Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt silica gel có kích thướctương đối lớn (50-150 μm) được nạp trong một cột thủy tinh. Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột. Hệ thống như thế thường làm cho sựtách chậm, hiệu quảtách thấp so với HPLC. Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.
2.2.2.1 Chọn chất hấp thu để nhồi cột
Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu cần phân tính mà ta chon chất hấp thu phù hợp. Với những hợp chất rất phân cực nên sửdụng sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký lọc gel. Còn bình thường sửdụng sắc ký hấp thu.
2.2.2.2 Chọn hệ dung môi để giải ly cột
Trước khi tiến hành sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụngsắc ký lớp mỏng đểdò tìm hệdung môi giải ly cho phù hợp.
Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất phân cực khác nhau) thì chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết trên vịtrí ởbản mỏng là Rf= 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết trên vịtrí Rf= 0,2.
Sau khi chọn hệdung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột, tuy nhiên phải chỉnh tỷlệdung môi của sắc ký cột sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn vì chất hấp thu trên bản mỏng có độchặt chẽ lớn hơn chất hấp thu trong cột.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi giải ly nào, nhất thiết phải tăng chậm: thêm mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng. Ví dụ, đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzene, sẽpha benzene vào hexan theo tỉlệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100% benzene.
Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. Do alumin hay silica gel khi trộn với bất kỳ loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này sẽ làm cho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột. Cột gãy sẽlàm mất đi tính liên tục của chất hấp thu vì thếkhông thểtách tốt được.
2.2.2.3 Kích thước cột và lượng chất hấp thu
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì tỉlệchiều cao chất hấp thu: đường kính cột vào khoảng 10:1. Lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký.
2.2.2.4 Nạp chất hấp thu vào cột
Có hai chất nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô.
Nạp sệt: cho chất hấp thu ở dạng khô vào becher chứa một lượng dung môi gấp 5-10 lần lượng chất hấp thu, mỗi lần cho vào một ít, đồng thời khuấy đều. Tránh trường hợp cho vào một lúc lượng lớn chất hấp thu hay cho dung môi vào chất hấp thu, vì điều này làm cho chất hấp thu trương nở nhanh, không đồng đều, sinh nhiệt cục bộ, gây ra hiện tượng không đồng nhất trong cột, dẫn đến gãy cột, nứt cột. Chất hấp thu ởdạng sệt này được cho vào cột có sẵn dung môi. Dung môi chảy ra ở phía dưới cột sẽ được rót trả lại đầu cột. Tiếp tục rót chất sệt vào đến hết, vừa rót vừa dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột.
Nạp khô: cột được đổ đầy dung môi, mở khóa cho dung môi chảy ra chầm chậm bên dưới, đồng thời cho từng ít một chất hấp thu ở dạng bột vào đầu cột. Cùng lúc đó, dùng thanh cao su gõ nhẹ vào thân cột. Khi chất hấp thu đạt chiều cao hợp lý thì ngưng không cho thêm vào nữa. Sau đó, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần để ổn định cột.
2.2.2.5 Nạp mẫu vào đầu cột
Có hai cách nạp mẫu vào đầu cột: nạp mẫu ở dạng dung dịch và nạp mẫu ở dạng bột khô.
Nếu mẫu ởdạng lỏng, có thểcho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở dạng rắn, hòa tan một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởi đầu cho sắc ký cột. Cần lưu ý dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt.
Quá trình nạp mẫu tiến hành như sau: mởkhóa cho dung môi chảy ra khỏi cột. Khi mức dung môi vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột thì khóa cột lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột. Sau đó, mởkhóa cho dung môi chảy ra khỏi cột làm cho mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột. Cần chú ý không cho bề mặt chất hấp thu bị khôtrên đầu cột. Tiếp tục dùng pipette cho nhè nhẹmột lượng dung môi mới lên đầu cột. Sau đó thêm lên mặt thoáng của cột một lớp cát, hay bông gòn, bông thủy tinh,...để bảo vệmặt cột. Cuối cùng, cho dung môi vào cột để bắt đầu quá trình giải ly.
Nạp mẫu chất ởdạng bột khô.
Nếu chất mẫu không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (X gam) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50X gam), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10X gam). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột đểbắt đầu quá trình giải ly.
2.2.2.6 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thểtheo dõi bằng mắt thường, nhờnhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau,
đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng, khi được giải ly ra khỏi cột. Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau. Nên pha một lượng lớn dung môi giải ly đểhạn chếsai lệch nồng độtrong mỗi lọ.
Dung dịch trong những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có kết quảsắc ký lớp mỏng giống nhau (giống nhau nhưng có thể chứa nhiều hợp chất, vì hỗn hợp) sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu – thiết bị hóa chất
3.1.1 Dụng cụ
Tủsấy
Máy cô quay EYELA Bếp điện
Tủhút Phễu chiết Bình lóng Cột sắc ký
Cốc thủy tinh, bình cầu, bình tam giác, ống đong, ống hút, lọthủy tinh…. Ống mao quản
Bản mỏng
3.1.2 Hóa chất
Bảng 1 Các hóa chất sửdụng thực hiện đềtài
Tên hóa chất Nước sản xuất
Silica gel KG 60 F254 Merck
Bảng SKLM Merck
NaCl Trung Quốc
Na2SO4 Trung Quốc
Petroleum ether Việt Nam Ethyl acetate (EA, EtOAc) Việt Nam
n-Butanol Việt Nam
Dichloromethane Việt Nam
Methanol Việt Nam
Acetone Việt Nam
3.2 Các bước tiến hành
Bước 1: Mẫu nguyên liệu ban đầu được chiết với EtOH theo phương pháp ngâm dầm, ta được cao thô. Cao thô này được chiết lần lượt từ các dung môi kém phân cực đến các dung môi có độ phân cực mạnh hơn. Từ đó, ta thu được các cao có độphân cực tăng dần tương ứng.
Bước 2: Từ các cao có được ta phân lập các chất của từng cao riêng biệt bằng phương pháp sắc ký cột.
Bước 3: Gửi mẫu chất tinh khiết đã phân lập được đến Viện Hóa học-Viện Khoa học Công Nghệ-Việt Nam (Số18, Hoàng Quốc Việt, quận Cầu giấy, Hà Nội ) đo phổ.
Bước 4: Giải các dữliệu phổ có được ta nhận biết công thức cấu tạo của chất đã được phân lập, sau đó tiếp tục tìm hiểu đặc tính của chất này.
3.3 Quá trình thu hái và xử lý nguyên liệu
3.3.1 Thu hái nguyên liệu
Địa điểm thu hái tại Xã Lục Sĩ Thành - Huyện Trà Ôn - Tỉnh Vĩnh Long nằm bên bờsông Hậu,phía Đông tiếp giáp với chợnổi Trà Ôn.
3.3.2 Xử lý nguyên liệu
Mẫu sau khi được thu hái đem về rửa sạch bằng nước, để ráo. Sau đó, bóc vỏ cắt nhỏ thành từng miếng, phơi khô khoảng 7-10 ngày, đến khi cân với khối lượng không đổi. Lượng mẫu cây này được nghiền thành những hạt rất nhỏ. Cuối cùng, cho vào các túi vải đã được chuẩn bị trước và tiến hành chiết ngâm dầm bằng EtOH 95° trong bình thủy tinh 10 lít.
Hình 5: Chiết ngâm dầm rễcây Bần
Hàm lượng ẩm trong mẫu bằng: 100 × (mt – mk)/mt
mk: khối lượng vỏkhô
Với khối lượng mẫu thu được: mt = 7,35 kg
mk= 1,50 kg
Vậy lượng ẩm trong vỏcủa rễcây Bần là: 79,59%.
3.4 Quá trình điều chế thu cao
3.4.1 Quá trình điều chế thu cao ethanol
Mẫu nguyên liệu sau khi xay nhỏ được 1,5 kg, cho vào túi vải đã được chuẩn bị trước rồi ngâm dầm bằng ethanol 95 đựng lọ thủy tinh trong suốt có dung tích 10 lít, thêm lọthủy tinh khoảng 8 lít ethanol 95. Cho lượng dung môi mới ngập hết các túi vải.
Sau khi ngâm khoảng hơn 24 giờ ta có thể chiết lấy dịch chiết (dung dịch các chất tan được trong ethanol),sau đó dùng máy lọc áp suất thấp hoặc phễu lọc dịch chiết trên qua giấy lọc nhằm loại bỏ phần bột của vỏ cây không tan trong ethanol. Đến lúc này ta thu được dung dịch chiết dạng màu xanh tương đối loãng sạch cặn khoảng 1000-1500 mL.
Tiến hành cô quay trên máy cô quay chân không với nhiệt độ thích hợp khoảng 50-60C bằng cách cho dịch chiết trên vào bình cầu 1000 mL với thể tích dung dịch chiết trên khoảng 300-500 mL cho một mẻ cô quay. Tiến hành cô quay thu được hai phần:
Phần thứ nhất là dung môi ethanol, ta thu hồi và cho trở lại vào lọ ngâm cao.
Phần thứhai là dịch chiết những phần tantrong ethanol đã loại một lượng lớn dung môi lúc này nó ởdạng màu xanh đặc sệt.Đâylà cao ethanol.
Tiếp tục như thế, ta thực hiện tương tựviệc thu được cao ethanol cho lần chiết thứhai, ba, bốn… đến khi dung dịch chiết có màu xanh thật nhạt, thửTLC thấy các vết rất mờ nhạt, hầu như không nhân thấy. Chứng tỏ không còn sót chất tan được trong ethanol.
Sau đó, gom tất cả các cao đã thu ta sẽ được cao ethanol dạng sệt. Để ngoài không khí khoảng một thời gian ngắn, lượng dung môi sẽ bay bớt, khi đó ta bịt kín và bảo quản lạnh (trong tủlạnh) nhằm tiếp tục sửdụng cho các mục đích tiếp theo.
Hình 6: Cao ethanol từrễBần
3.4.2 Quá trình điều chế các cao petroleum ether (PE), cao dichloromethane (Di), cao Ethyl acetate (EA, EtOAc) và cao n- dichloromethane (Di), cao Ethyl acetate (EA, EtOAc) và cao n- Butanol
Cao ethanol đã thu đượcởtrên sửdụng cho quá trình thu cao PE bằng cách: Dùng bình lóng đặt trên một giá đỡ, cho vào bình khoảng 10 g cao ethanol và một lượng khoảng 20-30 mLnước cất. Sau đó, cho thêm 200-300 mL dung môi PE vào bình và lắc đều. Sau khi lắc khoảng 30 phút, để yên bình lóng trên giá đỡ, khi
đó ta quan sát sựtách lớp rõ ràng tạo thành hai pha, pha hữu cơ có tỷtrọng thấp hơn chứa nhiều cấu tửtan trong PE nằm phía trên, phần phía dưới là pha nước.
Mởvan khóa của bình lóng, thu lớp chiết dưới cho vào một bercher và thu lớp chiết trên vào một bercher khác.
Tiếp theo, ta tiến hành lóng dịch chiết pha hữu cơ với dung dịch nước muối bão hòa NaCl đểloại các thành phần tạp lẫn vào trong quá trình lấy dịch chiết. Thao tác như sau: cho dịch chiết thu được vào bình lóng 1000 mL đến thể tích 400 mL đồng thời thêm khoảng 200 mL dung dịch nước muối trên và lắc đều. Sau đó, thấy trong bình lóng chia thành hai pha, ta sẽ loại bỏ pha có màu trắng đục (pha nước muối). Pha còn lại ta cho vào một bercher sạch chứa sẵng muối Na2SO4 để loại nước hoàn toàn ra khỏi dịch chiết. Cuối cùng đem cô quay thu hồi dung môi ta có được cao PE.
Phần không tan trong PE tiếp tục cho vào bình lóng, cho vào một lượng Di và thực hiện theo qui trình như trên, ta sẽ thu được cao Di.
Hình 8: Sơ đồ điều chếcao tổng quát
Pha nước
- Chiết với EtOAc
- Cô quay, thu hồi dung môi Bột rễkhô
- Ngâm với Ethanol 960 - Cô quay, thu hồi dung môi Cao PE Mẫu rễ tươi - Rửa sạch - Phơi gió - Xay nhỏ - Chiết với PE
- Cô quay, thu hồi dung môi
Cao PE
- Chiết với Di
- Cô quay, thu hồi dung môi
Cao Di
Cao EtOAc
Pha nước
Pha nước
3.4.3 Cách phân lập các chất ít phân cực trong rễ Bần
Khảo sát các hợp chất trên cao PE, được tiến hành như sau:
Tiến hành sắc ký cột thường: chọn cột sắc ký sau đó cân lượng silica gel và lượng cao nạp cột cho phù hợp.
Sử dụng phương pháp nạp cột ướt lấy dung môi PE nạp cột và là dung môi giải ly đầu tiên. Tiếp đến, ta tăng độ phân cực của dung môi giải ly bằng cách chọn hệ dung môi được pha lẫn với nhau hai hệ, gồm PE và EtOAc theo tỷlệthích hợp. Giải ly cột ta thu được các phân đoạn.
Sau đó, thử với TLC xem hợp chất trong các đoạn đó đã tinh khiết chưa, nếu tinh khiết gửi mẫu chất đó đo phổ, nếu chưa sạch mà mẫu còn khối lượng nhiều khoảng trên 20 mg ta tiến hành nạp cột cho từng đoạn như thế đến khi thu được chất sạch.
3.5 Quá trình phân lập và tinh chế các chất trên cao PE
3.5.1 Khảo sát cao PE bằng sắc ký bản mỏng
Lấy một lượng nhỏ cao PE hòa tan trong PE ta được dịch cao PE. Tiến hành chấm sắc ký bản mỏng đểchọn dung môi phù hợp cho sắc ký cột. Kết quảbản sắc ký bản mỏng như sau:
Giải ly bản mỏng với các hệ dung môi PE:EA có tỉ lệ khác nhau, nhúng bản mỏng vào thuốc thửhiện hình H2SO410% trong methanol.
HệPE:EA = 8:2 HệPE:EA = 7:3
Hình 9: TLC cao PE
3.5.2 Khảo sát cao PE bằng sắc ký cột
Căn cứvào quá trình kiểm tra sơ bộ cao PE bằng sắc ký bản mỏng , tôi đã tiến hành sắc ký cột cao PE nhằm phân lập những hợp chất riêng biệt.
Các thông sốcủa cột sắc ký: Đường kính cột sắc ký: 1 cm