XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN hóa học của các hợp CHẤT ít PHÂN cực từ rễ cây bần CHUA (sonneratia caseolaris (l ) engl )

Ở Việt Nam, bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi….Các bộ phận của cây bần được sử dụng trong dân gian như: hoa bần chữa tiêu viêm chữa tụ m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

- -

TỪ MINH TỎ

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ÍT PHÂN CỰC

TỪ RỄ CÂY BẦN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC

Chuyên Ngành: HÓA HỌC

Mã số: TN 338

CẦN THƠ − 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

- -

TỪ MINH TỎ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ÍT PHÂN CỰC

TỪ RỄ CÂY BẦN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: HÓA HỌC

Mã số: TN 338

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ THANH PHƯỚC

CẦN THƠ − 2010

LỜI CẢM ƠN -o0o -

Để đạt được kết quả như ngày hôm nay Em xin chân thành gửi đến quý thầy cô thuộc bộ môn Hóa Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên lời cảm ơn sâu sắc, các thầy cô đã truyền đạt cho em thật nhiều kiến thức, kinh nghiệm nghề nghiệp và cuộc sống vô cùng quý báu trong suốt bốn năm học tập và rèn luyện tại trường Đó là hành trang vững chắc không chỉ giúp em hoàn thành đề tài tốt nghiệp mà còn là nền tảng cho sự nghiệp của em ở tương lai

Bên cạnh đó, đặc biệt em xin gửi lời biết ơn chân thành nhất đến thầy Lê Thanh Phước, người thầy đã hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ và tạo động lực cho em trong suốt thời gian làm đề tài

Cô Tôn Nữ Liên Hương, cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã cung cấp nhiều kiến thức chuyên ngành giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Thầy Võ Hồng Thái, cô Bùi Thị Bửu Huê, thầy Phạm Quốc Nhiên đã tạo cho em điều kiện làm việc tốt nhất

Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình luôn là chổ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần giúp em vượt qua mọi khó khăn thử thách

Cảm ơn những người bạn đã giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn!!!

TÓM TẮT LUẬN VĂN

o0o

Cây Bần hay còn gọi là Thủy liễu (liễu nước), hải đồng, bần chua,…loài cây mà

đom đóm rất thích đậu trên lá vào ban đêm, tên khoa học là Sonneratia caseolaris (L.) Engl., thuộc họ Lythraceae Ở Việt Nam, bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt

khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi….Các bộ phận của cây bần được sử dụng trong dân gian như: hoa bần chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy, giải nhiệt cảm sốt,…Quả có thể dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm máu,…Trong đề tài này, chúng tôi xác định thành phần hóa học của các hợp chất ít phân cực từ rễ cây bần

Bằng phương pháp sắc ký cột silica gel KG 60 F254 kết hợp với sắc ký lớp mỏng, chúng tôi phân lập ra được bốn chất sạch từ cao PE Sử dụng các dữ liệu phổ NMR đã xác định được một chất đó là: betulinaldehyde, chất còn lại đang trong quá trình tìm hiểu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

TỔNG QUAN

I ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT [2] 2

1 Đặc Điểm Cây Bần Chua 2

2 Phân Bố Sinh Thái 4

3 Tác Dụng Dược Lý Của Cây Bần Chua 5

3.1 Y Học Dân Gian 5

3.2 Y Học Và Hóa Sinh Hiện Đại 6

II CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẦN CHUA 6

1 Các Công Trình Nghiên Cứu Ở Việt Nam 6

2 Các Công Trình Nghiên Cứu Trên Thế Giới [6][7] 6

2.1 Thành Phần Hóa Học Của Cây Bần Chua 8

2.2 Một Số Hợp Chất Được Phân Lập Trong Cây Bần Chua 8

III GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 10

1 Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng (TLC) 10

1.1 Giới Thiệu Chung Về Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng 10

1.2 So Sánh Sắc Ký Lớp Mỏng Với Một Số Kỹ Thuật Sắc Ký Khác 11

1.3 Chất Hấp Thu Silica gel 12

1.4 Dung Môi Giải Ly 13

1.5 Các Công Dụng Của Sắc Ký Lớp Mỏng 13

2 Phương Pháp Sắc Ký Cột 14

2.1 Giới Thiệu Về Phương Pháp Sắc Ký Cột 14

2.2 Lựa Chọn Dung Môi Để Khởi Đầu Giải Ly 14

2.3 Tỷ Lệ Giữa Mẫu Chất Cần Tách Với Kích Thước Cột 15

2.4 Nạp Chất Hấp Thu Dạng Sệt Vào Cột 16

2.5 Đặc Mẫu Chất Cần Tách Lên Đầu Cột Sắc Ký 16

2.6 Theo Dõi Quá Trình Giải Ly Cột 18

2.7 Khi Nào Thay Đổi Hệ Dung Môi Giải Ly Cột 18

I CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 20

1 Các Phương Pháp Ngiên Cứu 20

2 Phương Pháp Nghiên Cứu 20

2.1 Quá Trình Thu Hái Và Xử Lý Nguyên Liệu 20

2.1.1 Thu Hái Nguyên Liệu 20

2.1.2 Xử Lý Nguyên Liệu 21

2.2 Quá Trình Điều Chế Thu Cao 21

2.2.1 Quá Trình Điều Chế Thu Cao Etanol (Cao Tổng) 21

2.2.2 Quá Trình Điều Chế Cao ete dầu hỏa (PE) 22

2.3 Cách Phân lập Các Chất Trong Rễ Bần 23

3 Các Bước Tiến Hành 24

II.QUÁ TRÌNH PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TRÊN CAO CHIẾT 24 1.Quá Trình Phân Lập Và Tinh Chế Các Chất Trên Cao PE 24

2 Xác Định Các Tính Chất Vật Lý Đặc Trưng Và Xác Định Cấu Trúc của Hợp Chất Vừa Phân Lập Được 30

2.1 Các Đặc Tính Của Chất PHUOC-TO-01 30

2.2 Xác Định Cấu Trúc Của Chất PHUOC-TO-01 30

I KẾT LUẬN 34

II ĐỀ NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN SÁCH: 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN WEB: 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác

Bảng 2: Các hóa chất sử dụng thực hiện đề tài

Bảng 3: Quá trình sắc ký cột trên cao PE đường kính 7 mm

Bảng 4: Quá trình sắc ký cột trên cao PE đường kính cột 20 mm

Bảng 5: Số liệu thực nghiệm của PHUOC-TO-01 với số liệu mô phỏng của betulinaldehyde

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

NMR Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

EtOAc, EA Ethyl acetate

ppm Parts per milion

Rf Retention factor

PHẦN I: TỔNG QUAN

I ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT[2]

1 Đặc Điểm Cây Bần Chua

Tên Khoa Học: Sonneratia caseolaris (L.) Engl

Tên đồng nghĩa : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris

Tên Việt Nam: Bần Chua

Tên khác: Hải đồng, Thủy Liễu

Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliosida Bộ: Myrtales

Họ: Lythraceae Chi: Sonneratia Loài : Sonneratia caseolaris (L.)

Hình 1: Cây bần ven sông

Cây gỗ, thân cao 4-5 m hoặc hơn, luôn xanh Rễ thở tập trung thành khóm ở quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn Cành non có 4 cạnh nhẵn Lá mọc đối, lá non hình mũi mác dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu tù, phiến

lá dài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá rõ, thường rụng vào mùa đông; cuống lá

và phần gân chính ở gốc có màu đỏ

Hình 2: Hoa bầnHoa màu trắng, mọc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá; cuốn hoa ngắn và mập; đài có có

6 răng hình tam giác, dày hàn liền ở gốc tạo thành một ống dài 1.5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn; nhị nhiều, chỉ nhị dài, mảnh; bầu hình cầu dẹt

Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 3 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều dẹt Toàn cây nhẵn

Hình 3: Thân cây và quả bần

2 Phân Bố Sinh Thái

Chi sonneratia L.f gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng đất

ngập mặn ven biển, ở Đông Phi, nhiệt đới châu Á, Bắc Australia và các đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, chi này có 4-5 loài, trong đó bần là cây gặp khá phổ biến ở các vùng ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến rạch Giá (Hà Tiên) Loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Philipin, New Guinea, phần biển Đông Bắc Australia và đảo Salomon

Bần là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các

vùng đất bùn nhảo ở các cửa sông Nó thường mọc lẫn với các loài Kandelia candel, Aegiceras corniculata, Excoecaria agallocha, và các loài đước – Avicenna spp… là

những đại diện không thể thiếu, tạo nên quần thể rừng ngập mặn ven biển Việt Nam

Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thống rễ thở mọc trồi lên khổi mặt đất Bần ra hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn

trùng và dơi Hoa bần là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật Cây còn được trồng thêm nhằm chắn sóng và bảo vệ vùng đất ngập nước ở ven biển

3 Tác Dụng Dược Lý Của Cây Bần Chua

3.1 Y Học Dân Gian

Lá bần: ở các nước Đông dương (cũ), lá bần giã nát với ít muối, đắp tại chổ chữa vết

thương bầm tím do đập đụng

Quả bần: ở Ấn Độ quả bần được dùng làm thuốc đắp ngoài chữa bong gân sưng tấy,

dịch ép lên men từ quả có tác dụng cầm máu Ở Malaisia, quả già là thuốc diệt giun, còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột cari, còn lúc chín có mùi vị giống bơ, có thể ăn tươi hoặc nấu chín

Hình 6: Quả bần dùng làm món ăn

Hoa bần: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phần trong bài thuốc chữa đái ra máu

Giải nhiệt chữa cảm sốt: Quả bần rửa sạch, nhai với muối, rồi nuốt nước

Cầm máu nhất là chảy máu cam: Quả bần rửa sạch, giã nát, đắp vào vết thương, máu

sẽ cầm ngay Tác dụng này chính là do chất pectin chứa trong dịch quả

Tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy: Quả bần giã nhỏ, ép lấy dịch, cô thành cao mềm Lúc cao còn nóng phết lên giấy, khi dùng, hơ thuốc cho mềm rồi đắp lên chổ đau ngày làm một lần

Sử dụng làm thuốc đắp vào chỗ viêm tấy vì bong gân Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết Ta dùng lá giã ra, thêm tí

muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ Ở Malaixia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa bí tiểu tiện

3.2 Y Học Và Hóa Sinh Hiện Đại

Hiện nay cây bần chỉ mới được sử dụng làm thuốc theo dân gian, chưa có nghiên cứu khoa học cụ thể nào phục vụ trong y học hiện đại

II CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY BẦN CHUA

1 Các Công Trình Nghiên Cứu Ở Việt Nam

Hiện nay tại Việt Nam có rất ít công trình hay đề tài khoa học nghiên cứu về cây

bần chua Sonneratia caseolaris (L.)

- Theo thông tin gần đây ngày 12 tháng 04 năm 2010 có bài báo nghiên cứu về loại cây này, do hai tác giả là La Vũ Thùy Linh và Trương Ngọc Đức (Trường Đại Học Tôn Đức Thắng) từ loại nguyên liệu có sẵn ở Đồng bằng Nam Bộ là rễ bần họ đã nghiên cứu sản xuất thành công than hoạt tính

Các tác giả cho biết, công trình đã xác định được đặc trưng của rễ bần và sản xuất thành công than hoạt tính với điều kiện than hóa ở 450C trong 3 giờ và hoạt hóa bằng cách tẩm muối cacbonat và nung trong môi trường CO2 ở nhiệt độ 800C trong khoảng

1 giờ…Kết quả cho thấy than hoạt tính từ rễ bần có thể thay thế các loại than hoạt tính trên thị trường trong xử lý nước, xử lý môi trường…

- Các thông tin về cây này được giới thiệu trong sách “Những cây thuốc và vị thuốc việt nam, Đỗ Tất Lợi, NXB Y Học, 2004”

2 Các Công Trình Nghiên Cứu Trên Thế Giới [6][7]

Các công trình nghiên cứu về cây bần chua (Sonneratia caseolaris (L.)) ở nước ta còn

là một đề tài mới Tuy nhiên, ở các nước khác cũng đã có nghiên cứu về loài cây này sau đây tôi xin dẫn một vài công trình nghiên cứu của các quốc gia khác:

Nghiên cứu Flavonoids:

- Năm 2006, nhóm nghiên cứu gồm: SADHU SAMIR KUMAR(Khulna Univ., Khulna, Bgd) SADHU SAMIR KUMAR(Chiba Univ., Chiba, Jpn) AHMED FIROJ(Khulna Univ., Khulna, Bgd) OHTSUKI TAKASHI(Chiba Univ., Chiba, Jpn) ISHIBASHI MASAMI(Chiba Univ., Chiba, Jpn) tại Nhật Bản họ nghiên cứu về

Flavonoids từ cây Sonneratia caseolaris (L.) và đăng bài viết trên tạp chí quốc gia

bằng tiếng anh trang (264-265) Bài viết dựa trên công dụng theo dân gian của

Sonneratia caseolaris (L.) họ đã thử nghiệm trên các phần trích ra được từ cây này thử

khả năng kháng oxi hóa sử dụng gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) loại bỏ

ảnh hưởng của tạp chất trên sắc ký lớp mỏng Kế theo nó định hướng có khả năng tách

rời ra và hai chất flavonoids là luteolin (1) và luteolin 7-O-β-glucoside (2) đã được

phân lập và cả hai chất trên đều có hoạt tính kháng oxi hóa

Trên Quả:

- Năm 2008, nhóm nghiên cứu Shi-Bao Wu, Xu-Wen Li, Yun Zhao và Jin-Feng Hu

thuộc bộ môn của Các Sản Phẩm Tự Nhiên Nghiên Cứu Về hóa Chất Di Truyền và

Ying Wen, Zheng Zhao thuộc bộ bộ môn Dược Lý và Độc Chất trường Đại Học

Chuẩn Phương Đông, Trung Quốc Họ đăng bài viết vào ngày 25 tháng 09 năm 2008

được chấp nhận ngày 18 tháng 01 năm 2009 và có tài khoản online ngày 20 tháng 02

năm 2009 Đề tài của họ là nghiên cứu thành phần hóa học trên quả của cây

Sonneratia caseolaris (L.) và Sonneratia ovata (Sonneratiaceae) và họ đã có được kết

quả như sau:

Chín chất (1-9) và bảy chất (1-6,10) lần lượt được phân lập từ quả Sonneratia

caseolaris và Sonneratia ovata Các cấu trúc của chúng được xác định bởi sự so sánh

dữ liệu MS và NMR của chúng tốt như các đặc tính vật lý có trong lý thuyết Tất cả

các hợp chất được phân lập được sàn lọc thử nghiệm trên chuột dãy các tế bào C-6 sử

dụng phương pháp thử nghiệm MTT; chỉ có hợp chất (-)-(R)-nyasol (1),

(-)-(R)-4′-O-methylnyasol (2) và maslinic acid (6) được phát hiện có biểu hiện khả năng giết chết tế

bào

Trên Thân và cành:

- Năm 2009, Nhóm nghiên cứu Tian, Minqing; Dai, Haofu; Li, Xiaoming; Wang,

Bingui có bài viết đăng tháng 05 năm 2009 trên tạp chí quốc gia Trung Quốc trang

(288-296) Đề tài nghiên cứu Thành Phần Hóa Học của Cây Ngập Mặn Có Dược Tính

Sonneratia caseolaris (L.) Kết quả họ có được như sau:

24 chất bao gồm 8 steroids (1-8), 9 triterpenoids (9-16,24), 3 flavonoids (20-22) và 4

dẫn xuất của benzenecarboxylic (17-19,23) đã được phân lập và xác định từ thân và

các cành non của cây Sonneratia caseolaris (L.) Cấu trúc của các chất đã phân lập

được xác định bằng phân tích nhiều dữ liệu quang phổ Trong việc chóng lại tế bào

mang bệnh thử nghiệm SMMC-7721 các tế bào hepatoma người, chất 21 (3',4',5,7-tetrahydroxyflavone) đã biểu hiện khả năng đáng kể với IC50 2.8 μg/mL,

trong khi oleanolic acid (14), 3,3'-di-O-methyl ether ellagic acid ( 18) và

3,3',4-O-tri-O-methyl ether ellagic acid ( 19) biểu hiện hoạt tính yếu Không có chất nào trong số

đó biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn

Trên hoa:

Năm 1995 nghiên cứu về thành phần hóa học trên hoa của cây Sonneratia caseolaris

(L.) Tóm tắt bài nghiên cứu như sau:

Hoa của cây Sonneratia caseolaris (L.) được làm khô Được chiết với hexane,

dichlorometane, ethyl acetate và methanol Chiết phân đoạn bằng cột sắc ký đã phân

lập được mười chất Tám chất đã biết đặt tính và tính chất vật lý, TLC với các mẫu đã

chắc chắn, các phản ứng hóa học và dữ liệu phổ Tám chất này là một hỗn hợp của một

chuỗi dài sắp xếp theo thứ tự các hydrocarbon (C23-C33), một hỗn hợp các chuỗi dài

các ester, một hỗn hợp các chuỗi dài của alcohol (C26,C30,C33), một hỗn hợp các

steroids (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và

-sitosterol-3-O--D-glucopyranoside Hai chất còn lại đang quá trình nghiên cứu

2.1 Thành Phần Hóa Học Của Cây Bần Chua

Trên hoa: (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và

oleanolic acid, 3,3'-di-O-methyl ether ellagic acid, 3',4-O-tri-O-methyl ether ellagic acid,…

2.2 Một Số Hợp Chất Được Phân Lập Trong Cây Bần Chua

- Luteolin

+ Tên khác: Digitoflavone, Flacitran, Luteolol…

+ Tên IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)-4H-chromen-4-one

+ Công thức phân tử: C15H10O6

+ Công thức cấu tao:

O OH

7-((2S,3R,4S,5S,6R)-tetrahydro-3,4,5-trihydroxy-6-(hdroxymethyl)-2H-pyran-2-+ Công thức cấu tạo:

O OH O

OH OH O

OH OH HO

O HO

- Oleanolic acid

+ Tên IUPAC:

(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid

H H

+ khối lượng phân tử: 456.7 g mol−1

- Kaempferol

+ Phân tử khối 286,23 g/mol

+ Công thức phân tử C15H10O6

+ Công thức cấu tạo:

OH O OH

OH

- Quercetin

+ Tên IUPAC: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H- chromen-4-one

+ Phân tử khối 302,236 g/mol

+ Công thức phân tử: C15H10O7

+ Công thức cấu tạo:

OH O OH

OH OH

III GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

1 Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng (TLC)

1.1 Giới Thiệu Chung Về Phương Pháp Sắc Ký Lớp Mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel

KG 60 F254, hoặc oxyt nhôm Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

+ Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ…bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy

+ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel KG 60 F254, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền

phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polyme hữu cơ

+ Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit dung dịch mẫu với nồng

độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình + Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Với chất hấp thu là silica gel KG 60 F254 hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ

di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm

1.2 So Sánh Sắc Ký Lớp Mỏng Với Một Số Kỹ Thuật Sắc Ký Khác

Bảng 1: So sánh sắc ký lớp mỏng với các loại sắc ký khác Sắc ký lớp

mỏng

Sắc ký cột

cổ điển

Sắc ký cột chớp

Hấp thu Hấp thu Phân chia Phân chia

Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi

Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi

Khí hoặc hơi của các hợp chất có tính bay hơi

Mẫu có tính bay hơi nhiều hay ít đều phù hợp Khả năng

Nhiều giờ Vài mươi

phút

Vài phút Vài phút

Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau:

- Chỉ cần một lượng ít mẫu để phân tích

- Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích

- Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ

ở dạng một mũi hấp thu rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó là mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn

1.3 Chất Hấp Thu Silica gel

Silica gel là chất hấp thu được sử dụng thông dụng nhất Silica gel được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt…như yêu cầu Ngoài ra người ta còn thêm các hợp chất khác để tăng khả năng tách theo mong muốn

O SiO

O

H

Si O

O

H

O SiO

H

Si O

Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm silanol-OH; đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất được sắc ký Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức –OH, NH2, -COOH ) có khả năng tạo mối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alcan, terpen (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm

1.4 Dung Môi Giải Ly

Nguyên tắc chọn dung môi: Nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại Dung môi không được quá dễ bay hơi, ví dụ như etyl ete, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35C, gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miền nam Việt Nam) Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng bay đi khỏi tấm lớp mỏng sau khi giải ly

Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau Khả năng tách riêng các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly Muốn thay đổi khả năng tách, người tat hay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly Thường thì người ta sử dụng với hệ hai dung môi

Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đổi pha khi có

sự thay đổi nhiệt độ

Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau vẫn tùy thuộc vào kinh nghiệm

cá nhân, nhưng những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu

1.5 Các Công Dụng Của Sắc Ký Lớp Mỏng

+ Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập

+ Để kiểm tra lại hai hợp chất có giống nhau (là một chất?)

+ Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát:

* Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu

* Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất

* Biết sơ qua về tính phân cực của những thành phần hợp chất có trong mẫu

+ Để chuẩn bị cho sắc ký cột:

* Tìm hệ dung môi để bắt đầu cho việc sắc ký cột

* Để theo dõi cho quá trình sắc ký cột

+ Để theo dõi tiến trình của một phản ứng hữu cơ

+ Để kiểm tra một hợp chất kém bền

+ Để cô lập hợp chất

2 Phương Pháp Sắc Ký Cột

2.1 Giới Thiệu Về Phương Pháp Sắc Ký Cột

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là những hạt silica gel có kích thướt tương đối lớn (50-150 μm) được nạp trong một cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy vậy, sắc

ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất

2.2 Lựa Chọn Dung Môi Để Khởi Đầu Giải Ly

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước lần lượt như sau:

+ Bước 1: Mẫu cần sắc ký được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với nồng

độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A)

+ Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2.5×10 cm Chấm lên những tấm bản này, mỗi

tấm chấm khoảng 2-5 μL dung dịch (A)

+ Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế

đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp Từ kết quả đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, thí dụ như ete dầu hỏa: etyl acetate

+ Bước 4: Đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ (cao có nhiều hợp chất từ không phân

cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít

phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với Rf = 0.5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với

Rf = 0.2

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly

Lưu ý:

* Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau

* Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm trên, nhưng phải chỉnh tỷ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với dung môi đã chọn Bởi vì chất hấp thu, thí dụ silica gel dùng cho sắc ký lớp mỏng, với kích cỡ hạt nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bản bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn Trong khi đó chất hấp thu do nghiên cứu viên tự nạp cột trong phòng thí nghiệm là loại silica gel dùng cho sắc ký cột, với cỡ hạt lớn hơn, lại được nạp vào cột ở áp suất thường, nên có tính lỏng lẽo hơn

2.3 Tỷ Lệ Giữa Mẫu Chất Cần Tách Với Kích Thước Cột

+ Tỷ lệ giữa lượng mẫu cần tách và lượng chất hấp thu sử dụng:

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử dụng số lượng lớn chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng chất hấp thu ít hơn

Vì thế trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượng mẫu chất muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm một chiều cao phù hợp tromg cột mà cột vẫn còn chỗ chứa dung môi Với lượng chất hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thướt phù hợp

+ Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc ký: Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất háp thu: đường kính của cột vào khoảng (10:1)

Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với cột thì cho chất hấp thu khô vào cột để quan sát