Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính adrogen từ rễ cây côngsêlên (prismatomeris memecyloides craid)

Kết quả ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng các cơ quan sinh dục chuột cống đực non thiến .... Mục tiêu cần đạt được 1 Tổng quan các tài liệu trong nước và nước ngoài có liên q

MỤC MỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1.Giới thiệu về chi Prismatomeris 3

1.1.1.Sơ lược về chi Prismatomeris 3

1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học của chi Prismatomeris 4

1.1.3 Tác dụng dược lý của chi Prismatomeris 12

1.2 Giới thiệu về cây Prismatomerismemecyloides (Craib.) 12

1.2.1.Đặc điểm thực vật của cây P memecyloides (Craib.) 12

1.2.2 Tác dụng dược lý của rễ cây P memecyloides (Craib.) 13

1.3 Tổng quan về androgen và phương pháp đánh giá hoạt tính androgen 14

1.3.1 Tổng quan về androgen 14

1.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính androgen 16

PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Phương pháp nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Phương pháp phân lập 19

2.1.3.Các phương pháp vật lý quang phổ xác định cấu trúc hóa học 21

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến 22

2.2.Thực nghiệm 24

2.2.1 Hóa chất và dụng cụ 24

2.2.2 Điều chế và phân lập các phần chiết của caocồn 70o từ rễ cây Côngsêlên 24

2.3.1 Hợp chất 1 (ký hiệu: MC-405) 27

2.3.2 Hợp chất 2 (ký hiệu: MC-406) 27

2.3.3 Hợp chất 3(ký hiệu: MC-411) 28

2.3.4.Hợp chất 4 (ký hiệu: MC-412) 28

2.3.5.Hợp chất 5 (ký hiệu: MC-423) 29

2.3.6 Hợp chất 6 (ký hiệu: MC-427) 29

PHẦN III KẾT QUẢ 30

3.1.Kết quả nghiên cứu tác dụng androgen của cao cồn 70o từ rễ cây Côngsêlên trên chuột cống đực non thiến 30

3.1.1 Kết quả ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng cơ thể chuột cống đực non thiến 30

3.1.2 Kết quả ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng các cơ quan sinh dục chuột cống đực non thiến 31

3.1.3 Kết quả ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên nồng độ testosteron trong máu chuột cống đực non thiến 32

3.2 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cao cồn 70o của rễ cây Côngsêlên 33

3.2.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (MC-405) 33

3.2.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (MC-406) 34

3.2.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (MC-411) 35

3.2.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 (MC-412) 35

3.2.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 (MC-423) 36

3.2.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 (MC-427) 37

KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC

em trong thời gian thực hiện khóa luận

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tớitập thể Phòng Hoạt chất sinh học (Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên) đã giúp đỡ em nhiệt tình trong suốt thời gian em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học (Viện Đại học Mở Hà Nội) đã giúp đỡ trong quá trình học tập, thực tập và hoàn thành khóa luận này

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà nội, ngày 23 tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Nguyễn Thế Huỳnh

MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

P : Prismatomeris

Erectile Dysfunction (ED): Rối loạn cương dương

TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng

CC (Column Chromatography): Sắc kí cột dưới trọng lực dung môi

FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh

Mini-C (Mini-Column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế

1H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng

từ hạt nhân cacbon 13

DEPT (Disstortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT

MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Các anthraquinones và anthraquinone glycosides (1-47) được phân

lập từ chi Prismatomeris……… 5

Hình 1.2: Các iridoid và iridoid glycosides (48-54) được phân lậptừ chi Prismatomeris……… 9

Hình 1.3: Các triterpenoids (55-61) và saponin (62) được phân lập từ chi Prismatomeris 10

Hình 1.4: Các phenolic glycosides (63-64) và phytosterols (65-66)được phân lập từ chi Prismatomeris 11

Hình 1.5: Rễ câyPrismatomeri memecyloides (Côngsêlên) ………13

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 (MC-405) 32

Hình 3.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (MC-406) 33

Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 (MC-411) 33

Hình 3.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 (MC-412) 34

Hình 3.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 (MC-423) 34

Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 (MC-427) 36

Bảng 1.1: Các anthraquinones và anthraquinone glycosides (1-47) được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris 8

Bảng 1.2: Các iridoid và iridoid glycosides (48-54) được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris 10

Bảng 1.3: Các triterpenoids (55-61) và saponin (62) được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris 11

Bảng 1.4: Các phenolic glycosides (63-64) và phytosterols (65-66) được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris 12

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng cơ thể chuột cống đực non thiến 30 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng các cơ quan sinh

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên nồng độ testosteron trong máu

chuột cống đực non thiến 32

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết rễ cây Côngsêlên 25

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân tách cao CHCl3 (A) từ rễ cây Côngsêlên 26

Sơ đồ 2.3: Quy trình phân tách cao H2O (C) từ rễ cây Côngsêlên 27

Cây Prismatomeris memecyloides Craib được người dân tộc Thái tỉnh Sơn

La gọi là cây Côngsêlên và được người dân sử dụng điều trị thiểu năng sinh dục nam và nâng cao sức khoẻ sinh lý

Theo Phạm Hoàng Hộ, cây Prismatomeris memecyloides Craib thuộc họ Cà

phê (Rubiaceae)-Lang trang dạng sầm, là cây tiểu mộc nhánh có vỏ nâu trắng, nhánh già nâu sậm Lá có phiến bầu dục to 9-12 x 3,5-4,5 cm, chót nhọn, đáy

tà, không lông, gân phụ 10 cặp, đi đến sát bìa mặt trên ôliu hay đen, mặt dưới nâu, cuống dài 6mm, lá bẹ mau rụng Chụm ở chót nhánh, cọng hoa như chỉ, dài 2 cm, đài hình ly cao 1,5mm, răng rất thấp, vành cao đến 2cm, ống mảnh, không lông, tai 5, mỏng

Rối loạn chức năngcương dươnglà mộtrối loạndo quá trình lão hóa, tăng huyết áp,tăng cholesterol máu, đái tháo đường, bệnh tim mạch và trầm cảm.Cương cứngdương vậtlà mộtquá trình phức tạpliên quan đếntâm lývànội tiết tốđầu vào, vàcơ chếnoncholinergic và nonadrenergic Nitric oxide (NO) được cho làảnh hưởng tới sự cương cứngcủa dương vật theo cơ chếnoncholinergic và nonadrenergic NOkích hoạtguanylylcyclasehòa tan, làm tăng 3 ',5'-cyclic guanosinemonophosphate(cGMP)ở các tế bàonội mô trongthể hangcủa dương vật.Suy giảmNOlà một trong những nguyên nhân gây bệnhrối loạn chức năngcương dương

Ngoài ra, suy giảm nội tiết tố đầu vào là một trong các nguyên nhân gây chứng ED Androgen là một hormon sinh dục giống đực, đóng vai trò quan

trọng trong chức năng sinh sản của giống đực Nó cần thiết để hình thành và duy trì đặc tính sinh dục nam thứ phát, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và hoạt động tình dục Trên thế giới hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất để đánh giá hoạt tính androgen của thuốc là phương pháp Hershberger Phương pháp Hershberger là một phương pháp thường qui, có giá trị, dễ tiến

hành và thường được chọn cho những sàng lọc in vivo nhằm phát hiện các

thuốc có tính chủ vận hay đối kháng với androgen

Do vậy, “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính adrogen từ rễ cây

Côngsêlên(Prismatomeris memecyloides Craib.)” mang ý nghĩa thiết thực Mục tiêu cần đạt được

1) Tổng quan các tài liệu trong nước và nước ngoài có liên quan đến

chi Prismatomeris nói chung và cây Prismatomeris memecyloides nói riêng,

về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của các lớp chất Giới thiệu về cây

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Prismatomeris

1.1.1 Sơ lược về chi Prismatomeris

Prismatomerislà một chithực vật có hoathuộc họ Thiến

thảo(Rubiaceae)

Chi Prismatomeris phân bố chủ yếu ở Ấn Độ, phía nam Trung Quốc,

các nước Ðông Dương, bán đảo và quần đảo Malaysia

Tại Việt Nam, chi Prismatomeris đã được Phạm Hoàng Hộ (2000) ghi nhận gồm 5 loài: P tetrandra (Roxb.)K Schum, P tetrandra subsp malayana (Ridl.), P filamentosa (Craib.), P memecyloides (Craib.), P sessiliflora (Pit.) [1]

Prismatomeris tetrandra (Roxb.) K Schum (Lăng trang)

Đại mộc cao 2-8 m, không lông, nhánh nhiều Lá có phiến xoan ngược, dài 8-14 cm, dai, xám dợt hay nâu vàng lúc khô, cuống 5-7 mm, lá bẹ 2-3

mm Hoa có cọng dài, trắng, thơm, dài 2 mm, vành có ống cao 10-15 mm, noãn sào 2 buồng Phì quả cao 9-15 mm, đen đen,hạt 2, cao 5 mm

Cây ra hoa tháng 1-6, có quả tháng 8-11

Tên gọi khác: cây Mui

Phân bố: Quảng Ninh, Đồng Nai (Biên Hòa), Tây Ninh, An Giang

Prismatomeris tetrandra subsp malayana (Ridl.) J.J.Johanss

(Lang trang Malay)

Tiểu mộc, cành non vuông vuông Lá có phiến bầu dục thon, 10,5 x 3,8

cm, chót có múi, đáy nhọn, gân phụ 8 cặp, cuống dài 1 cm, lá bẹ nhọn, dài 1-2

mm Tán ở ngọn nhánh, cọng hoa mảnh như chỉ, dài 1 cm, đài hình chén, 5 răng, vành hoa có ống cao 11-21 mm, tai trắng, dài 7-14 mm, noãn sào 2 buồng, 1 noãn Phì quả tròn tròn, to 7 mm, hạt 1-2

Phân bố:Khánh Hòa (Nha Trang)

Prismatomeris filamentosa (Craib.) (Lang trang sợi)

Lá có phiến bầu dục tròn dài, to 8,5 x 3,5 cm, tà ở hai đầu, gân phụ

10-11 cặp, lồi ở hai mặt, vàng vàng, cuống dài 6-8 mm, lá bẹ cao 1-2 mm Hoa ở chót nhánh, tán không cọng, không lông, cọng hoa 1 cm, đài hình chén, 5 răng thấp, vành có ống dài 13 mm, tai dài 5-7 mm, noãn sào 2 buồng 1 noãn, vòi nhụy thò Phì quả xoan, cao 8 mm

Prismatomeris sessiliflora (Pit.) (Lang trang hoa không cọng)

Nhánh nâu vàng, láng Lá có phiến bầu dục dài, to 15-20 x 3-5 cm, không lông, bìa nguyên, gân phụ 7-10 cặp, lúc khô vàng vàng, cuống ngắn, lá

bẹ có 2 múi Tán trên cọng dài ở nách lá, cọng hoa ngắn, không đến 3 mm, đài hình chén, răng nhỏ, vành có ống dài 2 cm, tai thon nhọn, dài 6-7 mm Phì quả to vào 5 mm

Phân bố: Đồng Nai

1.2.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học của Prismatomeris

Trên thế giới, cho đến nay mới chỉ cómột số công trình nghiên cứu về

một số loài như P malayana, P tetrandra, P.fragrans, P connata

Các lớp chất chính được phát hiện từ các loài trên bao gồm: Anthraquinones, anthraquinone glycosides, iridoid and iridoid glycosides, triterpenoids, saponin, phenolic glycosides và phytosterols

Một số tác dụng sinh học của các hợp chất trên như gây độc tế bào, chống co thắt, kháng lao, kháng nấm đã được công bố [2-6]

Các anthraquinones và anthraquinone glycosides

Hình 1.2: Các anthraquinones và anthraquinone glycosides (1-47)

được phân lập từ chi Prismatomeris

33 1-O-methylrubiadin 3-O-β-primeveroside P connata

34 Damnacanthol 3-O-β-primeveroside P connata

35 Rubiadin 3-O-β-primerveroside P connata

Bảng 1.1: Các anthraquinones và anthraquinone glycosides (1-47)

được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris

Các iridoid và iridoid glycosides

Hình 1.3: Các iridoid và iridoid glycosides (48-54) được phân lập

từ chiPrismatomeris

Bảng 1.2: Các iridoid và iridoid glycosides (48-54) được phân lập

từ các loài của chi Prismatomeris

STT Chất Loài

56 3β-O-acetyl-11α,12α -epoxyolean-28,13-olide P fragrans

P tetrandra

Bảng 1.3: Các triterpenoids (55-61) và saponin (62) được phân lập

từ các loài của chi Prismatomeris

Các phenolic glycosides và phytosterols

Hình 1.5: Các phenolic glycosides (63-64) và phytosterols (65-66)

được phân lập từ chi Prismatomeris

Bảng 1.4: Các phenolic glycosides (63-64) và phytosterols (65-66)

được phân lập từ các loài của chi Prismatomeris

1.1.3 Tác dụng dược lý của chi Prismatomeris

Từ những năm cuối thế kỉ 20 trở lại đây, các nghiên cứu về chi

Prismatomeris còn khá ít và tập trung chủ yếu vào 4 loài P connata, P fragrans, P malayana và P.tetrandra

+ Từ rễ cây P connata, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập

dược6 hợp chất anthraquinone glucoside và có độc tính thấp với dòng ung thư

A549 và HepG2[7]

+ Từ rễ và thân cây P fragrans, 7 hợp chất anthraquinone và 03

triterpenoid đã được phân lập Các hợp chất trên đều có tác dụng kháng bệnh sốt rét, kháng lao, kháng nấm, kháng dòng ung thư BC và NCI-H187[8]

1.2 Giới thiệu về câyPrismatomeris memecyloides

1.2.1 Đặc điểm thực vật của cây Prismatomeris memecyloides

Prismatomeris memecyloides là một loài thực vật có hoa trong họ Thiến thảo Loài này được Craib miêu tả khoa học đầu tiên năm 1932 [9] Theo Phạm Hoàng Hộ, cây Prismatomeris memecyloides(Craib.) thuộc

họ Cà phê (Rubiaceae) - Lang trang dạng sầm, là cây tiểu mộc nhánh có vỏ nâu trắng, nhánh già nâu sậm Lá có phiến bầu dục to 9-12 x 3,5-4,5 cm, chót nhọn, đáy tà, không lông, gân phụ 10 cặp, đi đến sát bìa mặt trên ôliu hay đen, mặt dưới nâu, cuống dài 6mm, lá bẹ mau rụng Chụm ở chót nhánh, cọng hoa

nhưchỉ, dài 2 cm, đài hình ly cao 1,5mm, răng rất thấp, vành cao đến 2cm, ống mảnh, không lông, tai 5, mỏng [1]

Cây Prismatomeris memecyloides Craib được người dân tộc Thái tỉnh

Sơn La gọi là cây Côngsêlên và được người dân sử dụng điều trị thiểu năng sinh dục nam và nâng cao sức khoẻ

Phân bố: Vùng rừng núi Tây Nguyên, và chủ yếu là các vùng rừng núi

phía bắc bao gồm Hòa Bình, Lào Cai, Lai Châu, Lạng Sơn và Tuyên Quang

Hình 1.1: Rễcây Côngsêlên 1.2.2 Tác dụng dược lý của rễ cây Prismatomeris memecyloides (Craib.)

Cây Côngsêlên được nghiên cứu sơ bộ về mặt hóa học và tác dụng sinh học lần đầu tiên bởi bác sĩ Phạm Xuân Khu và cộng sự tại Bệnh Viện tỉnh Sơn La trong đề tài cấp tỉnh Sơn La năm 2005-2006 “Điều tra nghiên cứu bài thuốc nam của dân tộc Thái tỉnh Sơn La điều trị thiểu năng sinh dục nam”[10]

Về kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học: Đã phát hiện cao nước rễ Côngsêlên ở liều 0,5ml/ngày có tác dụng tăng cường nội tiết sinh dục namkiểu Testosteron trong mô hình chuột bị cắt bỏ tinh hoàn Cao nước rễ Côngsêlên không gây độc tính cấp (không xác định được LD50)

1.3 Tổng quan về androgen và phương pháp đánh giá hoạt tính androgen

1.3.1 Tổng quan về androgen

Androgen là một hormon sinh dục giống đực, đóng vai trò quan trọng trong chức năng sinh sản của giống đực Nó cần thiết để hình thành và duy trì đặc tính sinh dục nam thứ phát, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và hoạt động tình dục

Ở người, androgen quan trọng nhất do tinh hoàn tiết ra là testosteron Các androgen khác là androstenedion, dehydroepiandrosteron đều có tác dụng yếu Mỗi ngày cơ thể sản xuất khoảng 8 mg testosteron Trong đó, 95% là do

tế bào Leydig, còn 5% là do thượng thận

Lượng testosterone thay đổi trong ngày, cao nhất vào lúc sáng sớm Bình thường, lượng testosterone là 300-1200 nanogram/dl Hàm lượng testosterone cao nhất ở tuổi 20, sau đó cứ 10 năm sụt giảm 10% Nam giới sau

30 tuổi, mỗi năm lượng testosterone hụt mất khoảng 1,5%, nếu vì một lý do nào đó mà giảm quá mức testosterone thì sẽ xuất hiện những triệu chứng như giảm ham muốn tình dục, giảm khoái cảm, giảm khối lượng cơ, tăng mỡ bụng, trầm cảm, chán nản

Huyết tương phụ nữ có nồng độ testosteron khoảng 0,03 µg/ dL do nguồn gốc từ buồng trứng và thượng thận

Khoảng 65% testosteron trong máu gắn vào sex hormone-binding globulin (TeBG), phần lớn số còn lại gắn vào albumin, chỉ khoảng 2% ở dạng

tự do có khả năng nhập vào tế bào để gắn vào receptor nội bào

Tác dụng của androgen

- Làm phát triển tuyến tiền liệt, túi tinh, cơ quan sinh dục nam và đặc tính sinh dục thứ yếu

- Đối kháng với estrogen

- Làm tăng tổng hợp protein, phát triển xương, làm cho cơ thể phát triển nhanh khi dậy thì (cơ bắp nở nang, xương dài ra) Sau đó sụn nối bị cốt hóa

- Kích thích tạo hồng cầu, làm tăng tổng hợp heme và globin

- Testosteron không phải là dạng có hoạt tính mạnh Tại tế bào đích, dưới tác dụng của 5 α - reductase, nó chuyển thành dihydrotestosteron có hoạt tính.Cả 2 cùng gắn vào receptor trong bào tương để phát huy tác dụng Trong bệnh lưỡng tính giả, tuy cơ thể vẫn tiết testosteron bình thường, nhưng tế bào đích thiếu 5α - reductase hoặc thiếu protein receptor với testosteron và dihydrotestosteron (Griffin, 1982), nên testosteron không phát huy được tác dụng

- Dưới tác dụng của aromatase ở một số mô (mỡ, gan, hạ khâu não), testosteron có thể chuyển thành estradiol, có vai trò điều hòa chức phận sinh dục

Phân hủy và thải trừ

Lượng testosterone không được gắn với mô đích sẽ nhanh chóng bị biến đổi (chủ yếu do tác dụng của gan) thành androsterone và dehydroepiandrosterone và ở trạng thái kết hợp (glucoronide hay sulfate) rồi

đi vào ruột (theo mật) hoặc ra ngoài theo nước tiểu

Cơ chế nội sinh testosterone ở tinh hoàn và tuyến thượng thận

Ở động vật bình thường sự tổng hợp testosteron diễn ra chủ yếu ở tinh hoàn và một phần nhỏ tại tuyến thượng thận Ở tế bào Leydig của tinh hoàn, các phân tử cholesterol trên màng tế bào sẽ được vận chuyển vào bên trong, chuyển hóa thành pregnenolon, qua hàng loạt các phản ứng xúc tác bởi enzyme để tạo thành testosteron [11-13]

Một số nguyên nhân khiến lượng testosterone ở nam giới suy giảm

- Bệnh đái tháo đường: Đây là một nguyên nhân quan trọng của rối loạn cương cử, có thể do hẹp động mạch thẹn trong, tổn thương thần kinh thực vật hay tổn thương nội mô

- Ảnh hưởng của tuổi tác: Người lớn tuổi ít quan tâm tới tình dục, xem việc kém hoặc không cương cử cũng không phải là bệnh lý

- Một số bệnh bẩm sinh, bệnh tự miễn, HIV/AIDS, tác dụng phụ một

số thuốc, tai nạn gây chấn thương tinh hoàn, ung thư tinh hoàn, v/v

1.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính androgen

Trên thế giới hiện nay, phương pháp được dùng nhiều nhất để đánh giá

hoạt tính androgen của thuốc là phương pháp Hershberger[14]

Phương pháp Hershberger:Là một phương pháp thường qui, có giá trị,

dễ tiến hành và thường được chọn cho những sàng lọc in vivo nhằm phát hiện

các thuốc có tính chủ vận hay đối kháng với androgen Do chuột non đang thời kỳ sinh trưởng và phát triển mạnh nhất, đặc biệt là cơ quan sinh sản, nên nghiên cứu tác dụng của một thuốc hướng sinh dục trên chuột non cho kết quả

rõ nhất Dựa trên so sánh đối chiếu hai nhóm chuột cống đực non thiến và không thiến, sẽ đánh giá được tác dụng của thuốc lên chức năng sinh sản nam Đây là phương pháp tốt để phát hiện, so sánh và đánh giá các hoạt chất và dịch chiết cây thuốc hiệu quả dựa trên hoạt tính androgen[15-17]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, một số dịch chiết, phân đoạn và hoạt chất được chứng minh có tác dụng tăng cường sinh lực nam giới khi được thử bằng phương pháp in vitro, in vivo trên động vật và trên người + Dịch chiết nước của rễ cây Cnestis ferruginea (Họ Connaraceae)

ở liều 52mg/kgP làm tăng paroxetine trong hành vi tình dục trên chuột đực Wistar[18]

+Các phân đoạn phân bố như phân đoạn giàu indole alkaloid của cây

Aspidosperman uler (Họ Apocynaceae) ở liều 25 và 50 mg/kgP làm tăng sự

+ Phân đoạn clorofoc của cây Corchorus depressus có tác dụng in vitro trên tế bào cơ trơn của dương vật thỏ vàở liều 25 và 49 mg/kgP có tác dụng in vivo làm tăng hành vi tình dục trên chuột đực[20]

+ Một số các lớp chất tự nhiên đã được phát hiện có tác dụng như các

xanthone tách từ rễ cây Securidaca longepedunculata có tác dụng in vitro trên

tế bào cơ trơn của dương vật thỏ [21]

+ Các pyrano-isoflavones từ rễ cây Eriosema kraussianum, các hợp chất quassinoid từ rễ cây Eurycoma longifolia (Bá bệnh) có tác dụng in vitro

trên tế bào cơ trơn của dương vật thỏ[22]

+ Dịch chiết nước của cây Crocus satious (Họ Iridaceae) ở liều

200mg/kgP và 400 mg/kgP trên bệnh nhân RLCD trong 10 ngày[23]

Tóm lược các tài liệu nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy, khi

nghiên cứu các dịch chiết, phân đoạn hay hợp chất có tác dụng điều trị bệnh rối loạn cương dương và yếu sinh lý nam giới, các nhà khoa học thường đánh giá tác dụng tăng kích thích tế bào cơ trơn dương vật, tăng testosterone, tăng kích thích hormon sinh dục và hành vi tình dục trên động vật, v/v

Phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non không thiến

Chuột cống đực non 42-50 ngày tuổi, được nuôi ổn định 5 đến 7 ngày trong môi trường phòng thí nghiệm, sau đó tiến hành thí nghiệm theo các bước sau:

- Chia chuột ngẫu nhiên vào 5 lô, mỗi lô 10 con như sau:

+ Lô1: Uống dung môi pha thuốc

+ Lô 2: Tiêm dưới da đùi dung dịch testosterone

+ Lô 3: Uống mẫu thử X liều 1 (tương đương liều dự kiến dùng trên người)

+ Lô 4 và 5: Uống mẫu thử X liều tăng dần so với lô 3

- Chuột được uống thuốc thử hoặc dung môi mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng, trong vòng 10 ngày

- Đến ngày thứ 11 (24 giờ sau khi uống liều thuốc cuối cùng), cân trọng lượng chuột, sau đó giết chuột

- Lấy ít máu, li tâm tách huyết thanh để làm xét nghiệm định lượng nồng độ testosteron máu

- Bóc tách các cơ quan sinh dục bao gồm: túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn – hành hang, tuyến tiền liệt, đầu dương vật Sau đó cân ngay trên cân phân tích, riêng túi tinh được ép nhẹ cho hết tinh dịch rồi mới cân

- Kết quả được tính theo trọng lượng cơ quan (mg)/10g trọng lượng cơ thể chuột

- So sánh kết quả giữa các lô

Phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến

Cơ bản quy trình giống phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non không thiến, tuy nhiên trước khi chia chuột vào 5 lô, mỗi lô 10 con thì cần:

- Gây mê chuột bằng thiopental Sau đó thiến chuột, cắt bỏ 2 tinh hoàn

PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu rễ Côngsêlên được thu hái tại Lạng Sơn

Mẫu được nhà thực vật học Ngô Văn Trại (Viện Dược liệu)giám định Mẫu tiêu bản số C-521 được lưu giữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô và sấy ở nhiệt độ 40°C cho đến khô Mẫu khô tiếp tục được đem đi xay nhỏ và sau đó ngâm chiết 3 lần (3 lít/lần)với cồn 70o trong 3 ngày ở nhiệt

độ phòng thu được dịch chiết Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng Cặn chiết này được phân bố trong các dung môi clorofom, etyl axetat, thu được cao CHCl3, caoEtOAc và phần còn lại là dịch nước (cao H2O)

Các dung môi dùng để chiết tách và chạy sắc ký là dung môi công nghiệp được làm khan, lọc và cất lại trước khi sử dụng

2.1.2 Phương pháp phân lập

* Phương pháp chiết dung môi

Rễ cây Côngsêlên được chiết hai pha rắn-lỏng với cồn 70° ở nhiệt độ phòng

* Phương pháp chiết hai pha lỏng

Phần chiết cồn 70o được phân bố giữa nước và các dung môi hữu cơ khác nhau nhằm làm giàu các lớp chất theo độ phân cực tăng dần

* Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng tráng sẵn DC-Alufolien silica gel 60F254 (Merck), RP18 F254s

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC):Là phương pháp hiện đang được

sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hóa học, sinh học, hóa dược với nhiều mục đích khác nhau do các đặc tính ưu việt như: độ nhạy cao, lượng mẫu phân tích nhỏ (từ 1 đến 100 μg), tốc độ phân tích nhanh, kỹ thuật phân tích dễ thực hiện Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) có thể được dùng để phân tích định tính hay định lượng hoặc kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký cột để xác định điều kiện phân tách

Chuẩn bị mẫu phân tích: Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp

(1 mg/ml), sau đó dùng capilla hút dịch mẫu bằng lực mao quản chuyển dung dịch mẫu lên trên lớp chất hấp phụ ở vị trí của tuyến xuất phát

Dung môi khai triển: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm

khan và chưng cất lại trước khi sử dụng Các hệ dung môi được pha theo tỉ lệ phù hợp Sau khi pha phải đậy kín và lắc kĩ cho các dung môi trong hệ trộn đều với nhau rồi cho vào bình triển khai sắc kí có đáy có nút nhám kín Để yên đến khi dung môi trong bình bão hòa rồi mới tiến hành khai triển bản mỏng

Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt kích thước phù hợp, có hai

tuyến dung môi là tuyến trên và tuyến dưới Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình chạy sắc ký, đậy nắp kín, để yên quan sát Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành nhận biết vệt chất trên bản mỏn

Phát hiện vệt chất trên bản mỏng:

Đèn tử ngoại: Bản mỏng sau khi chạy triển khai được chiếu dưới các bước sóng tử ngoại λ=254 nm và λ= 365 nm

Thuốc thử hiện màu: Bản mỏng được phun các thuốc thử đặc hiệu

Đánh dấu các vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc các vệt chất Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh gia sơ bộ lượng hợp chất trong

hỗn hợp, khả năng phân giải hệ của dung môi và định hướng cho phân tách

sắc ký điều chế

* Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành với các chất hấp phụ khác nhau (silica gel, Diaion HP- 20, sephadex- LH- 20)

- Sắc ký cột thường (CC): được thực hiện dưới trọng lực của dung môi

trên silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất Dùng để tách chất sau khi đã lựa chọn được dung môi thích hợp từ TLC Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm Silicagel dạng bột và được nhồi vào cột (thủy tinh) Chất cần tách sẽ được đưa lên cột Việc đưa chất lên cột tách là rất quan trọng phụ thuộc vào lượng chất và dạng chất Có thể đưa ở dạng tẩm bột (nhồi khô) hoặc trực tiếp đưa chất lên sau khi hòa tan chất trong dung môi thích hợp (nhồi ướt) Saukhi nhồi tiến hành cho chạy cột bằng cách cho hệ dung môi đã chọn chảy và hứng lấy chất

Phân tách hỗn hợp các chất được thực hiện dựa trên sự khác biệt về tốc

độ di chuyển của các chất khi pha động đi qua pha tĩnh Pha tĩnh thường là silica gel được nhồi trong cột sắc ký và pha động là hệ dung môi chạy cột

* Phương pháp kết tinh lại

Phương pháp này được sử dụng để tách và làm sạch chất rắn Việc làm sạch chất rắn bằng kết tinh là dựa trên sự khác nhau về độ tan của hợp chất mục tiêu và của tạp chất trong dung môi hoặc một hệ dung môi đã chọn

2.1.3 Các phương pháp vật lý quang phổ xác định cấu trúc hóa học

Cấu trúc hoá học của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp hóa lý hiện đại

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR:Nguyên lý chung là sự cộng

hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR) dưới tác dụng của từ trường ngoài

+ Phổ 1 H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton):xác định độ

dịch chuyển hóa học của các nguyên tử H xác định trong khoảng từ 0ppm đến

14 ppm tùy mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.Phổ 1H được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS là chất chuẩn nội tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

+ Phổ 13 C-NMR(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13): cho tín

hiệu vạch phổ của C Thang phổ C từ 0 ppm đến 240 ppm Tín hiệu trên phổ này xác định được bậc của từng C trong phân tử (đo tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

+ Phổ 2D-NMR(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều): gồm phổ

HSQC, 1H-1H COSY, 1H-13C HMBC, 1H-1H NOESY, cho phép xác định các tương tác của hạt nhân từ của phân tử trong không gian 2 chiều (đo tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Sự kết hợp đồng bộ giữa các phổ NMR giúp cho việc xác định cấu trúc hóa học được chính xác

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen trên chuột cống đực non thiến

Nguyên liệu nghiên cứu

Rễ cây Côngsêlên(Prismatomeris memecyloides Craib.) được thu háitại tỉnh

Sơn La (số tiêu bản C-521) Tên cây do nhà thực vật học Ngô Văn Trại -Viện Dược liệu giám định Liều dùng trên người là 30 g dược liệu/ngày

Mẫu rễ cây lấy về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô và xay nhỏ thành bột Rễ cây Côngsêlên (100 g) được chiết với cồn (EtOH)700 ở nhiệt độ phòng, lọc và loại dung môi, thu được cao chiết cồn 700

Mẫu nghiên cứu: Cao chiết cồn 700 (kí hiệu là PME) Tỉ lệ chiết 2 g dược liệu thu được 100 mg cao

Đối tượng nghiên cứu

- Chuột cống trắng chủng Wistar, đực non, khỏe mạnh, 20 đến 34 ngày

tuổi do Học viện Quân y cung cấp

- Chuột cống trắng chủng Wistar, đực, trưởng thành, khỏe mạnh, 42

đến 50 ngày tuổi do Học viện Quân y cung cấp

Trước và trong suốt quá trình nghiên cứu, chuột được nuôi bằng thức

ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

Thuốc, hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu

- Thuốc tiêm testosteron propionat

- Bột pha tiêm thiopental

- Nước cất pha tiêm

Áp dụng mô hình Hershberger trên chuột cống đực non [24]

Chuột cống đực non 42 - 50 ngày tuổi, được nuôi ổn định trong môi trường phòng thí nghiệm, được chia thành 5 lô (mỗi lô 10 con)

- Chuột ở lô 1 không thiến

- Chuột ở các lô 2 đến lô 5 được thiến, cắt bỏ 2 tinh hoàn 2 bên

- Cho chuột nghỉ ngơi 7 ngày

- Sau đó, chuột được cho dùng thuốc thử hoặc nước mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng, trong 10 ngày như sau:

+ Lô 1 (chứng sinh học): uống nước với thể tích 10ml/kg thể trọng/ngày

+ Lô 2 (mô hình): uống nước với thể tích 10ml/kg thể trọng/ngày + Lô 3 (chứng dương): tiêm dưới da da đùi dung dịch testosteron propionat với liều 0,4mg/kg thể trọng/ngày

+ Lô 4: uống mẫu PME liều 210 mg/kg thể trọng/ngày

+ Lô 5: uống mẫu PME liều 630 mg/kg thể trọng/ngày

- Đến ngày thứ 11 (24 giờ sau khi uống liều thuốc cuối cùng), cân trọng lượng chuột, sau đó, giết chuột

- Lấy máu chuột, định lượng testosteron

- Bóc tách các cơ quan sinh dục phụ bao gồm: túi tinh, tuyến cowper, cơ nâng hậu môn – hành hang, tuyến tiền liệt, đầu dương vật Sau đó cân ngay trên cân phân tích, riêng túi tinh được ép nhẹ cho hết tinh dịch rồi mới cân

- Kết quả được tính theo trọng lượng cơ quan (mg)/100 g trọng lượng cơ thể chuột

- So sánh giữa các lô với nhau

Xử lý số liệu:Các số liệu thu được biểu diễn dưới dạng Trung bình ± SE

và được xử lý bằng các thuật toán thống kê thích hợp.Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

2.2 Thực nghiệm

2.2.1 Hóa chất và dụng cụ

- Hóa chất: Metanol, clorofom, nước cất, diclometan…

- Dụng cụ: Máy cô quay chân không, máy hứng phân đoạn, máy đo

điểm nóng chảy, cột sắc ký, cốc thủy tinh, ống nghiệm, bản mỏng silica gel, bản mỏng pha đảo YMC, hạt silica gel

2.2.2 Điều chế và phân lập các phần chiết của cao cồn 70 o

Rễ cây Côngsêlên (1kg) được chiết 3 lần (3 lít/lần) trong 3 ngày bằng cồn 70o, cô cất loại bỏ dung môi thu được cao chiết cồn 70otổng(70,80 g) Tiếp tục thêm nước cất (tỉ lệ 1:1) rồi chiết phân bố lần lượt với các dung môi clorofom, etyl axetat,thu được 10 g cao CHCl3 (A); 0,8 g caoEtOAc (B) và 60g cao H2O (C)

Sơ đồ 2.1:Sơ đồ chiết rễ cây Côngsêlên

Phân tách phần chiết CHCl 3 (A)

Cao chiết A (10 g) được đưa lên cột nhồi silica gel40-60 µm, rửa giải

với hệ dung môi n-hexan:axeton với độ phân cực tăng dần, thu được 06 phân

đoạn (A1-A6)

- Phân đoạn A3 (0,60 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường

với hệ n-hexan:axeton (7:1, v/v), thu được 12 phân đoạn (A3A-A3L)

+ Phân đoạn A3C (100 mg) được rửa giải với dung môi

n-hexan:CH2Cl2:CH3OH (10:1:0,1) trên cột silica gel pha thường, thu được hợp

chất MC-405(5 mg)

+ Phân đoạn A3J (140 mg) được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel pha thường, rửa giải với dung môi CH2Cl2 100%, thu được hợp chất MC-406(56 mg)

- Phân đoạn A5 (2,50 g) tiếp tục được rửa giải trên cột silica gel pha

thường với hệ dung môi n-hexan:axeton (7:1, v/v), thu được hợp chất

MC-411 (28 mg) và hai phân đoạn A5B và A5C

+ Phân đoạn A5B (300 mg) được đưa lêncột silica gel pha thường với

hệ rửa giải n-hexan:axeton (7:1, v/v), thu được hợp chất MC-412 (5 mg)

Rễ cây Côngsêlên (1 kg)

Cao H2O (C) (60g)

1 Thêm nước cất (tỉ lệ 1:1)

2 Chiết phân bố lần lượt với các dung môi CHCl 3, EtOAc, H 2 O

Sơ đồ 2.2:Quy trìnhphân tách cao CHCl 3 (A) từ rễ cây Côngsêlên

Phân tách phần chiết H 2 O (C)

Cao chiết C (60 g) được xử lý với cột Diaion và rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1, v/v) thu được 3 phân đoạn (C1-C3)

Cao CHCl 3 (A) (10 g)

A1

1,33 g

A2 1,10 g

A3 0,60 g

A4 1,35 g

A5 2,50 g

A6 3,12 g

1 Đưa lên cột nhồi silica gel40-60 µm

2 Rửa giải với hệ dung môi n-hexan:axeton

1 Rửa giải trên cột silica gel pha thường

2.Chạy cột với hệ dung môi

1 Rửa giải trên cột silica gel pha thường

2 Chạy cột với hệ dung môi n-hexan:axeton (7:1, v/v)

A3L

63 mg

1 Cột silica gel pha thường

2 Rửa giải bằng dung môi CH 2 Cl 2

100%

- Phân đoạn C2 (4,10 g) tiếp tục được phân tách qua nhiều cột sắc ký cột pha thường (hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O theo tỉ lệ 4:1:0,1; 2:1:0,1) và pha đảo RP- C18 (hệ dung môi MeOH:H2O theo tỉ lệ 5:1; 4:1, v/v) thu được

hợp chất MC-423(600 mg) và MC-427 (56 mg)

Sơ đồ2.3:Quy trình phân tách cao H 2 O (C) từ rễ cây Côngsêlên

2.3 Dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được

Phổ 13 C-NMR (DMSO, 125 MHz) δC ppm: 164,5 (C-1), 120,2 (C-2), 165,2 (C-3), 111,2 (C-4), 140,1 (C-4a), 126,4 (C-5), 133,7 (C-6), 134,6 (C-7), 126,8 (C-8), 135,0 (C-8a), 179,6 (C-9), 117,8 (C-9a), 181,8 (C-10), 132,1 (C-10a), 63,7 (OCH3), 192,8 (CHO)

2.3.2 Hợp chất 2 (ký hiệu: MC-406)

(C16H12O5, M = 424);bột màu vàng, tan tốt trong CHCl3

Cao H2O (C) (60g)

C2 4,10 g

C1 21,37 g

C3 34,53 g

Cột pha đảo RP-C18 với hệ dung môi MeOH:H 2 O theo tỉ

lệ 5:1; 4:1, v/v

1 Xử lý với cột Diaion

2 Rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (3:1, v/v)

Phổ 1 H-NMR (DMSO, 500 MHz) δH ppm: 7,21 (1H, s, H-4), 8,09 (1H,

dd, 1,5; 7,25 Hz, H-5), 7,85 (1H, dt, 1,5; 7,5 Hz, H-6), 7,88 (1H, dt, 1,5; 7,5

Hz, H-7), 8,15 (1H, dd, 1,5; 7,5 Hz, H-8), 4,40 (2H, s, CH2O), 3,35 (3H, s, OCH3), 13,18 (1H, s, 3-OH)

Phổ 13 C-NMR (DMSO, 125 MHz) δC ppm: 163,7 (C-1), 116,6 (C-2), 164,1 (C-3), 107,5 (C-4), 133,8 (C-4a), 126,7 (C-5), 134,4 (C-6), 134,6 (C-7), 126,3 (C-8), 132,9 (C-8a), 186,1 (C-9), 109,0 (C-9a), 181,7 (C-10), 132,7 (C-10a), 61,0 (CH2O), 57,6 (OCH3)

2.3.3 Hợp chất 3 (ký hiệu: MC-411)

(C15H10O4, M = 283); bột màu vàng, tan tốt trong MeOH

Phổ 1 H-NMR (DMSO, 500 MHz) δH ppm: 7,22 (1H, s, H-4), 8,10 (1H,

dd, 2,0; 7,0 Hz, H-5), 7,88 (2H, m, H-6,7), 8,16 (1H, dd, 2,0; 7,0 Hz, H-8), 13,08 (1H, s, 2-OH), 2,05 (3H, s, CH3)

Phổ 13 C-NMR (DMSO, 125 MHz) δC ppm: 162,8 (C-1), 162,4 (C-2), 133,0 (C-3), 107,3 (C-4), 131,7 (C-4a), 126,4 (C-5), 134,5 (C-6), 134,4 (C-7), 126,7 (C-8), 117,3 (C-8a), 186,3 (C-9), 109,0 (C-9a), 181,8 (C-10), 132,9 (C-10a), 8,0 (CH3)

Phổ 13 C-NMR (DMSO, 125 MHz) δC ppm: 161,5 (C-1), 117,9 (C-2), 160,6 (C-3), 109,0 (C-4), 133,7 (C-4a), 126,0 (C-5), 133,3 (C-6), 134,5 (C-7), 126,6 (C-8), 134,5 (C-8a), 180,3 (C-9), 126,1 (C-9a), 182,6 (C-10), 132,0 (C-10a), 60,6 (OCH3), 9,0 (CH3)

2.3.5 Hợp chất 5 (ký hiệu: MC-423)

(C18H24O12, M = 432); chất rắn màu trắng, tan tốt trong MeOH

Phổ 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz)δH ppm: 5,09 (1H, d, 9,0, H-1), 7,66

(1H, d, 1,5 Hz, H-3), 3,04 (1H, dd, 1,0; 7,0 Hz, H-5), 4,82 (1H, overlap, H-6), 6,04 (1H, s, H-7), 2,66 (1H, t, 8,0 Hz, H-9), 4,98 (1H, d, 15,5 Hz, Ha-10) 4,81 (1H, d, 15,5 Hz, Hb-10), 2,11 (3H, s, 12- COCH3), 4,74 (1H, d, 7,5 Hz, H-1'), 3,27 (1H, m, H-2'), 3,40 (1H, t, 9,0 Hz, H-3'), 3,27 (2H, m, H-4', 5'), 3,64 (1H,

dd, 6,0; 12,0 Hz, Ha-6'), 3,88 (1H, dd, 1,5; 12,0 Hz, Hb-6')

Phổ 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)δC ppm: 101,3 (C-1), 155,2 (C-3), 108,1 (C-4), 42,5 (C-5), 75,4 (C-6), 131,9 (C-7), 145,9 (C-8), 46,3 (C-9), 63,8 (C-10), 169,3 (C-11), 172,5 (C-12), 20,7 (12-COCH3), 100,6 (C-1'), 74,9 (C-

2'), 78,6 (C-3'), 71,6 (C-4'), 77,9 (C-5'), 63,0 (C-6')

2.3.6 Hợp chất 6 (ký hiệu: MC-427)

(C19H26O12, M = 446),chất bột màu trắng, tan tốt trong MeOH

Phổ 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) δH ppm: 5,09 (1H, d, 9,0 Hz, H-1), 7,68 (1H, d, 1,5 Hz, H-3), 3,06 (1H, dd, 1,5; 6.0 Hz, H-5), 4,85 (1H, overlap, H-6), 6,04 (1H, brd, 1,5 Hz, H-7), 2,66 (1H, t, 8,0 Hz, H-9), 4,96 (1H, d, 15,5

Hz, Ha-10), 4,82 (1H, d, 15,5 Hz, Hb-10), 3,77 (3H, s, 11-OCH3), 2,11 (3H, s, 12-COCH3), 4,74 (1H, d, 8,0 Hz, H-1'), 3,27 (1H, m, H-2'), 3,40 (1H, t, 9,0

Hz, H-3'), 3,27 (2H, m, H-4', 5'), 3,64 (1H, dd, 6,0; 12,0 Hz, Hb-6'), 3,88 (1H,

dd, 1,5; 12,0 Hz, Ha-6')

Phổ 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz)δC ppm: 101,3 (C-1), 155,4 (C-3), 108,1 (C-4), 42,4 (C-5), 75,4 (C-6), 131,8 (C-7), 145,9 (C-8), 46,3 (C-9), 63,8 (C-10), 169,3 (C-11), 172,5 (C-12), 51,8 (11-OCH3), 20,7 (12-COCH3), 100,6

(C-1'), 74,9 (C-2'), 78,6 (C-3'), 71,6 (C-4'), 77,9 (C-5'), 63,0 (C-6')

PHẦN III KẾT QUẢ

3.1 Kết quả nghiên cứu tác dụng androgen của cao cồn 70 o từ rễ cây Côngsêlên trên chuột cống đực non thiến

3.1.1 Kết quả ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng cơ thể chuột cống đực non thiến

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu lên trọng lượng cơ

thể chuột cống đực non thiến

Nhận xét:Kết quả ở bảng 1 cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột ở các

lô nghiên cứu không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)