nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây bần chua (sonneratia caseolaris (l.) engl.)

Trang 1

BO GIAO DUC VA DAO TAO TRUONG DAI HOC CAN THO

DO THI KIM CHI

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC

TRONG CAO ETHYL ACETATE TU VO CUA RE CAY BAN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) LUAN VAN DAI HOC

Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC Mã số: CN 262

Trang 2

TRUONG DAI HOC CAN THO

DO THI KIM CHI

NGHIEN CUU THANH PHAN HOA HOC

TRONG CAO ETHYL ACETATE TU VO CUA RE CAY BAN CHUA

(Sonneratia caseolaris (L.) Engl.) LUAN VAN DAI HOC

Chuyén Nganh: CONG NGHE HOA HOC Mã số: TN 262

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÊ THANH PHƯỚC

Trang 3

Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước

Đề đạt được kết quả như ngày hôm nay, Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn chân

thành sâu sắc nhất đến TS Lê Thanh thây đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình làm luận văn, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu để tôi có thể

hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình đồng thời trang bị những kiến thức cho

công việc của tôi trong tương lai

Tôi xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Hóa Học, khoa

Công Nghệ và quý thầy cô trong bộ môn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nhiên đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn

Xin gửi lời cảm ơn thân thương đến gia đình và những người thân luôn là chỗ

dựa vững chắc cả về vật chất lẫn tinh thần

Xin cảm ơn các anh, chị học viên cao học và những người bạn đã giúp đỡ, đông hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Trang 4

TÓM TẮT LUẬN VĂN

000

Cây Bản là một loại cây rất quen thuộc có mặt khắp nơi ven sông, ven biển, các

bãi bôi, Các bộ phận của cây Bần được sử dụng làm vị thuốc chữa được nhiều bệnh

dân gian như: hoa Ban chữa tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tay, giai nhiét cam SỐt, .Quả có thể dùng dé nấu canh chua, có thể chữa bệnh bong gân, cầm máu Trong đề tài luận văn này, tôi đã sử dụng vỏ của rễ cây Bần chua làm nguyên liệu, tiến hành xác định độ 4m của vỏ rễ cây Ban chua, ngâm vỏ với ethanol 96° sau đó điều chế các cao từ không phân cực petroleum ether đến cao ethyl acetate từ cao ethanol tổng.Giới hạn của đề tài này, được nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của

rễ cây Bần chua

Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 Fysq (silica gel) két hop voi sac ky lép mỏng, tôi phân lập ra được chất sạch từ cao ethyl acetate Sử dụng các dữ liệu phổ NMR đã xác định được chất đó là: oleanolic acid

Trang 5

Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT LUẬN VĂN MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN sec

1.1 GIOI THIEU VE CAY BAN CHUA®! — ỹ HH 1

1.1.1 Phan loai kha NOC .cccccsssssssssssscssssssssccccscssssssssssscssssesees 1 1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua -s- seo s sescsesessssesese 2

a Dac điểm thực vật về cây Bần chua 5-e-«-<eesssssssesseesssssesess 2

b Phân bố sinh thái s5 5s s5s% SE 5s S2 SESSS9S9E2ESS5E5555585 3859555652 3 1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bần chua ¬— 4

a Y học đâH ĐỈHH c co 0o <3 1 9É HS S90 0086.1610 08.96 60015 08 0888808989099996 4

b_ Y học hiỆH ỞQi o- - cọ HH TH HH nhe 5

12 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHÁT TỰ

1.2.1 Nguyên liệu S998909996966668 856 ——.- ° ssse 1.2.2 Dung môi sscccccccccccsssscsceees ssnssssssssssscccceees ss ceccccceeeeeeees sessseeeee D

a Dung môi phân cực và không phân Cực .- << «se c5 S566565655% 5 b Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khỏi cây . s<- 6 c Lựa chọn dung môi tách chiẾt - << << csesesesessessesssesssesse 7 d Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để tách chiết hợp chất 7

e Sự hòa tan hợp chất vào dung mơii 5-s- << essssssessssesssssesese §

1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách ra khỏi cây 0096006809966 60906 606 0

a Kỹ thuật chiết rắn-lưng -.«- «5s <2 ssesessssssssEsksEsesesssssesssssssse 9

Trang 6

b_ Kỹ thuật chiết lỗng- lồ ng, 5 2° 5s ssSs+se2949 603909020906 10

1.3 GIỚI THIỆU VẺ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ#“, 11

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng -os-scso<s s=ses I1

a Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mồng -.- 11

b Ưu điểm sac ký bản mồng s-<- << << s=scsesssssessesesesesessseses 12

c Chất hấp thu sỉliCa #el - co s2 ssEseseEeEeEsEssssseseeesesee 12 d Dung môi gÏả Ìy 0o c5 555 9 9 9.96 969 06 06.0598 9688908980899909086.496066666 13 e Các công dụng của sắc ký lớp mồng . s-scsssssesssssesssseesse 14

1.3.2 Phương pháp sắc ký cột

a Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột . -<c<cesesecsescsessses 14

b Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly s-s-< << se ec<esse 14

c Kích thước cột và lượng chất hấp phụ s-s-s° s se sessss=sesese ses 15

d Nap chat hap thu dạng sệt vào cột -ss-< <cececscseeesesssesesee 16

e Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký -ss-sec«c«cec«eese 17

f Theo dõi quá trình giải ly CỘI ooo co co 0S 0 9 9996 06 0068 9489999966666686996 06 18

ø Khi nào thay đôi hệ dung môi giải ly cột 5s sss<s<sse 19

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .c 20

2.1 CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHƯÌ,, s-sss sssssssssesesesee 2Ù

2.1.1 Đặc điểm và thời gian nghiên cứu sasesscsscssessseceesees 20

2.1.2 Các phương tiện nghiền CỨu - << 55555 se s95 20 A Dụng CỤ ocooo so œ6 6 6 6S 6 9 9 99.999 099099999999099969 0989899 9080000980800 900000080800 000 20 b_ Hóa ChẤT 5< << Set S2 9 0 39308 0001382402402402000404009011 9 20 2.1.3 Các phương pháp nghiền CỨU os 555 ee<s s« «.ssssssss 2] To 8U UP NN 21 b Tiến hành sắc ký Cộ( - œ5 so 2S eEsESSESSeESEesesseseesseses 21 2.1.4 Các bước tiến hành «- << sssssessesessssssesesessese 21 a Nguyên lIỆu oooo o0 G G66 S5 9 69998 9999 9998 9.96 006 04 066 06 0809899969990000000906066066 21 b Quá trình điều chế €aO - << s5 << se e se Sesesessss se s9 21

c Cách phân lập các chất trong rễ Bằần s-s- so s sceseessesecsse 25

Trang 7

2.2 QUA TRINH PHAN LAP VA TINH CHE CAC CHAT

TREN CAO THO? | ccccccsccecceccsccscscscecceccecceccecceccecsecsecsecsece 25

2.2.1 Quá trình phân lập và tỉnh chế các chất từ cao thô 25 2.2.2 Khảo sát cao EA bang sắc ký cột s-s-s-s-s-scscscscse 26

F1 g8 0a 11 26 b Theo dõi quá trình giải ly cột c 0s c Ă cĂS0015166611186688686866646 27

2.2.3 Khao sat phan đoạn 2 của cao EÁ ososeeeseesssssssssse 29

m1 0 29 b Theo dõi quá trình giải ly cột c 0s c Ă cĂS0015166611186688686866646 30

2.2.4 Xác định các tính chất vật lý đặc trưng và theo cấu trúc của

hợp chất vừa phân lập được c- sec s<cs sssssssesesesesssssssssee 31 a Các đặc tính của chất PHUOC-CHI-(1 <5 5s scssses 31 b Xác định cấu trúc của chất PHUOC-CHI-01 5 «5c s< 32 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 34 3.1 KT LUẬNN - << << 5% s2 <EsEsSs S9 95s e9 EsSseSsssE 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 5 5c se sesesseseseeseses« 35

Trang 8

DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây Bần ven sông . + ¿+ 2+5 SE SE ES SE 9 3 1 3 1733211317171 xe 2 Hình 2: Hoa Bắn ¿5< 2 SE S311 51111 1111111111111 1111111 ck re 2 Hình 3: Thân cây và quả Bắhn + - + xxx TT ng ceg 2 Hình 4: Cành và quả Bẳn -. - ¿+ +6 2 2E SE+EEE 23831 21712 1511 1121k 3 ši0 06 15.:8: 0 3 Hình 6: Quả Bần đùng làm món ăn + - ©5252 +E+E+E2EE£+E#EzveExrxrxe re 4 Hình 7: Cao EA - - HH HH cọ HH KT TH vá 23 si00¡0 06 0 0 26

Hình 9: Sắc ký cột thường cao EA - + 52+ 3E E1 521111371521 521 21x ree, 27

Hình 10: Cột sắc ký phân đoạn 2 . 5 - + SE +*SEEx SE cv vn ch vưryt 29 Hình 11: TLC cột sắc ký phân đoạn 2 +2 52 2 z+E£E£x+E+EvErrerzrkee 29

Hình 12: TC của PHUOC-CHI-O1 - - 1v 39 re 31

Hình 13: Lọ gửi mẫu đi đo phÔ 5+ +56 SzSEEEE SE SE E2 E2 rkrerervee 31

Hình 14: Cấu trúc của PHUOC-CHI-01 (oleanolic acid) - -‹ 33

Trang 9

DANH MUC BANG

Bang 1: Quá trình sắc ký cột trên cao EA đường kính 7 mm - 28

Bang 2: Kết quả sắc ký cột phân đoạn 2 của cao EA -¿-5c<cecscsesree 30 Bảng 3: Số liệu thực nghiệm của PHUOC-CHI -01 với số liệu mô phỏng của oleanolic

Trang 10

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT NMR 1H-NMR TLC PE EA ppm HPLC Di MeOH EtOH

Nuclear Magnetic Resonance

Trang 11

LỜI MỞ ĐẦU

000

Từ ngàn xưa, nhân dân ta đã biết sử dụng các loại cây, cỏ có dược tính để chữa bệnh, chúng có tác dụng chữa bệnh tốt, dé tim, ré tiền, sử dụng tương đối đễ dàng Tuy nhiên việc sử dụng chỉ dựa vào kinh nghiệm nhân gian, phần lớn chưa được giải thích băng cơ sở khoa học hiện đại

Ngày nay, khoa học kỹ thuật được phát triển con người đã đi sâu nghiên cứu để có thê giải thích chính xác cho chúng ta biết được trong các loại cây, cỏ có chứa thành phân gì mà chúng có khả năng chữa bệnh

Không dừng ở đó, việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang trở thành một lĩnh vực quan trọng của ngành Hóa Học Hữu Cơ ở nước ta Phần lớn các hợp chất được phân lập từ thực vật hay động vật đều có hoạt tính sinh học, có khả năng chữa một số bệnh cho con người hoặc có tác dụng lên một số vi sinh vật có hại được dung trong nông nghiỆp,

Xu hướng hiện nay của ngành được phẩm là hướng đến các sản phẩm có nguồn

gốc từ thiên nhiên, vì chúng đem lại sức khỏe tốt cho con người và không gây phản

ứng phụ như các sản phẩm tổng hợp Từ nhu câu thực tế đó nên tôi đã chọn đề tài là “Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethyl acetate từ vỏ của rễ cây Bần chua”

Trang 12

CHƯƠNG 1: TONG QUAN

1.1 GIOI THIEU VE CAY BAN CHUA”!

Cây Ban phân bố ở rừng ngập mặn Campuchia, Thái Lan, Inđônêxia, Philippin, Bắc châu đại dương, Ở Việt Nam cây mọc ở nước lợ gần các cửa sông ngập một mua trong năm Cây thường mọc chung với các loài cây khác như Trang, Sú, Giá, Cóc, Cũng có khi mọc thành rừng gần như thuần loại như ở Hải Phòng, Nghệ An, Hà Tĩnh Sự phong phú của quân thụ này tùy theo mức nước lợ và chế độ thủy triều

Ở Việt Nam hiện nay họ Bần có khoảng 6 loài, trong đó hết 5 loài là gặp ở vùng rừng ngập mặn hoặc bờ sông có thủy triều, cây có rễ kí sinh thường dùng làm nút chai

1.1.1 Phân loại khoa học

Tên Khoa Hoc: Sonneratia caseolaris (L.) Engl

Tén déng nghia : Sonneratia acida L, Rhizophora caseolaris

Trang 13

1.1.2 Đặc điểm về cây Bần chua

a Đặc điểm thực vật của cây Bần chua

Cây Ban thường gặp nhất ven sông, trái chín ăn được, rất chua Loài Dom dom thường hay đậu trên lá Bần ban đêm, chớp tắt trông rat đẹp như cây Thông Noel

ere

eee

Cây gỗ, thân cao 4-5 m hoặc hon, luôn xanh Ré thé tap trung thanh khém ở

quanh gốc thân, mọc ngập sâu vào bùn Cành non có 4 cạnh nhẫn Lá mọc đối, lá non hình mũi mắc dài, lá già hình trái xoan, dài 5-10 cm, rộng 3,5-4,5 cm, gốc thuôn, đầu tù, phiến lá đài và dai, hơi mọng nước, rất giòn, gân lá rõ, thường rụng vào mùa đông: cuông lá và phân gân chính ở gôc có màu đỏ

Hinh 2: Hoa va qua Ban Hinh 3: Than va qua Ban

Trang 14

Hoa màu trang, moc đơn độc ở ngọn thân hoặc kẽ lá; cuốn hoa ngắn và mập; đài có có 6 răng hình tam giác, dày găn liền ở gốc tạo thành một ống đài 1,5 cm, mặt ngoài màu lục mặt trong màu tím hồng, tràng 6 cánh hình dải, đầu thuôn nhọn; nhị nhiều, chỉ

nhị dài, mảnh; bầu hình cầu det

Qua mong, hinh cau det, đường kính 3 cm, có mũi thuôn nhọn ở đầu; hạt nhiều đẹt, toàn cây nhẫn Hoa nở vào khoảng tháng 3-5 và mùa quả khoảng tháng 8-10 Bộ phận dùng là: quả, vỏ, thân và cành Hình 4: Cành và rễ Bần Hình 5ã: Các rễ Bần b Phân bố sinh thái

Chi sonneratia gồm một số đại diện là cây gỗ hay cây bụi, mọc ở các vùng dat ngập mặn ven biển, ở Đông Phi, nhiệt đới châu Á và các đảo ở Thái Bình Dương Ở Việt Nam, chỉ này có 4-5 loài, trong đó Bần là cây gặp khá phố biến ở các vùng ven biển từ Thủy Nguyên (Hải Phòng) cho đến Rạch Giá (Hà Tiên) Loài này cũng được phân bồ rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Philipin, phần biên Đông

Bắc Australia và đảo solomon

Bắn là loại cây gỗ phân cành nhiều, ưa sáng chịu được mặn nên thường thấy trên các vùng đất bùn nhão ở các cửa sông Để thích nghi với điều kiện đất bùn nhão và

thường xuyên bị ngập nước, cây có hệ thống rễ thở mọc trồi lên khỏi mặt đất Bần ra

hoa hàng năm, thụ phấn nhờ gió, côn trùng va doi Hoa Ban là nguồn thức ăn quan trọng của ong mật Cây còn được trồng thêm nhằm chắn sóng và bảo vệ vùng đất ngập

nước ở ven biên

Trang 15

1.1.3 Tác dụng dược lý của cây Bần chua

a Y học dân gian

Lá Bân: ở các nước Đông dương (cũ), lã Bân giã nát voi it mudi, dap tai cho chữa vêt thương bâm tím do đập đụng

Quả Bân: ở Án Độ quả Bân được dùng làm thuôc đặp ngoài chữa bong gần sưng

tây, dịch ép lên men từ quả có tac dung cam máu

Malaysia, quả già là thuôc diệt giun, còn nước ép từ quả xanh có vị chua, dùng làm tăng mùi vị cho bột car1, còn lúc chín có mùi vị giông bơ, có thê ăn tươi hoặc nầu chín Hình 6: Quá Bần dùng làm món ăn Hoa Bắn: ở Ấn Độ, dịch ép từ hoa là một thành phân trong bài thuốc chữa đái ra máu

Giải nhiệt chữa cảm sôt: quả Bân rửa sạch, nhai với muôi, rồi nuôt nước

Câm máu nhật là chảy máu cam: quả Bân rửa sạch, giã nát, đắp vào vêt thương, máu sẽ cầm ngay Tác đụng này chính là do chất pectin chứa trong dịch quả

Tiêu viêm chữa tụ máu, sưng tây: quả Bân giã nhỏ, ép lầy dịch, cô thành cao mêm Lúc cao còn nóng phết lên giây, khi dùng, hơ thuôc cho mêm rôi đắp lên chỗ đau ngày làm một lần

Sử dụng làm thuốc đắp vào chỗ viêm tấy vì bong gân Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch quả lên men làm thuốc ngăn chặn của chứng xuất huyết Ta dùng lá giã ra, thêm một ít muối, làm thuốc đắp tốt các vết thương đụng giập và vết thương nhẹ Ở Malayxia, người ta giã lá lần với cơm làm thuôc đặp chữa bí tiêu tiện

Trang 16

Gỗ Bản dùng đóng đồ nhỏ, vỏ chứa nhiều tanin có thể dùng thuộc đa

Ré Ban làm nút đóng chai

b Y học và hóa sinh hiện đại

Hiện nay cây Ban chi moi duoc str dung lam thuốc theo dân gian, chưa có nghiên cứu khoa học cu thé nao phục vụ trong y học hiện đại

12 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT HỢP CHÁT TỰ

NHIEN"*°

1.2.1 Nguyén liéu

Để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học một loại cây cỏ, trong điều kiện cho phép thì nên dùng dược liệu tươi Nguyên liệu sau khi thu hái được làm khô tự nhiên trong mát có quạt hoặc nơi thoáng gió, tránh sử dụng nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu

Nếu nguyên liệu phải thu hái ở nơi xa, có thể bọc vào túi nhựa sẽ giữ được tươi

trong vài ngày Khi thu hái nguyên liệu phải chú ý loại bỏ sâu bệnh Đối với các bội

phận vỏ thân, rễ chú ý xem xét kỹ, tránh thu hái dược liệu có mang các sinh vật ký

sinh

1.2.2 Dung môi

Dung môi dùng để chiết xuất các hợp chất ra khỏi dược liệu Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết xuất là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi

a Dung môi phân cực và không phân cực

Quá trình hình thành một dung dịch là tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi Để hình thành một dung dịch trước hết là phải có sự phá vỡ các dây nói liên

kết trong hợp chất tan và trong đung môi, để hình thành dây nối liên kết mới giữa chất

tan và dung môi

Để hiểu về tính phân cực của dung môi, ta có thể so sánh giữa hai dung môi petroleum ether và nước có 3 điêm khác nhau cơ bản:

Trang 17

e Hằng số điện môi của nước ở 20°C là 80,4 trong khi của petroleum ether là

4,34

e Nguyên tử H trong phân tử nước có khả năng liên kết với nguyên tử mang điện âm của một hợp chất khác, hình thành dây nối liên kết hydro trong dung dịch nước, trong khi petroleum ether không có sự liên kết này Dây nối hydro hình thành ảnh hưởng lớn đến tính hòa tan của hợp chất đối với dung môi

e Nước có tác dụng như một acid vừa là một base, con petroleum ether chỉ là một base rât yêu

Do những đặc tính trên, nước được xem là một dung môi phân cực mạnh còn petroleum ether là một dung môi không không phân cực

b Dung môi để chiết tách các hợp chất ra khói mẫu cây

Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu có phân tử lớn

(polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nâm mốc, thành tế bào vi sinh vật) tương đối trơ, không hòa tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảo sát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất có trong lượng phân tử nhỏ

Thông thường người ta nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có tính ái dầu có mức độ ái cực khác nhau Tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có

tính ái nước Vì vậy, việc tách hợp chất thiên nhiên được thực hiện lần lượt với từng

loại dung môi có tính phân cực tăng dần hoặc chiết một lần lẫy tất cả các loại hợp chất ra bằng sử dụng dung môi vạn năng methanol, ethanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên)

Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách lấy Như ta đã biết, hợp chất tự nhiên có câu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy trình chiết tách đặc trưng, vì vậy, trước khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đây đủ các tài liệu tảm khảo có liên quan trực tiếp trên cây mới có thể chọn được quy

trình phù hợp

Trang 18

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần trộn dung môi phù hợp, sử đụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dam, bằng máy chiết Soxhlet, sau khi chiết phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qua lọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ khoảng 30-40°C

c Lựa chọn dung môi tách chiết

Chọn dung môi phải có đặc tính trung bình, không độc, không quá dễ cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó có thê được loại

bỏ đễ dàng Hạn chế sử dụng các dung môi độc như benzene hoặc dễ cháy do có nhiệt

độ sôi thấp nhu diethyl ether, carbon tetrachlorua,

Dung môi đùng đề chiết cần thỏa mãn các điều kiện sau:

= C6 nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì tốn thất dung môi sẽ lớn, để cháy nỗ

" Không tác dụng hóa học với các chất trong nguyên liệu và không bị thay đổi

tính chất khi sử đụng lại

= Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán

“= Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất

" Không tạo thành hỗn hợp đối với không khí, không được có những tạp chất

không bay hơi và khi bay hơn không được để lại các tạp chất có mùi lạ

=_ Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị Không gây mùi lạ đối với sản phẩm và

không độc hại đối với người sử dụng

= Dé tim va ré tién

d Một số điều cần biết khi sử dụng dung môi để chiết tách hợp chất

Các dung môi được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủy tỉnh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp chất bản mà thường gặp nhất là chất dẻo hóa Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứa trong các thùng bằng nhựa dẻo

Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-ethylhexyl) và chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứa trong cây cỏ đang

khảo sát

Trang 19

Chloroform, dichloromethane có thể tạo thành phản ứng với các loại alkaloid Để

tạo thành các alkaloid và một vài hợp chất giả tạo khác Tương tự, các vết HCI có thê

gây ra sự phân hủy, sự khử nước, sự đồng phân hóa cho vài hợp chất hữu cơ

Diethyl ether it được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp dễ cháy, độc có thé gây mê cho người sử đụng và khuynh hướng tạo thành peroxid dễ gây nỗ Peroxid này rất hoạt tính, có thể oxid hóa các hợp chất mang nhiều nối đôi liên hợp như carotenoid

Acetone có thê tạo ra dân xuât acetonid nêu hop chât chiệt có chứ nhóm cis-1,2-diol hién diện trong môi trường acid

Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thủy giải các hợp chất glycosid (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mắt đi phần đường) hoặc cắt đứt este (môi trường kiêm) hoặc tạo sự chuyên vỊ

Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cô chân không ở nhiệt độ 30-40°C, chưng cất ở nhiệt độ cao có thê làm hư một số chất kém bèn nhiệt

e Sự hòa tan hợp chất vào dung môi

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chât ta có thê dự đoán sự có mặt của các chât trong mỗi phân đoạn chiết

Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể có các hydrocacbon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch cacbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo, ), Các thành phần trong tính dầu (monoterpen, sesquiterpen, một vài diterpen bay hơi được), các sterol thuc vat (phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,

Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: cé thé có các sesquiferpen, diterpen, coumarin, quinon, cdc aglycon do hop chat glycosid bị thủy giải, các monoglycosid (chi mang một phân tử đường), một số alkaloid loại base yếu

Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật như clorophyl, các glycoside (saponin), các alkaloid ở dạng muối tứ cấp, kết hợp với các acid hữu cơ, các muối amine, các tannin, các hydrat cacbon có trọng lượng phân tử nhỏ như monosacarid, các protein thực vật, các muối vô cơ, một số polysacarid như: pectin, chất nhày, chất gôm,

Trang 20

1.2.3 Các kỹ thuật chiết tách hợp chất ra khỏi cây

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ Các kỹ thuật đều xoay quanh hai phương pháp chính lỏng-lỏng và rắn-lỏng

a Kỹ thuật chiết ran-léng

* Kỹ thuật chiết ngắm kiệt

Dụng cụ : gồm một bình ngẫm kiệt bình thủy tính, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để của dung chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết Phía trên cao của bình ngắm kiệt là bình lóng để dung môi tinh khiết

Phương pháp thực hiện: bột cây được xay khô, lọc được qua lỗ rây 3 mm Đáy của bình ngẫm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc Bột cây được đặt

vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình Đậy bê mặt lớp bông bằng một

tờ giấy lọc và chặn trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm sáo

trộn bề mặt lớp bột Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ

xấp xấp phía trên lớp mặt, có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội

Để yên một thời gian, thường là 12-24 giờ Mở van bình ngẫm kiệt cho đung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và đồng thời mới khóa bình lóng để dung môi tỉnh khiết

chảy xuống bình ngắm kiệt Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào

bình ngắm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gi trên mặt

kiếng hay không, nếu không còn vết gì là chiết kiệt

* Kỹ thuật chiết ngâm dam

Kỹ thuật chiết ngâm đầm cũng tương tự kỹ thuật chiết ngâm kiệt nhưng không

đòi thiết bị phức tạp, vì thế có thê dễ đàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây

Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gi, hình trụ đứng, có nắp đậy

Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tỉnh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm

Trang 21

hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa

tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao Tiếp theo, rót đung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây

Có thể gia tăng thêm hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung môi dịch chiết bị làm bị trào ra ngoài)

Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vì với một lượng đung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm

được nhiêu hơn nên có ngầm lâu cũng chỉ mât thời gian

Dung môi sau khi thu hôi được làm khan nước băng các chât khan khắc và được

tiêp tục sử dụng đê chiêt các lần sau

Trong thực nghiệm, việc chiêt rắn-lỏng được áp dụng nhiêu, gôm sự ngầm kiệt, sự ngâm dâm, sự trích với máy chiêt Soxhlet, Ngoài ra, còn có sự chiêt với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn

b Kỹ thuật chiết lỏng-lồng

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng thường được áp dụng để: chiết hợp chất cần quan tâm ra

khỏi đung dịch ban đầu, phân chia cao ethanol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp

chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực

khác nhau

Nguyên tắc của sự chiết là dung dung môi không phân cực (thí đụ petroleum ether) sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực (thí dụ các alcol béo, ester béo, ), dung môi phân cực trung bình (thí dụ diethyl ether, dichloromethane, ) hòa tan tốt các hợp chất có tính cực trung bình (các nhóm chức ether -O-, aldehyde -CHO, cetone -O-, ester -COO, ) và dung môi phân cực mạnh (các hợp chất có chứa nhóm chức

-OH, -COOH )

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện trong bình lóng trong đó có cao ethanol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hòa tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ

Trang 22

trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ măm ở lớp trên hoặc năm ở lớp dưới so với pha nước

Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate,

Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng

nhỏ thể tích dung môi có tính phân cực hơn Dung dịch của các lần chiết được gom

chung lại, làm khan với các chất làm khan như Na;SO¿, MpgSO¿, CaSQ,, duéi dung

môi ta thu duoc cao chiét

Dé kiểm tra xem các hợp chất nào được chiết vào pha hữu cơ cũng như các hợp

chất còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký

lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được goi la hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bản mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong ph hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên tấm kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kiếng

Cần lưu ý rằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên có nhiều thay đỗi

1.3 GIỚI THIỆU VÉ PHƯƠNG PHÁP SẮC KY°”

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

a Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, thí dụ như silica gel, hoặc nhôm oxid Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tắm kiếng, tắm nhôm hoặc tắm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

+ Bình sắc ký: một chậu, lọ, băng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy

Trang 23

+ Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như

silica gel, alumin, được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như

tam kiếng, tắm nhôm Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ canxi sunfat khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polyme hữu cơ

+ Mẫu cân phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử đụng khoảng 1 microlit (uL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình

+ Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển cham chậm đọc theo tắm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi

lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phân của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi

vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc đi chuyển này tùy thuộc

vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh

(hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ đi chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm

b Ưu điểm sắc ký bản mồng

Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm như sau: - Chỉ cần một lượng ít mẫu để phân tích

- Có thê phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện

phân tích

- Tất ca các hợp chất trong mẫu phân tích có thê được định vị trên tắm sắc ký lớp mỏng: trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và dài, nên quan sát viên khó phân biệt được đó là mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp ban

c Chất hấp thu silica gel

Silica gel là chất hấp thu được sử dụng thông dụng nhất Silica gel được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng tụ và polymer hóa để

Trang 24

đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ hạt, thê tích lỗ rỗng trên bề mặt như yêu cầu Ngoài ra người ta còn thêm các hợp chất khác để tăng khả năng tách theo mong muôn

H JH WH

oO oO O O

Si Siw Si, _ cŠi ` aSi, O65 wv — Si ~ 06 O 6 OP ene Dnt

Cấu trúc mạng silica gel

Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm -Si-OH; đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất được sắc ký Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức —OH, NH», -COOH ) cé kha nang tao mỗi hydrogen manh, bi silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alcan, terpen (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối

hydrogen) ít bị silica gel g1ữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm

d Dung môi giải ly

Nguyên tắc chọn dung môi: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại Dung môi không được quá dé bay hơi, ví dụ như ethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xi 35°C, gan bang nhiệt độ của

phòng thí nghiệm vào mùa nóng (miễn nam Việt Nam) Dung môi dé bay hơi sẽ dễ

dàng bay đi khỏi tắm lớp mỏng sau khi giải ly

Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cầu tử khác nhau Khả năng tách riêng

các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tý lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp thu và dung môi giải ly Muốn thay đổi khả năng tách, người ta hay đổi thành phần các dung môi sử dụng để giải ly Thường thì người ta sử đụng với hệ hai dung môi

Về nguyên tắc tổng quát, nếu có thể, nên tránh sử dụng hỗn hop dung môi có

nhiều hơn hai cấu tử, vì hỗn hợp phức tạp như thế dễ dàng dẫn đến việc thay đôi pha khi có sự thay đổi nhiệt độ

Trang 25

Sự lựa chọn dung môi để tách tốt các chất khác nhau vẫn tùy thuộc vào kinh nghiệm cá nhân, nhưng những hiểu biết về các đặc tính của chất cần phân tích sẽ giúp ích cho người nghiên cứu

e Các công dụng của sắc ký lớp móng

Kỹ thuật TUC hiện nay vẫn là công cụ rất cần thiết trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt là trong hóa học các hợp chất thiên nhiên

e_ Để công bố đặc điểm của hợp chất vừa chiết tách cô lập e Dé kiém tra lai hai hợp chất có giỗng nhau không e_ Đề tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát e Để chuẩn bị cho sắc ký cột

e_ Để theo dõi tiến trình của một phản ứng hữu cơ e_ Để kiểm tra một hợp chất kém bên

e_ Để cô lập hợp chất (sắc ký lớp mỏng điều chế)

1.3.2 Phương pháp sắc ký cột

a Giới thiệu về phương pháp sắc ký cột

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyên Pha tĩnh thường là

những hạt silica gel có kích thướt tương đối lớn (50-150 um) được nạp trong một cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tách được đặt ở phân trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột, được hứng vào những lọ đặt ngay ống dẫn ra của cột Hệ thống như thế thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả tách thấp so với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột hở cũng có ưu điểm như pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm rẽ tiền, dễ kiếm; có thể

triển khai với một lượng lớn mẫu chất

b Lựa chọn dung môi để khởi đầu giải ly

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò

tìm hệ đung môi giải ly cho phù hợp, với các bước lần lượt như sau:

Trang 26

+ Bước 1: mẫu cần sắc ký được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với nồng độ 10 mg/mL, gọi là dung dịch mẫu (A)

+ Bước 2: chuẩn bị 4-6 tắm ban mong 2,5x10 cm Chấm lên những tâm bán này,

mỗi tắm chấm khoảng 2-5 uL dung dịch (A)

+ Bước 3: mỗi bản mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhan, kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử Với đơn dung môi sé dé dang thay được dung môi nào là phù hợp Từ kết quá đó, cố gắng tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, thí dụ nhu petroleum ether, ethyl acetate

+ Bước 4: đối với mẫu cao thô chiết từ cây cỏ (cao có nhiều hợp chất từ không

phân cực đến rất phân cực), chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đây vết ít phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với R¿= 0,5 và chọn dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đây vết phân cực nhất của cao chiết, lên vị trí ở bản với

R/= 0,2

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thé áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly

Lưu ý:

* Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giỗng nhau

* Dung môi để giải ly cột là hệ đung môi đã chọn trong phần thực nghiệm trên, nhưng phải chỉnh tỷ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với dung môi đã chọn Bởi vì chất hấp thu, thí dụ silica gel đùng cho sắc ký lớp mỏng, với kích cỡ hạt nhuyễn min, lại được phun xịt tráng lên ban bằng áp lực lớn nên có độ chặt chẽ lớn Trong khi đó chất hấp thu do nghiên cứu viên tự nạp cột trong phòng thí nghiệm là loại silica gel dùng cho sắc ký cột, với cỡ hạt lớn hơn, lại được nạp vào cột ở áp suất thường, nên có tính lỏng lẽo hơn

c Kích thước cột và lượng chất hấp phụ

Kích thước cột sắc ký và lượng chất hấp phụ cần được lựa chọn thích dáng để có thê tách tôt các mâu cân sắc ký

Trang 27

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách tốt thì trọng lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lượng) Tuy nhiên, với hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng thì cần sử đụng số lượng lớn chất hấp

thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), còn với hỗn hợp để tách thì có thể sử dụng chất

hấp thu ít hơn

Trước khi tiến hành sắc ký, phải dự đoán trước rằng với một lượng mẫu chất muốn tách (x gam) phải cần bao nhiêu lượng chất hấp thu, sao cho chất hấp thu chiếm một chiều cao phù hợp tromg cột mà cột vẫn còn chỗ chứa dung môi Với lượng chất

hấp thu cụ thể, phải đi tìm một cột sắc ký với kích thước phù hợp

Tỷ lệ giữa chiều cao chất hấp thu trong cột và đường kính trong của cột sắc ký:

e Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt, chiều cao của chất

hấp thu nạp trong cột cần đạt tỷ lệ: chiều cao chất háp thu: đường kính của cột vào

khoảng (10:1)

e Muốn biết lượng chất hấp thu có phù hợp với cột thì cho chất hấp thu khô vào cột để quan sát

d Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Dùng kẹp để giữ cho cột thẳng đứng trên giá Nếu phần đầu ra của cột không có

miếng thủy tỉnh xốp để chặn thì có thể đùng một bông thủy tinh để chặn, tiếp theo phủ

cát lên để có được một mặt bằng phẳng

Chất hấp thu được nạp vào cột dạng sệt được chuẩn bị như sau:

+ Trong một becher đã có sẵn dung môi (dung môi là loại dung môi ít phân cực nhất được dùng để bắt đầu cho quá trình giải ly cột), cho chất hấp thu vào becher, đều

đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa rót vừa khuấy nhẹ đều Lưu ý không được thực hiện

ngược lại nghĩa là rót dung môi vào chất hấp thu bởi vì chất hấp thu gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm chất hấp thu vón cục, sẽ không đồng nhất

Lượng dung môi sử dụng phải vừa đủ để hỗn hợp không được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng

+ Nhờ một phếu lọc có đuôi dài, đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừa mở khóa nhẹ ở bên dưới cột đê cho dung môi chảy ra, hứng vào một becher trông đê ở bên dưới cột, dung môi này được sử dụng lại đê rót trả lại đầu cột

Trang 28

+ Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng thanh cao su khó nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong cột

+ Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra va rót lại đâu cột vài ba lan dé việc nạp cột được chặt chẽ, cho đến khi thay chat hap thu trong cột có dạng đồng nhất

Lưu ý trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột,

hứng lượng dung môi này sử dụng để rót trả lại trên đầu cột Không được để cho đầu

cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi phủ trên phần đầu cột

+ Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang Nếu mặt thống khơng nằm ngang, phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tỉnh khuấy đảo nhẹ phần dung môi gần sát mặt thoáng, làm xáo một phần chất hấp thu ở trên phần đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuống từ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng

e Đặt mẫu chất cần tách lên đầu cột sắc ký

Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạng dung dịch va nạp mẫu chất dạng bột khô

+ Nạp mâu chât ở dạng dung dịch: nêu mầu ở dạng chât lỏng, có thê cho trực tiêệp mẫu lên đầu cột sắc ký Nêu mẫu dạng rắn, hòa tan mâu chât vào một lượng nhỏ

dung môi loại dung môi khởi đâu cho sắc ký cột Dung dịch mâu có nông độ càng đậm

đặc càng tốt, vì như thế lớp dung địch này nằm thành một lớp mỏng trên đầu cột Thực hiện việc nạp mẫu như sau:

* Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, để hạ mức dung môi trong cột xuống

sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột Mặt thoáng của chất hấp thu

lúc này phải năm ngang đêu

* Đóng khóa lại, nạp dung dịch mẫu lên đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng một

pipette để hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu của pipet gần sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành trong của cột, cho dung địch chất chảy dọc ra theo thành trong của cột, chạm xuống bề mặt của chất hấp thu

* Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm cho dung dich mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu ở

đầu cột bị khô

Trang 29

* Dùng pipet cho một lượng nhỏ đung môi mới lên đầu cột, tranh thủ dùng dung môi này để rửa sạch thành ống mà nãy giờ dung dịch mẫu chất đã trây dính trên thành cột Lại mở khóa, cho dung môi chảy ra Lặp lại vài lần việc rửa thành cột như thế để giúp cho dung dịch mẫu chất thấm sâu vào phần chất hấp thu ở phần đầu cột Lặp lại

như thế cho đến khi một lượng ít dung môi lên đầu cột, dung môi sẽ luôn trong suốt

không màu (không bị lây màu của chất mẫu)

* Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột Nếu không có cát, có thể sử dụng bông thủy tinh, bông gòn, giấy lọc có đường kính vừa bằng với đường kính trong của cột Cân thận để không làm xáo

trộn bề mặt đang năm ngay ngắn

* Cuối cùng, cho dung môi vào đây cột để bắt đầu quá trình giải ly

+ Nạp mẫu ở dạng bột khô: nếu chất mẫu không tan trong dung môi loại dung

môi lựa chọn dé bat dau quá trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải

ly, có thê nạp mầu khô

Trong một bình cầu đùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (x gam) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50x gam), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn (10x gam) Hén hop nay được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bây giờ, mâu cân sắc ký đã được tâm lên bê mặt của những hạt silica gel

Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hap thu để bảo vệ mặt cột Cuối cùng cho dung môi vào đây cột để bắt đầu quá trình giải ly

f Theo đõi quá trình giải ly cột

Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu và hứng chúng, khi được giải ly ra khỏi cột

Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng

trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau

Trang 30

Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh

số thứ tự Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau Nên pha một lượng lớn dung môi giải ly

đê hạn chê sai lệch nông độ trong mỗi lọ

Dung dịch trong những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau (giống nhau nhưng có thê chứa nhiều hợp chất, vì hỗn hợp) sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuôi đung môi ở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó

ø Khi nào thay đối hệ dung môi giải ly cột

Sắc ký cột được khởi đầu bằng loại đung môi nào là do kết quả sắc ký trên cao

ban đầu Thí dụ khởi đầu sắc ký cột bằng petroleum ether, cứ tiếp tục giải ly cho đến

khi lọ cuối cùng, hứng dung dịch giải ly ra, đuôi hết dung môi ra khỏi lọ này, cân lại không thẫy có cặn hoặc còn cặn không đáng kẻ, hoặc đuổi bớt đung môi rồi chấm sắc ký lớp mỏng mà không còn hiện vết nữa Điều này có nghĩa là dung môi petroleum ether đã lôi hết ra khỏi cột những hợp chất không phân cực trong cao đã nạp ở đầu cột

Tiếp theo, cần tăng thêm độ phân cực cho dung môi giải ly để tiếp tục quá trình sắc ký cột Lần lượt giải ly từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực

Trang 31

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 CÁC PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VA CAC BUOC TIEN HANH"!

2.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Trang 32

2.1.3 Các phương pháp nghiên cứu

a Điều chế cao

Điều chế cao: cao ethanol tổng được điều chế bằng phương pháp ngẫm dầm Phân lập các cầu tử hữu cơ: cao ethanol tổng được chiết pha lỏng-lỏng với các

dung môi petroleum ether, ethyl acetate, dichloromethane,

b Tiến hành sắc ký cột

Khảo sát thành phần phần hóa học của cao EA và thành phần các chất từ cao BA bằng sắc ký bản mỏng và sắc ký cột

Mẫu sau sắc ký cột được gửi đo NMR tại phân viện Hóa Học - Viện Khoa Học

Công Nghệ Việt Nam số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

2.1.4 Các bước tiễn hành

a Nguyên liệu Thu hái nguyên liệu:

Rễ Bần được cắt lấy là phân nhô lên trên khỏi mặt đất đường kính trung bình của

mỗi rễ khoảng 2 cm chiều cao khoảng 0,4 m đến 0,8 m Địa điểm thu hái là xã Lục Sĩ

Thành - huyện Trà Ôn - tỉnh Vĩnh Long nằm bên bờ sông Hậu phía Đông tiếp giáp với

chợ nổi Trà Ôn

Xử lý nguyên liệu:

Mẫu sau khi được thu hái tại địa điểm trên đem về rửa sạch bằng nước sau đó để ráo nước tiếp theo bóc vỏ cắt nhỏ thành từng miếng, bỏ phần hỏng sau đó cắt nhỏ, phơi khô Sau đó được nghiên bằng máy thành những hạt rất nhỏ tiếp theo cho các hạt

nhỏ được nghiên trên vào các túi vải mỏng đã được chuẩn bị trước sau đỏ cho vào lọ thủy tỉnh 10 lít tiễn hành ngâm cao thô

b Quá trình điều chế thu cao

s* Quá trình điều chế thu cao ethanol (Cao Tổng):

Mẫu nguyên liệu ban đầu sau khi được cho vào túi vải đã được chuẩn bị từ trước được ngâm trong ethanol 96° với lượng mẫu 1,5 Kg sử dụng lọ thủy tinh trong suốt có

dung tích 10 lít va ding 8 lít ethanol 96° cho lần ngâm cao ethanol đầu tiên khi đó

Trang 33

lượng dung môi mới ngập hết các túi vải Sau khi ngâm khoảng hơn 24 giờ ta có thê

chiết lẫy dịch chiết (dung dịch các chất tan duoc trong ethanol) sau đó dùng máy lọc áp suất thấp hoặc phếễu lọc dịch chiết trên qua giấy lọc nhằm loại bỏ phần bột của vỏ cây không tan trong cthanol nhưng với kích thước nhỏ nó có thể lọt qua khỏi các túi vải Đến lúc này ta thu được dung địch chiết dạng màu xanh tương đối loãng sạch cặn khoáng 1000-1500 mL ta tiến hành cô quay trên máy cô quay chân không với nhiệt độ

thích hợp khoảng 50-60°C bằng cách cho dịch chiết trên vào bình cầu 1000 mL với thể

tích dung dịch chiết trên khoảng 300-500 mL cho một lần cô quay tiến hành cô quay ta thu được hai phần: phần thứ nhất là dung môi ethanol ta thu hồi và cho trở lại vào lọ ngâm cao 10 lít, phần thứ hai là dịch chiết những phần tan trong ethanol đã loại một lượng lớn dung môi lúc này nó ở dạng màu xanh đặc sệt đó chinh 14 cao ethanol

Phần ethanol ngâm trở lại hủ sẽ ít hơn lượng dung dịch chiết ra do quá trình cô quay và lượng dung môi chưa cô cạn nên sau khi cô quay lượng dung môi sẽ hao hụt ước khoảng 10% cho nên cần thêm một lượng dung môi ethanol mới vào để cho dung môi có thể thắm ướt hết các túi vải đựng bột cây đã nghiền Và cứ như vậy ta thực hiện tương tự lần đầu ta thu được cao ethanol của các lần chiết thứ hai, ba, bốn, cho đến dung dịch chiết ta thấy màu xanh thật nhạt và thử TLC thấy các vết mờ nhạt chứng tỏ không còn chất tan được trong ethanol nữa Sau đó ta gom tất cả các lần thu cao trên lai sé duoc cao ethanol dang sệt để ngồi khơng khí khoảng một thời gian ngắn lượng dung môi sẽ bay bớt khi đó ta bịt kín và bảo quản lạnh (trong tủ lạnh) nhằm tiếp tục sử dụng cho các mục đích tiếp theo

s* Quá trình điều chế cao petroleum ether (PE)

Cao ethanol đã thu được, đem 50 g lắc chiết với dung môi petroleum ether bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, sử dụng cho quá trình thu cao PE bằng cách:

Dùng bình lóng thể tích 1000 mL được đặt trên một giá đỡ mở nắp và khóa van lại cho một ít dung môi PE vào khoảng 100 mL sau đó cho lượng cao ethanol vào khoảng 200ml tiếp tục cho một lượng dung môi PE vào khoảng 200-300 mL trong bình lóng lúc này đạt khoảng 500-600 mL đóng nắp lại lắc mạnh nhiều lần ta thấy một

lượng lớn các chất rắn như keo bám vảo thành bình màu nâu đỏ (đó là những phần

không tan trong PE) và lượng dung dịch lỏng không phân lớp rõ Sau đó ta để bình lóng trở lại giá đỡ một thời gian sau (khoảng 1-2 giờ) lượng chất keo bám trên bình

Trang 34

dân dần tuột xuống đáy bình và lớp chất lỏng nằm phía trên ta mở van chất keo màu nâu chảy sệt và dung dịch chất lỏng lần lượt ra khỏi bình ta thu thành hai phần: phần lỏng, được lọc dé loại phan nhỏ của chất keo bám theo va phần rắn, cô gan lay duoc

càng nhiều phần rắn ra khỏi bình lóng càng tốt do nó bám trên thành bình khá chặt

Rửa sạch bình lóng sau khi đã thu được hai phân trên tiếp tục sử dụng phần lỏng được cho vào bình lóng đã khóa van cho một lượng rất ít dung môi PE vào để chứng tỏ không có sự phân lớp xảy ra chắc chắn hơn ta cho một lượng ít nước cất vào để dung

dịch lúc này tách ra thành hai pha: pha nước, pha hữu cơ Pha nước nằm lớp đưới pha

hữu cơ nằm lớp trên do khối lượng riêng của nước lớn hơn khối lượng riêng của PE, tach lay hai pha thanh hai phan riêng biệt; pha hữu cơ là những chất tan được trong PE

nên ta tiến hành cô quay thu được cao PE và dung môi PE thu hồi Pha nước được

chiết tiếp trên bình lóng bằng dung môi đến khi chấm TLC trên pha hữu cơ không còn chất nữa thì dừng lại và đựng vào cốc khác để thực hiện quá trình thu cao tiếp theo (cao ethyl acetate) Thực hiện quá trình như vậy nhiều lần và gdp chung lại ta thu được cao PE có khối lượng 2,54 ø và phần còn lại nằm trong pha nước

* Quá trình điều chế cao Dichloromethane (Di) và cao ethyl acetate(EA)

Từ cao EtOH sau khi chiết với cao PE, phần bã còn lại tiếp tục chiết lỏng lỏng với cao

dichloromethane sẽ thu được dịch chiết dichloromethane và được kỹ hiệu là cao DI, lọc thu hồi dung môi, thu được cao DI có khối lượng là: 1,55 g

Sau khi lắc chiết với Dichloromethane (Di), phần bã còn lại tiếp tục lắc chiết với

ethyl acetate, thu dung dich chiét ethyl acetate và được ký hiệu là cao EA, cô quay thu

Trang 35

Trang 36

c Cách phân lập các chất trong rễ Bần

Chủ yếu chỉ khảo sát các hợp chất trên cao EA, do đó chúng được tiễn hành như

sau: tiến hành sắc ký cột thường: chọn cột sắc ký sau đó cân lượng silica gel và lượng

cao nạp cột cho phù hợp, sử dụng phương pháp nạp cột ướt lẫy dung môi giải ly bằng cách chọn hệ dung môi được pha lẫn với nhau hai hệ gom PE va EA, EA va MeOH theo tỷ lệ thích hợp Giải ly cột ta thu được các phân đoạn sau đó thử với TUC xem hợp chất trong các đoạn đó đã tinh khiết chưa, nếu tỉnh khiết gửi mẫu chất đó đo phổ nếu chưa sạch mà mẫu còn khối lượng nhiều (nhiều hơn khối lượng có thể đo phổ)

khoảng trên 20 mg ta tiễn hành nạp cột cho từng đoạn như thế đến khi thu được chất

đã sạch

2.2 QUA TRINH PHAN LAP VA TINH CHE CAC CHAT TREN CAO CHIET®?*!

2.2.1 Quá trình phân lập và tỉnh chế các hợp chất từ cao thô

Dịch chiết ethanol 96° được cô quay loại dung môi, thu được chất lỏng dạng sệt có màu xanh đậm, ký hiệu là cao (EtOH)

Trang 37

Luận văn tốt nghiệp CNHH K34 CBHD: TS Lê Thanh Phước Phân lập và tỉnh chế các hợp chất từ cao EA của rễ cây Ban chua Hình 8: TLC cao EA Pd 1 PHUOC-CHI-01 2.2.2 Khảo sát cao EA bằng sắc ký cột a Nạp cột sắc ký EA Cao EA Sắc ký cột Pđ 2 Pđ 3 Pđ4 Các phân đoạn khác Sắc ký cột

Căn cứ vào quá trình kiêm tra sơ bộ cao EA băng sắc ký bản mỏng, tôi đã tiên hành sắc ký cột cao EA nhằm phân lập những hợp chất riêng biệt

Trang 38

Hình 9: Sắc ký cột thường cao EA

Sau khi chiết với dung môi EA thu được cao EA như nêu trên ta tiến hành phân

lập các chất trên cao này

Cao EA tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường cỡ hạt 0,040-0,063 mm - Khối lượng cao EA: 0,827 g

- Khối lượng silica gel: 12 g — Duong kinh cot: 1,5 cm

— Chiéu cao lép silica gel: 20 cm

— Dung môi ổn dinh cét: Petroleum ether

— Lọ hứng : 10 mL b Theo dõi giải ly cột

Dung môi giải ly cột lần lượt tăng dần độ phân cực bằng cách sử dụng là PE và EA, EA và MeOH được pha theo các tỷ lệ khác nhau Độ phân cực tăng từ: (PE:EA=9:1), (PE:EA=8:2), (PE:EA=1:1), 100% EA, (EA:MeOH=95:5) cột được giải ly hoàn toàn Khi thay đổi (tăng hệ đung môi giải ly) hệ dung môi trước đó ta cần thử

TLC của hệ đang giải ly cột khi mà các chất với hệ giải ly không hiện vết nữa khi đó chứng minh với hệ giải ly đó không đủ mạnh để giải ly cho cột lúc này ta mới tăng độ

phân cực của dung môi lên thực hiện như thế đến khi các chất trên đầu cột được giải ly

Trang 39

xuống hoàn toàn Do khối lượng mẫu cao EA ít suy ra hàm lượng chất nhỏ nên ta cần

thu chất giải ly xuống cuối cột phải thật ít

Dung môi giải ly ra khỏi cột được hứng trong các lọ thủy tỉnh có thê tích 10 mL

và được đánh số thứ tự sẵn

Sau đó chấm TLC các lọ này theo thứ tự đã đánh sẵn Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng hệ dung môi giải ly bản mỏng, để việc so sánh giá tri Ry dễ dàng, từ đó gom chung các lọ có giá trị Ry giống nhau thành một phân đoạn

Bảng 1: Quá trình sắc ký cột trên cao EA cột đường kính 7 mm Khối Phân Thứ tự lọ Dung môi giải ly cột TLC lượng đoạn (g) 1-14 1 PE EA=9:1 Nhiều vết đài Rất ít 1 vết màu hồng tròn 15-26 2 PE:EA=8§:2 0,108 và 1 vét mờ kéo dài 2 vết màu xanh kéo 27-38 3 PE:EA=1:1 , 0,076 theo vét dài 2 vét mau x4m kéo 39-51 4 100% EA , 0,088 theo vêt dài 52-68 5 EA:MeOH=95:5 Nhiều vết mờ 0,063 Xa cot MeOH 0,423 0,423

Hiệu suất sắc ky cot cao EA: H% = 0,827 x 100% =51,15%

Sau khi sắc ký cột tôi thu được nhiều phân đoạn, trong đó phân đoạn 2 là đáng

chú ý nhất, do có khối lượng tương đối lớn hơn Lúc này tuy chưa là chất sạch nhưng

lọ thứ 16, 17, 18 do hàm lượng nhiều trong cao EA ta thấy xuất hiện các tỉnh thể màu

trăng trong đó lọ thủy tỉnh và thử TLC thấy có 1 vết tròn và 1 vết mờ kéo đài trong đó

có một vết chính tròn (TLC thuốc hién mau H,SO, 20% trong MeOH) mau héng tim

do đó nhận thấy có thể làm sạch chất này trên một cột sắc ký thứ hai, sau đó tiến hành nạp cột

Trang 40

2.2.3 Khao sat phan đoạn 2 của cao EA

a Nạp cột sắc ký phân đoạn 2 của cao EA

Hình 10: Cột sắc ký phân đoạn 2

Hình 11: TLC cột sắc ký phân đoạn 2

Nhận xét: Kết qua TLC cho thay, ca hai ban mong đều cho một vết chính đậm và có vết mờ ở phiá dưới vết chính nên tiếp tục sắc ký cột dé làm sạch phân đoạn này

Các thông số của cột sắc ký phân đoạn 2: — Khối lượng cao EA: 0,096 g

- Khối lượng silica gel: 4 g — Đường kính cột: 1 cm

— Chiều cao lớp silica gel: 15 cm

— Dung môi ôn định cột: Petroleum ether — Lọ hứng : 5 mL

Định dạng
Số trang	46
Dung lượng	10,96 MB