và glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng

để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và xuất hiện của sự cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

Như vậy, để đạt hiệu quả cao, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì

mà chúng ta cần lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các

lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.4 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.4.1 Đặc điểm chung

Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) tương ứng với pha động và pha tĩnh

Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh có sự khác nhau Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng

bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí nhờ vào đặc điểm trên

1.4.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử

đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần):

Trong đó

n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đại cân bằng

n∞: Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào

đó

b : Hằng số

C : Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.4.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong các phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay

lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng :

 Theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất

 Sắc kí phân chia (partition chromatography)

.

n b C n

b C







 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc kí khí)

 Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn

- Sắc kí hấp thụ (Adsorption chromatography)

 Pha động là chất lỏng hoặc chất khí,

 Pha tĩnh là chất rắn: Đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nối trong một cái ống Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin

- Sắc kí trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng

 Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của các hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

- Sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration

chromatography)

 Pha động chỉ có thể là chất lỏng

 Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng

- Sắc kí ái lực (arrinicy chromatography)

 Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein

 Sắc kí ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở

- Sắc kí lỏng cao áp: Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc kí cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể

Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều

vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có một áp lực tác động lên cột Phân loại sắc kí theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng ( paper thin – layer chromatography)

Trong sắc ký giấy:

 Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos

 Pha động: chất lỏng

Trong sắc ký lớp mỏng:

 Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel,

là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

 Pha động: Luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

 Là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

 Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

 Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: Sắc kí lỏng và sắc kí khí

 Theo cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: Sắc

kí cột và sắc kí lớp mỏng

1.4.3.1 Sắc kí cột (C.C)

Sắc kí cột là phương pháp sắc kí phổ biến, đơn giản nhất Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chúng được nhồi vào cột (cột có thể bằng thủy tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thủy tinh) Độ mịn của chất hấp phụ phản

ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ Kích thước của chất càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại Tuy nhiên, hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy càng giảm Khi đó, người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều dài cột (L) thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể

Trong sắc kí, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tùy theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tùy vào

hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30

Trong sắc kí cột tùy vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp khác nhau để có thể đưa chất lên cột Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

 Cách 1: Nhồi cột khô

Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm

để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

 Cách 2: Nhồi cột ướt

Chất hấp phụ được hòa tan vào trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không để bọt khí bên trong (nếu có bọn khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò

Hiệu quả tách phụ thuộc vào tốc độ chảy của dung môi Nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc, còn nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách

1.4.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh, thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử sụng SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn) ,có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, các phương pháp sắc kí so sánh,…