nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether từ rễ cây bần chua (sonneratia caseolaris (l.) engl.)

Hình 4: Lẩu chua được chế biến từ quả Bần1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Bần chua 1.1.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 6,12 Năm 2010, Từ Minh Tỏ Khoa Khoa học tự nhiên, Trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Mã số: CN 262

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.)

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Mã số: CN 262

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ THANH PHƯỚC

CẦN THƠ − 2012

LỜI CẢM ƠN -o0o -

Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh 3, Bộ môn Hóa, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ , khu II, đường 3/2, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến:

TS Lê Thanh Phước, Phó Trưởng Khoa, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại Học Cần Thơ, người đã hết lòng tận tụy giảng dạy, giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này

Quý thầy cô của Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, trường Đại Học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, cho tôi trong suốt bốn năm học tập tại trường

Quý thầy cô của Bộ môn Hoá học, Khoa Khoa học Tự nhiện, trường Đại Học Cần Thơ đã tạo cho em điều kiện làm việc tốt nhất trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Anh Từ Minh Tỏ, chị Lâm Thúy Phương, Lê Hương Nhi học viên cao học khóa

17 và các bạn tại Phòng thí nghiệm Hóa Sinh, Bộ môn Hóa, Khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại Học Cần Thơ đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần giúp tôi vượt qua mọi khó khăn thử thách

Cần Thơ, tháng 4 năm 2012

Đỗ Nguyễn Tường Vy

TÓM TẮT LUẬN VĂN

-o0o -Cây Bần hay còn gọi là Thủy liễu (liễu nước), hải đồng, Bần chua,…loài cây mà

đom đóm rất thích đậu trên lá vào ban đêm, tên khoa học là Sonneratia caseolaris (L.) Engl., thuộc họ Lythraceae Ở Việt Nam, Bần là một loại cây rất quen thuộc có mặt

khắp nơi ven sông, ven biển, các bãi bồi….Các bộ phận của cây bần được sử dụng trong dân gian như: hoa bần chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tấy, giải nhiệt cảm sốt,…quả có thể dùng để nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm máu,…Trong đề tài này, tôi nghiên cứu thành phần hóa học của cao petroleum ether từ

rễ cây Bần

Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 F254 (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng, tôi phân lập ra được ba chất sạch từ cao petroleum ether Sử dụng các dữ liệu phổ1H-NMR đã xác định được một chất đó là: lupeol, các chất còn lại đang trong quá trình tìm hiểu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN II TÓM TẮT LUẬN VĂN III MỤC LỤC IV DANH MỤC HÌNH VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT VIII

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 Khái quát về nguyên liệu 1

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bần chua 1

1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua 1

1.1.3 Phân bố sinh thái 3

1.1.4 Công dụng chữa bệnh của cây Bần 4

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Bần chua 5

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 10

2.1 Các kỹ thuật chiết tách thông dụng 10

2.1.1 Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây 10

2.1.2 Lựa chọn dung môi chiết tách 10

2.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi chiết tách 11

2.1.4 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 11

2.1.5 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng 12

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký 13

2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 13

2.2.2 Phương pháp sắc ký cột hở 15

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 20

3.1 Phương tiện nghiên cứu - thiết bị hóa chất 20

3.2 Các bước tiến hành 21

3.3 Quá trình thu hái và xử lý nguyên liệu 21

3.3.1 Thu hái nguyên liệu 21

3.3.2 Xử lý nguyên liệu 22

3.4 Quá trình điều chế thu cao 23

3.4.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol 23

3.4.2 Quá trình điều chế các cao petroleum ether (PE), cao dichloromethane (Di), cao Ethyl acetate (EA, EtOAc) và cao n-Butanol 24

3.4.3 Cách phân lập các chất ít phân cực trong rễ Bần 27

3.5 Quá trình phân lập và tinh chế các chất trên cao 27

3.5.1 Khảo sát cao PE bằng sắc ký bản mỏng 27

3.5.2 Khảo sát cao PE bằng sắc ký cột 28

3.6 Xác định các tính chất vật lý đặc trưng và cấu trúc của hợp chất vừa phân lập được 37

3.6.1 Tính chất vật lý 37

3.6.2 Xác định cấu trúc của PHUOC-VY-01 37

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Hình 11: Tinh thể và TLC của phân đoạn II trong cao PE 32

DANH MỤC BẢNG

Trang

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

NMR Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

EtOAc, EA Ethyl acetate

ppm Parts per milion

Rf Retention factor

HPLC High-performance liquid chromatography

LỜI MỞ ĐẦU

-

-Từ ngàn xưa, khi nền khoa học kỹ thuật chưa phát triển, những lúc đau yếu, ông cha ta thường sử dụng những vị thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên để chữa bệnh

Vì thế, xu hướng hiện nay của ngành dược phẩm là hướng đến các sản phẩm

có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm như thế rất được ưa chuộng Một trong những vị thuốc trong y học dân gian thì cây Bần chua là một loài cây phổ biến và được biết đến với nhiều lợi ích Theo một số tài liệu về y học trên thế giới, vỏ cây,

lá và trái của loài này là nguồn dược liệu có giá trị chữa bệnh Ngoài ra, những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Bần chua

đã khẳng định nó có khả năng chống ung thư và kháng oxi hóa

Do đó, để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong phú có tiềm năng quan trọng trong ngành dược, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành

phần hóa học trong cao petroleum ether từ rễ cây Bần chua (Sonneratia caseolaris (L.) Engl)” Qua đó, nhằm tìm hiểu thêm về phương pháp cô lập các hợp chất thiên

nhiên từ cây Bần chua nói riêng và các loài thảo dược nói chung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về nguyên liệu 6

1.1.1 Giới thiệu chung về cây Bần chua

Tên Khoa Học: Sonneratia caseolaris (L.) Engl.

Tên đồng nghĩa : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris

Tên Việt Nam: Bần Chua

Tên khác: Hải đồng, Thủy Liễu

Loài : Sonneratia caseolaris (L).

1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua

Bần là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các vùng đất bùn nhão ở các cửa sông Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và thường bị ngập nước nên cây có hệ thống rễ thở Nó thường mọc lẫn với

các loài Kandelia candel, Aegiceras corniculata, Excoecaria agallocha, và các loài đước – Avicenna spp… là những đại diện không thể thiếu, tạo nên quần thể rừng

ngập mặn ven biển Việt Nam Cây còn được trồng thêm nhằm mục đích chắn sóng

và bảo vệ vùng đất ngập nước ở ven biển

Cây gỗ, thân cao 10-15 m hoặc cao hơn, luôn xanh Rễ thở tập trung thành khóm ở quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn Cành non có 4 cạnh nhẵn Để thích

nghi với điều kiện đất bùn nhão và thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thống rễthở mọc trồi lên khỏi mặt đất.

Hình 1: Cây Bần chua

Lá mọc đối, lá non hình mũi mác dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu tù, phiến lá dài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá

rõ, thường rụng vào mùa đông; cuống lá và phần gân chính ở gốc có màu đỏ

Hoa màu trắng, mọc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá, cuốn hoa ngắn và mập, đài có có 6 răng hình tam giác, dày hàn liền ở gốc tạo thành một ống dài 1,5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn,nhị nhiều, chỉ nhị dài, mảnh, bầu hình cầu dẹt Mùa hoa: tháng 3-5 Bần ra hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn trùng và dơi Hoa Bần là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật

Hình 2: Hoa Bần chua

Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính 3-4 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều dẹt, nạc vị chua chua Mùa quả: tháng 8-10

Hình 3: Quả Bần chua

1.1.3 Phân bố sinh thái

Chi sonneratia L.f gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các

vùng đất ngập mặn ven biển Loài này cũng được phân bố rộng rãi ở Ấn Độ, Thái

Lan, Campuchia, Indonesia, Philippin, New Guinea, phần biển Đông Bắc Australia

và đảo Salomon

Ở Việt Nam, chi này có 4-5 loài, trong đó Bần là cây gặp khá phổ biến ở các vùng nước lợ và ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến Rạch Giá (HàTiên) Nó thường được mọc chung với các loại cây khác như: Trang, Sú, Cóc… cũng có khi mọc thành rừng gần như thuần loại như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh Sự phong phú này tùy theo nước lợ và chế độ thủy triều

1.1.4 Công dụng chữa bệnh của cây Bần 9, 10

Gỗ bần dung làm than, nút chai Trái thì làm các món ăn như canh chua bần, mắm bần, lẩu cá nấu bần Ngoài ra, cây Bần chua còn có thể làm dược liệu chữa được một số bệnh cho con người

Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết Ta dùng lá giã ra, thêm tí muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ Ở Malaixia, người ta giã lá lẫn với cơm làm thuốc đắp chữa

Hoa Bần: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phần trong bài thuốc chữa đái

ra máu

Hình 4: Lẩu chua được chế biến từ quả Bần

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về cây Bần chua

1.1.5.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 6,12

Năm 2010, Từ Minh Tỏ ( Khoa Khoa học tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ)

đã phân lập và xác định cấu trúc của hợp chất PHUOC-TO-01 là betulinaldehyde trên cao petroleum ether từ vỏ rễ, phần nhô lên khỏi mặt đất, đường kính trung bình của mỗi rễ khoảng 2 cm, chiều cao khoảng 0,4 đến 0,8 m

Từ loại nguyên liệu có sẵn ở Đồng bằng Nam Bộ là rễ Bần, hai tác giả La Vũ Thùy Linh và Trương Ngọc Đức (Trường Đại học Tôn Đức Thắng) đã nghiên cứu sản xuất thành công than hoạt tính Các tác giả cho biết, công trình đã xác định được đặc trưng của rễ Bần và sản xuất thành công than hoạt tính với điều kiện than hóa ở 450°C trong 3 giờ và hoạt hóa bằng cách tẩm muối cacbonat và nung trong môi trường CO2ở nhiệt độ 800°C trong khoảng 1 giờ Kết quả cho thấy than hoạt tính từ rễ Bần có thể thay thế các loại than hoạt tính trên thị trường trong xử lý nước, xử lý môi trường, hấp phụ, khử mùi và màu

1.1.5.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 7,8

Ngoài việc sử dụng cây Bần mà chủ yếu là các cao trích từ lá, thân, rễ để điều trị một số bệnh trong y học dân gian, ngày nay các nhà hóa học trên thế giới đã chiết xuất được nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng từ cây Bần như: flavonoid, steroid, terpenoid, iridoid,…

Năm 2006, nhóm nghiên cứu gồm: Sadhu Samir Kumar (Khulna Univ., Khulna, Bgd) Sadhu Samir Kumar (Chiba Univ., Chiba, Jpn) Ahmed Firoj (Khulna Univ., Khulna, Bgd) Ohtsuki Takashi (Chiba Univ., Chiba, Jpn) Ishibashi Masami(Chiba Univ., Chiba, Jpn) tại Nhật Bản đã nghiên cứu về flavonoids từ cây

Sonneratia caseolaris (L.) được đăng bài viết trên tạp chí quốc gia bằng tiếng anh ở trang (264-265) Bài viết dựa trên công dụng theo dân gian của Sonneratia caseolaris (L.) đã thử nghiệm trên các phần trích ra từ cây, thử khả năng kháng oxi

hóa sử dụng gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) loại bỏ ảnh hưởng của tạp chất trên sắc ký lớp mỏng Kế theo nó định hướng khả năng tách rời hai chất

flavonoids là luteolin (1) và luteolin 7-O-β-glucoside (2) đã được phân lập và cả hai

chất trên đều có hoạt tính kháng oxi hóa

Năm 1995, nghiên cứu về thành phần hóa học trên hoa của cây Sonneratia caseolaris (L.) Tóm tắt bài nghiên cứu như sau: Hoa của cây Sonneratia caseolaris

(L.) được làm khô Được chiết với hexane, dichlorometane, ethyl acetate và methanol Chiết phân đoạn bằng cột sắc ký đã phân lập được mười chất Tám chất

đã biết đặt tính và tính chất vật lý, TLC với các mẫu đã chắc chắn, các phản ứng hóa học và dữ liệu phổ Tám chất này là một hỗn hợp của một chuỗi dài sắp xếp theo thứ tự các hydrocarbon (C23-C33), một hỗn hợp các chuỗi dài các ester, một hỗn hợp các chuỗi dài của alcohol (C26,C30,C33), một hỗn hợp các steroid (-sitosterol và stigmasterol), kaempferol, qrercetin, gallic acid và -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside, hai chất còn lại đang trong quá trình nghiên cứu

Năm 2008, nhóm nghiên cứu Shi-Bao Wu, Xu-Wen Li, Yun Zhao và Jin-Feng

Hu thuộc bộ môn của Các Sản Phẩm Tự Nhiên Nghiên Cứu Về hóa Chất Di Truyền

và Ying Wen, Zheng Zhao thuộc bộ bộ môn Dược Lý và Độc Chất trường Đại Học

Chuẩn Phương Đông, Trung Quốc Họ đăng bài viết vào ngày 25 tháng 09 năm

2008 được chấp nhận ngày 18 tháng 01 năm 2009 và có tài khoản online ngày 20 tháng 02 năm 2009 Đề tài của họ là “Nghiên cứu thành phần hóa học trên quả của

cây Sonneratia caseolaris (L.) và Sonneratia ovata (Sonneratiaceae)” và họ đã có

được kết quả như sau: chín chất (1-9) và bảy chất (1-6,10) lần lượt được phân lập từ

quả Sonneratia caseolaris và Sonneratia ovata Các cấu trúc của chúng được xác

định bởi sự so sánh dữ liệu MS và NMR của chúng tốt như các đặc tính vật lý có trong lý thuyết Tất cả các hợp chất được phân lập được sàn lọc thử nghiệm trên chuột dãy các tế bào C-6 sử dụng phương pháp thử nghiệm MTT; chỉ có hợp chất

(-)-(R)-nyasol (1), (-)-(R)-4′-O-methylnyasol (2) và maslinic acid (6) được phát hiện

có biểu hiện khả năng giết chết tế bào

1.1.5.3 Một số hợp chất được phân lập từ cây Bần chua 6

1.1.5.3.1 Luteolin

+ Tên khác: Digitoflavone, flacitran, luteolol…

+ Tên IUPAC: 5,7-dihydroxy-2-(3,4-dihydrophenyl)-4H-chromen-4-one

+ Công thức phân tử: C15H10O6

+ Công thức cấu tao:

O

OH OH

O OH HO

1.1.5.3.2 Luteolin 7-O-β-glucoside

+ Tên IUPAC:

2-yloxy)-5-hydroxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-4H-chromen-4-one

7-((2S,3R,4S,5S,6R)-tetrahydro-3,4,5-trihydroxy-6-(hdroxymethyl)-2H-pyran-+ Công thức cấu tạo:

O OH O

OH OH O

OH OH HO

O HO

1.1.5.3.3 Oleanolic acid

+ Tên IUPAC:

(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-carboxylic acid

H H

OH

OH OH

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

2.1 Các kỹ thuật chiết tách thông dụng2

2.1.1 Dung môi để tách chiết các hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu cây

Do cấu tạo hóa học của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phân tử tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ Do đó, việc khảo sát hợp chất tự nhiên nghĩa là chiết lấy và khảo sát các biến dưỡng thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ

Thông thường, người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính ái dầu với mức độ phân cực khác nhau Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất

có tính ái nước Vì vậy, việc chiết tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt với từng loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất ra bằng cách sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol

Nguyên tắc tổng quát là tùy vào đặc tính các chất biến dưỡng thứ cấp có trong từng loại cây mà sự lựa chọn dung môi và qui trình phù hợp để tách hợp chất ra khỏi cây Do đó, trước khi làm thực nghiệm cần phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo có liên quan trực tiếp đến loại cây cần khảo sát để chọn ra qui trình tách chiết phù hợp

Muốn tách chiết hợp chất ra khỏi cây cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹthuật chiết ngâm dầm, chiết Soxhlet, Sau khi chiết, phần bã cây hoặc sinh khối còn lại được lọc bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ởnhiệt độ thấp khoảng 30-40°C do nhiệt độ cao có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt

2.1.2 Lựa chọn dung môi chiết tách

Dung môi tách chiết phải trung tính, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết xong, dung môi có thể được loại bỏ

dễ dàng Hạn chế sử dụng dung môi độc như benzene hoặc diethyl ether, carbon tetrachloride,

2.1.3 Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi chiết tách

Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong những chai lọ bằng thủy tinh do trong môi trường chứa một số tạp bẩn, nhất là chất làm dẻo vì dung môi thường được chứa trong các thùng làm bằng nhựa dẻo

Methanol, chloroform thường chứa tạp chất di(2-ethylexyl) thường bị nhầm lẫn là hợp chất tự nhiên có trong cây cỏ khảo sát

Aceton có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhóm

cis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid

Choloroform, dichlorometan có thể tạo phản ứng với một vài loại alkaloid tạo thành alkaloid dạng muối tứ cấp và một vài hợp chất giả tạo khác

Diethyl ether ít được sử dụng để chiết tách hợp chất vì có nhiệt độ sôi thấp dễcháy, độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxide

dễ gây nổ

Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycoside (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phần đường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị

Sau khi chiết, dung môi có thể thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt

độ 30-40°C để không làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt

2.1.4 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Kỹ thuật này còn được gọi là sự chiết bằng dung môi Kỹ thuật chiết lỏng lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

-Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (thí dụ petroleum ether,…) sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo,…), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane,…)hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất có chứa nhóm

cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức -OH, -COOH,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh.

2.1.5 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng

2.1.5.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, đáy bình có van khóa, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dịch chiết Phía trên bình ngấm kiệt

là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết

Thực hành: bột cây được xay khô, lọt được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt lên trên lớp bông thủy tinh, đến gần đầy bình Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc

và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bềmặt lớp bột Từ từ rót dung môi vào bình đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt

Để yên một thời gian thường là 12-24 giờ Mở khóa bình ngấm kiệt cho dịch chiết chảy ra, đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi chảy vào bằng với vận tốc dịch chiết chảy ra khỏi bình ngấm

Phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn nhưng hiệu quả lại cao hơn và

ít mất công hơn phương pháp ngâm dầm, vì đây là quá trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ liên tục được thay thế bằng dung môi tinh khiết

2.1.5.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm

Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không gỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất có chứa trong cây

Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên

ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào

cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa mẫu cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một

số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách hỗn hợp gồm nhiều hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó với một hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh

Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở dạng lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (Gas Chromatography- GC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) Dựa vào cơ chế trao đổi giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành các nhóm nhỏ hơn: sắc ký hấp thu, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel,

Có rất nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, tuy nhiên trong điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp sắc ký chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký cột

hở và sắc ký lớp mỏng

2.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.2.1.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lóp mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (Planar Chromatography), dựa chủyếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel, hoặc oxide nhôm Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủlên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

 Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có

 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí

dụ như silica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm lá đỡ nhờ sulfate calci khan, hoặc tinh bột, hặc một loại polymer hữu cơ

 Mẫu cần phân tích: Mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1 microlit (1μL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

 Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi sẽ di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm

2.2.1.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng

Chỉ cần một lượng mẫu rất ít để phân tích

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc

ký đồ ở dạng một mũi hấp thụ rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó

là một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn

2.2.1.3 Công dụng của sắc ký lớp mỏng

Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập

Để kiểm tra lại hai hợp chất có giống nhau (xem chúng có phải cùng là một chất hay không).

Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát:

 Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu

 Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất

 Biết được sơ bộ về thành phần phần trăm của các hợp chất có trong mẫu ban đầu

 Biết sơ qua về tính phân cực của những thành phần hợp chất có trong mẫu

Để chuẩn bị cho sắc ký cột:

 Tìm hệ dung môi để bắt đầu cho việc sắc ký cột

 Để theo dõi cho quá trình sắc ký cột

Để theo dõi tiến trình của một phản ứng hữu cơ

Để kiểm tra một hợp chất kém bền

Để cô lập hợp chất

2.2.2 Phương pháp sắc ký cột hở

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường

là những hạt silica gel có kích thước tương đối lớn (50-150 μm) được nạp trong một cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột Hệ thống như thếthường làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với HPLC Tuy vậy, sắc ký cột

hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thểtriển khai với một lượng lớn mẫu chất

2.2.2.1 Chọn chất hấp thu để nhồi cột

Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu cần phân tính mà ta chon chất hấp thu phù hợp Với những hợp chất rất phân cực nên sử dụng sắc ký trao đổi ion hoặc sắc

ký lọc gel Còn bình thường sử dụng sắc ký hấp thu

2.2.2.2 Chọn hệ dung môi để giải ly cột

Trước khi tiến hành sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp

Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất phân cực khác nhau) thì chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết trên vị trí ở bản mỏng là Rf= 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết trên vị trí Rf= 0,2.Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc

ký cột, tuy nhiên phải chỉnh tỷ lệ dung môi của sắc ký cột sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn vì chất hấp thu trên bản mỏng có độ chặt chẽlớn hơn chất hấp thu trong cột

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi giải ly nào, nhất thiết phải tăng chậm: thêm mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng Ví dụ, đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzene, sẽ pha benzene vào hexan theo tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% benzene

Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột Do alumin hay silica gel khi trộn với bất kỳ loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này sẽ làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột Cột gãy sẽ làm mất đi tính liên tục của chất hấp thu vì thế không thể tách tốt được.