Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính adrogen từ rễ cây côngsêlên (prismatomeris memecyloides craid)

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC MỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu chi Prismatomeris 1.1.1.Sơ lược chi Prismatomeris 1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Prismatomeris 1.1.3 Tác dụng dược lý chi Prismatomeris 12 1.2 Giới thiệu Prismatomerismemecyloides (Craib.) 12 1.2.1.Đặc điểm thực vật P memecyloides (Craib.) 12 1.2.2 Tác dụng dược lý rễ P memecyloides (Craib.) 13 1.3 Tổng quan androgen phương pháp đánh giá hoạt tính androgen 14 1.3.1 Tổng quan androgen 14 1.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính androgen 16 PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Phương pháp nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Phương pháp phân lập 19 2.1.3.Các phương pháp vật lý quang phổ xác định cấu trúc hóa học 21 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính androgen chuột cống đực non thiến 22 2.2.Thực nghiệm 24 2.2.1 Hóa chất dụng cụ 24 2.2.2 Điều chế phân lập phần chiết caocồn 70o từ rễ Côngsêlên 24 2.3.Dữ kiện phổ hợp chất phân lập 27 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học 2.3.1 Hợp chất (ký hiệu: MC-405) 27 2.3.2 Hợp chất (ký hiệu: MC-406) 27 2.3.3 Hợp chất 3(ký hiệu: MC-411) 28 2.3.4.Hợp chất (ký hiệu: MC-412) 28 2.3.5.Hợp chất (ký hiệu: MC-423) 29 2.3.6 Hợp chất (ký hiệu: MC-427) 29 PHẦN III KẾT QUẢ 30 3.1.Kết nghiên cứu tác dụng androgen cao cồn 70o từ rễ Côngsêlên chuột cống đực non thiến 30 3.1.1 Kết ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên trọng lượng thể chuột cống đực non thiến 30 3.1.2 Kết ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên trọng lượng quan sinh dục chuột cống đực non thiến 31 3.1.3 Kết ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên nồng độ testosteron máu chuột cống đực non thiến 32 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ cao cồn 70o rễ Côngsêlên 33 3.2.1 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-405) 33 3.2.2 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-406) 34 3.2.3 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-411) 35 3.2.4 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-412) 35 3.2.5 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-423) 36 3.2.6 Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-427) 37 KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Khóa luận hoàn thành Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Em xin chân thànhbày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường, người thầy hướng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ em thời gian thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tớitập thể Phòng Hoạt chất sinh học (Viện Hoá học hợp chất thiên nhiên) giúp đỡ em nhiệt tình suốt thời gian em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ sinh học (Viện Đại học Mở Hà Nội) giúp đỡ trình học tập, thực tập hoàn thành khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày 23 tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thế Huỳnh Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT P : Prismatomeris Erectile Dysfunction (ED): Rối loạn cương dương TLC (Thin-Layer Chromatography): Sắc kí lớp mỏng CC (Column Chromatography): Sắc kí cột trọng lực dung môi FC (Flash Chromatography): Sắc kí cột nhanh Mini-C (Mini-Column Chromatography): Sắc kí cột tinh chế H-NMR (Proton Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT (Disstortionless Enhancement by Polarition Transfer): Phổ DEPT Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC CÁC HÌNH, CÁC BẢNG VÀ CÁC SƠ ĐỒ Hình 1.1: Các anthraquinones anthraquinone glycosides (1-47) phân lập từ chi Prismatomeris…………………………………………………… Hình 1.2: Các iridoid iridoid glycosides (48-54) phân lậptừ chi Prismatomeris……………………………………………………………… Hình 1.3: Các triterpenoids (55-61) saponin (62) phân lập từ chi Prismatomeris .10 Hình 1.4: Các phenolic glycosides (63-64) phytosterols (65-66)được phân lập từ chi Prismatomeris .11 Hình 1.5: Rễ câyPrismatomeri memecyloides (Côngsêlên) ………………13 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-405) 32 Hình 3.2: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-406) 33 Hình 3.3: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-411) 33 Hình 3.4: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-412) 34 Hình 3.5: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-423) 34 Hình 3.6: Cấu trúc hóa học hợp chất (MC-427) 36 Bảng 1.1: Các anthraquinones anthraquinone glycosides (1-47) phân lập từ loài chi Prismatomeris Bảng 1.2: Các iridoid iridoid glycosides (48-54) phân lập từ loài chi Prismatomeris 10 Bảng 1.3: Các triterpenoids (55-61) saponin (62) phân lập từ loài chi Prismatomeris 11 Bảng 1.4: Các phenolic glycosides (63-64) phytosterols (65-66) phân lập từ loài chi Prismatomeris 12 Bảng 3.1: Ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên trọng lượng thể chuột cống đực non thiến 30 Bảng 3.2: Ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên trọng lượng quan sinh dục chuột cống đực non thiến 31 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học Bảng 3.3: Ảnh hưởng mẫu nghiên cứu lên nồng độ testosteron máu chuột cống đực non thiến 32 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ chiết rễ Côngsêlên 25 Sơ đồ 2.2: Quy trình phân tách cao CHCl3 (A) từ rễ Côngsêlên 26 Sơ đồ 2.3: Quy trình phân tách cao H2O (C) từ rễ Côngsêlên 27 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR MC-405 Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR MC-405 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR MC-406 Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR MC-406 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR MC-411 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR DEPT MC-411 Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR MC-412 Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR DEPT MC-412 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR MC-423 Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR DEPT MC-423 Phụ lục 11: Phổ COSY MC-423 Phụ lục 12: Phổ HMBC MC-423 Phụ lục 13: Phổ HSQC MC-423 Phụ lục 14: Phổ ROESY MC-423 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR MC-427 Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR DEPT MC-427 Phụ lục 17: Phổ COSY MC-427 Phụ lục 18: Phổ HMBC MC-427 Phụ lục 19: Phổ HSQC MC-427 Phụ lục 20: Phổ ROESY MC-427 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Hiện nay, giới nói chung Việt Nam nói riêng, bệnh thiểu sinh dục nam, yếu sinh lý, hay dương suy (Erectile Dysfunction, ED) bệnh phổ biến nam giới với tỷ lệ mắc bệnh ngày cao Rối loạn cương dương (ED)tuy không nguy hiểm tác động nghiêm trọng tới chất lượng sống hạnh phúc gia đình Các phương pháp điều trị bệnh rối loạn cương dương nói riêng bệnh yếu sinh lý nam giới nói chung chưa đạt hiệu cao, số thuốc có nhiều tác dụng phụ đắt tiền Cây Prismatomeris memecyloides Craib người dân tộc Thái tỉnh Sơn La gọi Côngsêlên người dân sử dụng điều trị thiểu sinh dục nam nâng cao sức khoẻ sinh lý Theo Phạm Hoàng Hộ, Prismatomeris memecyloides Craib thuộc họ Cà phê (Rubiaceae)-Lang trang dạng sầm, tiểu mộc nhánh có vỏ nâu trắng, nhánh già nâu sậm Lá có phiến bầu dục to 9-12 x 3,5-4,5 cm, chót nhọn, đáy tà, không lông, gân phụ 10 cặp, đến sát bìa mặt ôliu hay đen, mặt nâu, cuống dài 6mm, bẹ mau rụng Chụm chót nhánh, cọng hoa chỉ, dài cm, đài hình ly cao 1,5mm, thấp, vành cao đến 2cm, ống mảnh, không lông, tai 5, mỏng Rối loạn chức năngcương dươnglà mộtrối loạndo trình lão hóa, tăng huyết áp,tăng cholesterol máu, đái tháo đường, bệnh tim mạch trầm cảm.Cương cứngdương vậtlà mộtquá trình phức tạpliên quan đếntâm lývànội tiết tốđầu vào, vàcơ chếnoncholinergic nonadrenergic Nitric oxide (NO) cho làảnh hưởng tới cương cứngcủa dương vật theo chếnoncholinergic nonadrenergic NOkích hoạtguanylylcyclasehòa tan, làm tăng ',5'-cyclic guanosinemonophosphate(cGMP)ở tế bàonội mô trongthể hangcủa dương vật.Suy giảmNOlà nguyên nhân gây bệnhrối loạn chức năngcương dương Ngoài ra, suy giảm nội tiết tố đầu vào nguyên nhân gây chứng ED Androgen hormon sinh dục giống đực, đóng vai trò quan Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học trọng chức sinh sản giống đực Nó cần thiết để hình thành trì đặc tính sinh dục nam thứ phát, ảnh hưởng đến khả sinh sản hoạt động tình dục Trên giới nay, phương pháp dùng nhiều để đánh giá hoạt tính androgen thuốc phương pháp Hershberger Phương pháp Hershberger phương pháp thường qui, có giá trị, dễ tiến hành thường chọn cho sàng lọc in vivo nhằm phát thuốc có tính chủ vận hay đối kháng với androgen Do vậy, “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính adrogen từ rễ Côngsêlên(Prismatomeris memecyloides Craib.)” mang ý nghĩa thiết thực Mục tiêu cần đạt 1) Tổng quan tài liệu nước nước có liên quan đến chi Prismatomeris nói chung Prismatomeris memecyloides nói riêng, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học lớp chất Giới thiệu Prismatomeris memecyloides 2) Xây dựng quy trình chiết xuất phân lập phần chiết cao cồn 70o từ rễ Côngsêlên (Prismatomeris memecyloides) 3) Nghiên cứu tác dụng androgen cao cồn 700 mô hình chuột cống đực non thiến 4) Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ cao cồn 700 rễ Côngsêlên Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ sinh học PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chi Prismatomeris 1.1.1 Sơ lược chi Prismatomeris Prismatomerislà chithực vật có hoathuộc họ Thiến thảo(Rubiaceae) Chi Prismatomeris phân bố chủ yếu Ấn Độ, phía nam Trung Quốc, nước Ðông Dương, bán đảo quần đảo Malaysia Tại Việt Nam, chi Prismatomeris Phạm Hoàng Hộ (2000) ghi nhận gồm loài: P tetrandra (Roxb.)K Schum, P tetrandra subsp malayana (Ridl.), P filamentosa (Craib.), P memecyloides (Craib.), P sessiliflora (Pit.) [1] Prismatomeris tetrandra (Roxb.) K Schum (Lăng trang) Đại mộc cao 2-8 m, không lông, nhánh nhiều Lá có phiến xoan ngược, dài 8-14 cm, dai, xám dợt hay nâu vàng lúc khô, cuống 5-7 mm, bẹ 2-3 mm Hoa có cọng dài, trắng, thơm, dài mm, vành có ống cao 10-15 mm, noãn sào buồng Phì cao 9-15 mm, đen đen,hạt 2, cao mm Cây hoa tháng 1-6, có tháng 8-11 Tên gọi khác: Mui Phân bố: Quảng Ninh, Đồng Nai (Biên Hòa), Tây Ninh, An Giang Prismatomeris tetrandra subsp malayana (Ridl.) J.J.Johanss (Lang trang Malay) Tiểu mộc, cành non vuông vuông Lá có phiến bầu dục thon, 10,5 x 3,8 cm, chót có múi, đáy nhọn, gân phụ cặp, cuống dài cm, bẹ nhọn, dài 1-2 mm Tán nhánh, cọng hoa mảnh chỉ, dài cm, đài hình chén, răng, vành hoa có ống cao 11-21 mm, tai trắng, dài 7-14 mm, noãn sào buồng, noãn Phì tròn tròn, to mm, hạt 1-2 Phân bố:Khánh Hòa (Nha Trang) Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thế Huỳnh 1202 Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR MC-412 Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR DEPT MC-412 Phụ lục 9: Phổ 1H-NMR MC-423 Phụ lục 10: Phổ 13C-NMR DEPT MC-423 Phụ lục 11: Phổ COSY MC-423 Phụ lục 12: Phổ HMBC MC-423 Phụ lục 13: Phổ HSQC MC-423 Phụ lục 14: Phổ ROESY MC-423 Phụ lục 15: Phổ 1H-NMR MC-427 Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR DEPT MC-427 Phụ lục 17: PhổCOSY MC-427 Phụ lục 18: Phổ HMBC MC-427 Phụ lục 19: Phổ HSQC MC-427 Phụ lục 20: Phổ ROESY MC-427