Nghiên cứu góp phần xây dựng tiêu chuẩn palmatin clorid nguyên liệu

MỤC LỤCTrang 1.1.2- Thành phần hóa học của dược liệu Hoàng Đằng 3 1.2.2- Tác dụng và các dạng bào chế của Palmatin clorid 61.2.3- Chiết xuất Palmatin clorid từ dược liệu Hoàng Đằng 81.3-

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

ĐÀO THANH TÙNG

NGHIÊN Cứu GÓP PHÂN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

PfiLMfiTIN CLORID NGUYÊN LIỆU

(KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1997 - 2002)

Ngưòi hướng dẫn : DS NGUYỄN ĐÌNH HIỂN

Thời gian thực hiện : 10/2001 đến 5/2002

m ờ ^ q A / h ơ ì i

Ç)'rưởe tiên-, e/iữ phép tồ i (tượe bàụ tà lòttỊỊ hiêí ơn láu iắa ỉĩih thầy,

ạ iá o -(ĩ(ạuụễn (Đ ình Uôiin - níịitèứ thầụ đ ã trựe tiê'ft hưânạ d ẫ n tồ i râ't tận tìn h từ k h i tô i là m ỗ t iin h niên tàm thư e nạhiêtn k ltỡ a hoe (‘h o đ ềit k h i hơàn th àn h Idiơá luận, tố t nựhiêft rDươe iụ <ì)ai họe

ÇJÔÎ xin ehân th àn h {‘ảm ơn eáe f/tầ ạ eâ ạ láo-, eáe cán bặ lũ th u ậ t tùêtt lìậ m àn 7ôỡá dươe, thầụ ạ ỉá a ÇJ& r£)ễ- W ạạe Çfhanh - rphồnxị th í nghiệm ÇJruriQ tăm trttò n ạ (Đ ại họe (Dư,đe 7/5« nội (tã ạiÚỊì ỈÍS tạo- đỉềti íùêtĩ đ ĩ tô i

eấ th ẻ h ơ àn th àn h 3CỈXƠÚ Jàuân

Çjfài eiin ạ sein ùàự tò- lồ tiạ biết ơn (ĩỉn eáe eứ quan đơn tù:

- íXìí rtqh têp CDưỢc p h ẩ m tỉn h lỉỗoà O iình

- ÇJrtmq tâm kiểm, ntịhiêm tyược phẩm - JUQ- phẩm , tỉn h Oỉắe íẬìanxị ('Đã ạ iứ p đứ t&i tvonty qu á trìn h thư c hiên CKhơá, Ỉỉiậ n nàụ,.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2002

Sinh viên

Đào Thanh Tùng

MỤC LỤC

Trang

1.1.2- Thành phần hóa học của dược liệu Hoàng Đằng 3

1.2.2- Tác dụng và các dạng bào chế của Palmatin clorid 61.2.3- Chiết xuất Palmatin clorid từ dược liệu Hoàng Đằng 81.3- Đại cương về phương pháp kiểm nghiệm Palmatin Clorid 111.3.1- Điểm qua tiêu chuẩn đã có của Palmatin clorid 11(tiêu chuẩn dược điển Việt Nam I và tiêu chuẩn cơ sở của

Xí nghiệp dược phẩm Hòa Bình)

1.3.2- Nhận xét và lựa chọn bổ sung tiêu chuẩn kỹ thuật 12

2.2.1- Chiết xuất Palmatin clorid từ nguyên liệu 15

2.2.3- Nghiên cứu khảo sát các phép thử tinh khiết 29

Những năm sau này, với sự xuất hiện của nhiều thuốc kháng sinh dùng ngoài hiệu lực cao hơn, Palmatin clorid ít được sử dụng và vì vậy ít được đặt ra nghiên cứu sâu hơn về thành phẩm và tác dụng.

Trong xu hướng của nền sản xuất dược phẩm ngày nay, các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưu tiên sử dụng hơn Mặt khác, Palmatin clorid có ưu điểm là ít độc, ít tác dụng phụ, rẻ tiền và rất sẩn có Do vậy nhiều xí nghiệp dược phẩm trong nước muốn quay lại với Palmatin và yêu cầu cần nghiên cứu Palmatin clorid kỹ hơn Trong khi đó tiêu chuẩn của Palmatin clorid đã được xây dựng từ những năm 60, điều kiện trang thiết bị và phương pháp chưa được đầy đủ như ngày nay nên đặt ra vấn đề phải tiêu chuẩn hóa lại nguyên liệu này

Với mục đích góp phần xây dựng tiêu chuẩn Palmatin clorid hoàn thiện, chúng tôi dự định và tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1 Tiến hành chiết xuất Palmatin clorid dược dụng từ nguồn nguyên liệu Hoàng Đằng

2 Xây dựng lại tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu Palmatin Clorid phù hợp với điều kiện kỹ thuật hiện hành nhằm nâng cao hơn chất lượng nguyên liệu cho sản xuất

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ NGUỒN NGUYÊN LIỆU.

Palmatin là alcaloid có trong nhiều loài thực vật khác nhau:

- Hoàng Liên chân gà:

Các loài Coptis teeta; Coptis chinensis; Coptis japónica,

Họ Hoàng Liên: Ranunculaceae

- Thổ Hoàng Liên: Thalictrum foliosum, Họ Hoàng Liên: Ranunculaceae

- Hoàng bá: Phellodendron amurense, Họ Cam: Rutaceae

- Hoàng Liên gai: Berberís wallichiana,

Họ Hoàng Liên gai: Berberidaceae

- Vàng đắng: Coscinium fenestratum, Họ tiết dê: Menispermaceae.Đặc biệt Palmatin có nhiều trong cây Hoàng Đằng: Fibraurea resica và

Thân rễ và rễ cây Hoàng Đằng chứa Palmatin với tỉ lệ cao: khoảng 1-3%

1.1.1 Đại cương về cây Hoàng Đằng.

Cây Hoàng Đằng còn được dân gian gọi dưới các tên khác là: Nam hoàng Liên, Thích hoàng Liên, Dây Vàng Giang [5]

Hai loài Hoàng Đằng Fibraurea resica và Fibraurea tinctoria có một số đặc điểm khác nhau:

2

+ Fibraurea resica: Lá hình trái tim Hoa có 3 nhị, chỉ nhị có chiều dài bằng chiều dài bao phấn.

+ Rbraurea tinctoria: Lá thuôn nhọn hơn Hoa có 6 nhị, chỉ nhị dài hơn chiều dài bao phấn

b Phân bố:

Cây Hoàng Đằng mọc tự nhiên ở nhiều khu rừng nước ta Nhiều nhất ở các khu rừng thuộc các tỉnh: Hoà Bình, Lạng Sơn, Cao Bằng, Sơn La, Thanh Hoá, Nghệ An, Bắc Giang, Quảng Ninh [8] Nguồn nguyên liệu mà tôi dùng

để khảo sát là Hoàng Đằng mọc hoang ở rừng Hoà bình thuộc loài Fibraurea tinctoria Lour [6] [2]

1.1.2 Thành phần hoá học của dược liệu Hoàng Đằng.

Trong thân và rễ Hoàng Đằng chứa hoạt chất là alcaloid có nhân Isoquinolein Trong đó alcaloid chính là Palmatin với tỉ lệ 1 - 3% (Tính theo dược liệu khô) [2] Các chất đi kèm:

Jatrorhizin (khoảngO,l%) và Columbamin (khoảng 0,01%) [2] Ngoài

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ PALMATIN CLORID

Khối lượng phân tử: 441,89

- Chê phẩm là bột kết tinh hình kim nhỏ, dài, mượt, màu vàng tươi óng ánh, vị rất đắng

- Độ hoà tan: Tan khoảng 1% trong nước lạnh, 5% trong nước sôi, tan ít trong

ethanol (khoảng 1%), rất khó tan trong cloroíbiTQ, hầu như không tan trong ether.

- Dung dịch chế phẩm 1% trong nước có phản ứng trung tính với giấy quỳ

- Điểm chảy: 202 - 203°c

b Tính chất hoá học: [8]

- Hoá tính, của Nitơ:

Nguyên tố N trong phân tử Palmatin có bậc 4 nên dễ dàng có sự chuyển hoá giữa dạng muối và dạng base tuỳ theo pH môi trường

4

'O C H 3

Nếu thay cr bằng NO"3 được Palmatin nitrat tủa tinh thể màu vàng

- Hoá tính của mạch kép

Do ảnh hưởng của nguyên tử N trong phân tử nên các liên kết đôi ở giữa

có thể bị khử hoá để cho dl - Tetrahydro palmatin, không màu Khi bị oxy hoá trở lại Palmatin màu vàng:

\^ ( oh ) /

OCHí

OCH3

- Hoá tính của oxy

Dưới ảnh hưởng của nhóm liên kết (CT, OH ) nằm ở nhóm amon bậc 4, làm cho N không bền dễ trở lại N bậc 3 Do đó trong môi trường kiềm, Palmatin dễ hỗ biến thành chất mở vòng là Palmatinal có màu đỏ

- Hoá tính của nhóm methoxy (-OCH3)

Trong công thức của Palmatin có 4 nhóm methoxy (-OCH3) nên có thể kết hợp với aceton hay cloroform tạo các phức chất

1.2.2 Tác dụng và các dạng bào chế của Palmatin clorid.

1.2.2.1 Tác dụng trong phòng th í nghiệm (in vitro)

a Với vi khuẩn.

Palmatin clorid có tác dụng kháng sinh đối với một số vi khuẩn Gram (+) [ 5 ] Dung dịch 0,3% trong nước ức chế sự sinh trưởng của một số chủng: Staphyllococcus, Streptococcus, Bacillus, Sacrina, Micrococcus, và một số vi khuẩn Gr(+) gây viêm màng tiếp hợp khác

Riêng Bacillus pyocyareus, Bacillus proteus thì không có tác dụng

Palmatin clorid ít hoặc không có tác dụng với các vi khuẩn Gr (-) như E.coli, Salmonella, Shigella [5]

b.V ớ i nấm:

Palmatin có tác dụng kháng nấm tốt Ở đổng độ 0,3% Palmatin clorid có khả năng ức chế hoàn toàn các loại nấm âm đạo, nhưng tác dụng kém đối với nấm Candida albicans [5]

c Với kí sình trùng.

ở nồng độ 0,6% trong nước, Palmatin clorid có khả năng ức chế hoàn toàn trùng roi âm đạo: Trichomonas vaginalis sau 3 - 5 phút [5]

6

1.2.2.2 Tác dụng trên lâm sàng.

a Chữa nhiễm khuẩn mắt.

Dùng Palmatin clorid dưới dạng dung dịch 0,1%; 0,3%, thuốc mỡ 0,3%

để chữa viêm kết mạc, viêm màng tiếp hợp cấp tính, bán cấp, viêm mí mắt và bệnh đau mắt hột [ 5 ]

b Điều trị viêm cổ tử cung.

Điều chế Palmatin clorid dưới dạng viên đặt âm đạo để điều trị viêm cổ

tử cung do tạp khuẩn, trùng roi âm đạo cho kết quả tốt [ 5 ]

c Điều trị bệnh phụ khoa.

Điều chế Palmatin clorid với nhiều dạng bào chế: viên trứng đặt âm đạo, viên nén đặt âm đạo, thuốc rửa phụ khoa, thuốc bột để điều trị các bệnh phụ khoa như nhiễm khuẩn, nhiễm nấm âm đạo, trùng roi âm đạo Kết quả điều trị tốt [5]

Tuy nhiên, tác dụng và ứng dụng trên lâm sàng của Palmatin clorid mới được nghiên cứu bước đầu và trong điều kiện kỹ thuật còn chưa đầy đủ Hiện nay còn chưa nhất quán trong các kết quả nghiên cứu Đặt ra yêu cầu cần được khảo nghiệm kỹ hơn để có kết luận chính xác

1.2.2.3 Các dạng bào chế của Palmatìn clorid.

Trong những năm 1960 - 1970, trong điều kiện đất nước có chiến tranh,

dể phục vụ các nhu cầu điều trị, Palmatin cloriđ được sản xuất hàng loạt với nhiều dạng bào chế khác nhau như:

- Viên trứng đặt âm đạo với hàm lượng Palmatin clorid là 15% có thể kết hợp thêm Magiê sulffat để điều trị các bệnh phụ khoa cho kết quả tốt lại rẻ tiền, tác dụng dịu đau [5 ]

- Dung dịch Palmatin clorid 10%, 13,6% trong glycerin: Dùng làm thuốc rửa phụ khoa

- Thuốc bột: Kết hợp Palmatin với bằng sa phi, phèn phi hoặc Magiê Sulfat để chế thành thuốc bột phụ khoa [5 ]

- Viên nén đặt âm đạo: cũng kết hợp với phèn phi, bằng sa phi hoặc Magiê sulffat với tỉ lệ thích hợp bào chế thành viên nén đặt âm đạo [5].

- Thuốc mỡ Palmatin clorid 0,3%; dung dịch Palmatin clorid 0,3% đểđiều trị các nhiễm khuẩn mắt: viêm màng tiếp hợp, viêm kết mạc, viêm mí mắt, đau mắt hột Thuốc có ưu điểm là không gây kích ứng mắt, khôríg xót,

Các chế phẩm của Palmatin nói chung đều có nhược điểm lớn nhất là có màu vàng dễ gây bẩn và không mỹ quan Hiện nay, với sự xuất hiện của nhiều dược phẩm có tác dụng tốt hơn, Palmatin clorid ít được quan tâm Tuy nhiên với nhiều ưu điểm Palmatin clorid vẫn được các cơ sở điều tiị đặc biệt ở tuyến địa phương khó khăn về kinh tế và có sẩn nguồn nguyên liệu quan tâm, nhất là các chế phẩm thuốc tra mắt và thuốc rửa phụ khoa

1.2.3 Chiết xuất Palmatin clorid từ dược liệu Hoàng Đằng.

Trong dược liệu Palmatin tồn tại dưới dạng muối của các acid hữu cơ: muối tartrat, citrat, oxalat [8] Các dạng muối này có khả năng tan chậm trong nước, cồn

Sau khi chiết bằng dung môi thích hợp, chuyển Palmatin thành dạng muối clorid bằng cách kết tinh trong acid clohydric thu được Palmatin clorid Tinh chế thì thu được Palmatin clorid dược dụng

Dựa vào dung môi sử dụng, có thể chia làm hai phương pháp chiết xuất palmatin

- Chiết xuất bằng dung môi nước

- Chiết xuất bằng ethanol

1.2.3.1 Chiết xuất bằng dung môi nước.

a Phương pháp dùng acid acetic hoặc dấm ăn:

Qua các giai đoạn: [7]

8

- Chiết xuất: Dược liệu khô đem làm nhỏ, chia làm nhiều phần Dùng dung môi là acid acetic 1% hoặc nước pha với 1/3 dấm ăn để chiết dược liệu theo phương pháp chiết ngược dòng gián đoạn.

- Loại tạp: Gộp dịch chiết, thêm vổi bột, khuấy đều để yên 12h Gạn lọc lấy dịch

- Tủa Palmatin clorid: Thêm muối NaCl bão hoà vào dịch lọc, khuấy đều,

để cách đêm Gạn lấy lớp tủa, acid hoá bằng HC1 10% tới pH 1 - 2, để qua đêm thu được Palmatin clorid thô

- Tinh chế: Hoà tan tủa Palmatin clorid thô vào ethanol 96° Đun khuấy cho tan Lọc nóng lấy dịch trong Để nguội rồi cho vào tủ lạnh trong 12h - 24h thu được Palmatin clorid kết tinh Lọc hút lấy tủa kết tinh, rửa, sấy ở 40 - 60°c trong 4 - 5h

Phương pháp này cho tỷ lệ Palmatin clorid chiết được khoảng 0,8 - 1,5%

so với dược liệu khô

b Chiết xuất bằng nước nóng [7].

- Chiết xuất: dược liệu khô sau khi làm nhỏ đem chiết bằng nước sôi theo phương pháp chiết xuất ngược dòng gián đoạn hoặc có thể ngâm nóng bằng nước sôi Gộp dịch chiết khoảng 5/1 lượng dược liệu, đem cô thành cao đặc

- Loại nhựa: Thêm ethanol 96° vào cao đặc, khuấy, để yên 8h Gạn lọc lấy dịch trong Đem cô cách thuỷ lấy cắn khô Thêm nước sôi Khuấy, để lắng

dịch Để nguội dịch lọc rồi cho vào tủ lạnh 12-24h để kết tinh, lọc hút chân không, rửa bằng cồn lạnh, đem sấy 40-60°C trong 4-5h.

Phương pháp này cho hiệu suất thấp Palmatin clorid thu được khoảng 0,5 - 1,2% so với lượng dược liệu khô

1.2.3.2 Phương pháp chiết xuất bằng ethanol 96 °

[7]. Chiết xuất: Dược liệu khô sau khi làm nhỏ đem ngâm nóng hoặc ngâm bằng ethanol 90° ở nhiệt độ phòng trong 12 - 24h Gạn, lọc, ép lấy dịch, bã có thể đem chiết lại

- Loại nhựa: Gộp dịch chiết đem bốc hơi cách thuỷ (có thể thu hồi cồn nếu có điều kiện) sẽ thu được cắn Palmatin có lẫn nhựa Thêm nước sôi khuấy

kỹ, để lắng 12h để loại nhựa Lọc lấy dịch trong

- Kết tinh Palmatin clorid: Cô đặc dịch cho đến khi mặt dịch có màu vàng Để nguội tới 40°c,thêm từ từ dung dịch HC1 10% vừa thêm vừa khuấy cho đến khi dung dịch có pH: 1 - 2 Để nguội đến nhiệt độ thường, cho vào tủ lạnh trong 12 - 24h thì có Palmatin clorid kết tinh

- Tinh chế: Lọc lấy Palmatin clorid thô, hoà tan vào ethanol 96°, đun cách thuỷ sôi Thêm than hoạt, đun sôi tiếp 10 phút lấy ra lọc nóng qua phễu chân không thu lấy dịch lọc Để nguội dịch lọc rồi để yên trong tủ lạnh trong

12 - 24h có Palmatin clorid kết tinh Lọc hút lấy Palmatin clorid, rửa nhanh trên phễu bằng cồn lạnh

Đem sấy khô ở nhiệt độ 40 - 60°c trong 4 - 5h Phương pháp này cho hiệu suất cao, Palmatin clorid thu được khá tinh khiết Lượng Palmatin clorid thu được khoảng 1 -3 % lượng dược liệu khô [7]

Trong các phương pháp chiết xuất Palmatin clorid từ dược liệu Hoàng Đằng kể trên, mỗi phương pháp có ưu điểm riêng Tuỳ vào điều kiện trang thiết bị và hoá chất, cơ sở sản xuất lựa chọn phương pháp áp dụng Tuy nhiên phương pháp chiết xuất bằng ethanol được ưu tiên lựa chọn hơn

10

1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP KIEM n g h iệ m PALMATIN CLORID.1.3.1 Điểm qua tiêu chuẩn đã có của Palmatin clorid (tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam I và tiêu chuẩn cơ sở của xí nghiệp Dược phẩm Hoà Bình).

1.3.1.1 Các phép định tính.

Định tính Palmatin clorid chủ yếu dựa vào các phản ứng hoá học đặc trưng của các alcaloid có nhân isoquinolein kiểu proberberin

- Lấy 5ml dung dịch 1% chế phẩm trong nước, thêm lml acid nitric (TT)

cho kết tủa tinh thể màu vàng của Palmatin clorid [1]

- Lấy 5ml dung dịch 1% chế phẩm trong nước, thêm lml dung dịch Natri hydroxyd (TT), màu vàng của dung dịch sẽ chuyển thành đỏ, thêm vài giọt aceton (TT), dung dịch trở nên đục, để yên có tủa vàng lắng xuống của anhydro Palmatin aceton (phản ứng của các nhóm methoxy) [1]

- Lấy 2ml dung dịch 1% chế phẩm trong nước, thêm acid nitric (TT) cho tới khi không tạo thêm tủa nữa Lọc lấy dịch, thêm vào 1 giọt dung dịch Bạcnitrat (TT), sẽ có tủa trắng lổn nhổn không tan trong acid nitric (TT), tan trong dung dịch amoniac (TT) (Phản ứng của ion clorid) [1]

1.3.1.2 Các phép thử tinh khiết.

- Giảm khối lượng do sấy khô: Làm với 0,5g chế phẩm Nhiệt độ sấy 80°c Sấy đến khối lượng không đổi Khối lượng mất đi không đuợc quá 13,5%

- Tro sulfat: Làm với lg chế phẩm Sau khi nung với acid sulfuric đậm đặc, tro không được quá 0,1%

1.3.1.3 Các phép định lượng.

a Phương pháp định lượng trong môi trường khan:

Palmatin là một base yếu, trong môi trường acid acetic khan có thể chuẩn

độ trực tiếp Palmatin clorid bằng chất chuẩn là dung dịch acid perclorric 0,1M trong acid acetic băng Để tránh sự ảnh hưởng của ion clorid trong chế phẩm tới lượng chất chuẩn acid perclorric dùng khi chuẩn độ, dùng dung dịch thuỷ

ngân (II) acetat Để phát hiện điểm kết thúc chuẩn độ dùng chỉ thị màu tím tinh thể, tại điểm kết thúc chuẩn độ, chỉ thị chuyển màu từ đỏ tím sang xanh lục bẩn [1] Hoặc phát hiện bằng máy đo điện thế.

b Phương pháp cân [9].

Palmatin clorid là một alcaloid có khả năng phản ứng với một số chất để tạo ra kết tủa có khối lượng xác định Sấy, cân lượng tủa tạo ra sẽ xác định được lượng Palmatin tương ứng

Xí nghiệp Dược phẩm Hoà bình dùng phương pháp tạo kết tủa giữa dung dịch chế phẩm với acid picric: Cân, pha dung dịch chế phẩm, thêm acid picric

dư để lạnh qua đêm thu được tủa tinh thể Palmatin picrat Lọc hút lấy tủa tinh thể đem cân Từ lượng tủa tinh thể Palmatin picrat xác định được lượng Palmatin clorid

1.3.2 NHẬN XÉT VÀ LựA CHỌN Bổ SUNG TIÊU CHUAN k ỹ t h u ậ t

Tiêu chuẩn kỹ thuật của Palmatin clorid nguyên liệu đã có được xây dựng đã lâu khi điều kiện trang thiết bị và các phương pháp chưa đầy đủ Ngày nay yêu cầu về tiêu chuẩn đặt ra với chế phẩm ngày càng cao, tiêu chuẩn đã có của Palmatin clorid bộc lộ nhiều điểm còn chưa đầy đủ, chưa phù hợp Mặt khác, các cơ sở kiểm nghiệm ngày nay được trang bị tương đối hiện đại đáp ứng được nhiều phép kiểm nghiệm Xuất phát từ thực tế đó, cùng với nghiên cứu khảo sát chế phẩm Palmatin clorid, tôi xin có một số nhận xét sau:

13.2.1 Trong các phép định tính.

Do sự giống nhau về cấu trúc giữa Palmatin và Berberin là một alcaloid cũng có thể có mặt trong các nguyên liệu sản xuất Palmatin, nèn các phản ứng hoá học để định tính Palmatin clorid cũng cho kết quả tương tự với Berberin clorid Để phép định tính cho kết quả đặc hiệu có thể bổ sung thêm một số phương pháp hoá lý khác như:

- Xác định phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến của dung dịch chế phẩm

- Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi xác đinh, xác định Rf so với chuẩn

12

- Xác định phổ hấp thụ hồng ngoại và đo nhiệt độ nóng chảy (nếu cần thiết và có đủ điều kiện )

3.2.2 Trong thử tinh khiết.

Do yêu cầu độ tinh khiết của chế phẩm cao hơn, nên cần bổ sung các chỉ tiêu: Độ trong và màu sắc, giới hạn acid của chế phẩm, giới hạn Sulfat, giớihạn kim loại nặng, giới hạn của các alcaloid khác

3.2.3 Trong phép định lượng Định lượng bằng các phương pháp sau :

- Phương pháp cân: Có thể dẫn đến nhiều sai số do điều kiện phản ứng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất phản ứng tạo tủa, ngoài ra còn dễ gây sai số

do điều kiện kỹ thuật

- Phương pháp định lượng trong môi trường khan: đòi hỏi cao về điều kiện tiến hành: độ ẩm môi trường, dung dịch chuẩn độ, dung môi Gây khó khăn cho thực hiện đặc biệt là bước hoà tan chế phẩm vào dung môi

- Phương pháp định lượng đo quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến Phương pháp này có ưu điểm nổi bật do:

+ Bản thân dung dịch chế phẩm Palmatin clorid có màu vàng bền

+ Tính tan của chế phẩm tốt, dung dịch ổn định ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ.' + Thiết bị đo hầu hết có sẩn ở các cơ sở kiểm nghiệm

+ Thao tác thuận tiện

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM.

2.1.1 Nguyên vật liệu và máy móc.

a Hoá chất, nguyên liệu:

- Dược liệu: Thân và rễ cây Hoàng Đằng lấy tại rừng Hoà Bình

- Chế phẩm Palmatin clorid nguyên liệu của xí nghiệp Dược phẩm Hoà K

- Cân phân tích hiện số Mettler AB 204 độ chính xác 0,lm g

- Máy đo quang phổ 6405 UV/VIS Jenway và Varian 100 (Bắc Giang)

- Hệ thống định lượng trong môi trường khan 716 - DMS - Titrino (Bắc Giang)» * *

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Tham khảo các tiêu chuẩn kiểm nghiệm đã có của Palmatin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam I và tiêu chuẩn cơ sở của xí nghiệp Dược phẩm Hoà Bình

- Khảo sát tính đúng đắn của các phương pháp đã có

- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất vật lý, hoá học của Palmatin clorid

để nghiên cứu đề xuất bổ sung các phương pháp và chỉ tiêu

- Bằng thực nghiệm nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tiến hành để xây dựng các phương pháp bổ sung

14

- Dựa vào các tiêu chuẩn đánh giá một phương pháp phân tích để đánh giá phương pháp mới xây dựng.

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT.

2.2.1 Chiết xuất Palmatin clorid từ nguyên liệu.

Nguồn nguyên liệu tôi dùng là thân và rễ cây Hoàng Đằng có nguồn gốc

từ rừng Hoà Bình Sau khi chặt khúc, phơi khô, xay vụn Bột dược liệu được chia làm nhiều phần, đem chiết xuất ở qui mô phòng thí nghiệm Tôi thực hiện chiết theo các phương pháp khác nhau để:

- Tìm các thông số cho từng phương pháp

- So sánh các phương pháp

Các phương pháp chiết xuất khảo sát là:

- Chiết xuất bằng ethanol

- Chiết xuất bằng nước nóng

- Chiết xuất bằng nước acid

' Mục đích chính của tôi là đi sâu nghiên cứu chiết xuất Palmatin clorid bằng ethanol, do đó tôi chỉ chiết bằng nước nóng và bằng nước acid một số ít lần để rút kinh nghiệm và so sánh

2.2.1.1 Chiết xuất bằng nước nóng:

Phương pháp dùng là ngâm nóng (mục 1.2.3.1.b)

- Lượng nguyên liệu dùng: 500g bột Hoàng Đằng

- Số lần ngâm: 5 lần

- Thời giaủ mỗi lần ngâm: lh

- Lượng dung môi dùng: 500ml mỗi lần ngâm

- Lượng Palmatin clorid thu được: 5,5g

- Hiệu suất: 1,1%

Nhận xét: Phương pháp chiết bằng nước nóng có:

* Ưu điểm: + Dung môi rẻ tiền sẩn có (nước)

+ Điều kiện sản xuất an toàn, không độc hại

+ Thiết bị đơn giản, dễ tiến hành.

* Nhược điểm:+ Khó lọc, khó loại nhựa do tạp chiết ra nhiều

(dung môi chiết không chọn lọc)+ Khó kết tinh, chế phẩm xấu

+ Hiệu suất thấp

2.2.1.2, Chiết xuất bằng nước acid.

Theo qui trình chiết xuất ngược dòng gián đoạn (mục 1.2.3.1.a) với dung môi dùng là dung dịch acid acetic 1% Dịch chiết loãng đem làm dung môi chiết dược liệu mới

- Lượng nguyên liệu dùng: 500g bột Hoàng Đằng

- Chiết cho tới khi dịch chiết chỉ còn hơi vàng

- Lượng dịch chiết thu được: 2000ml

- Lượng Palmatin clorid thu được: 6,5g

- Hiệu suất: 1,3%

Nhận xét: Phương pháp chiết bằng dung môi acid acetic 1% theo phương

pháp ngược dòng gián đoạn có:

* Ưu điểm: + Thiết bị đơn giản, dễ tiến hành

+ Hiệu suất cao hơn chiết bằng nước

* Nhược điểm:+ Tạp vẫn còn nhiều, kết tinh khó và không đồng đều

lố

2.2.I.3 Chiết xuất bằng ethanol.

Các giai đoạn theo quy trình ở mục 1.2.3.2

Dùng phương pháp chiết bằng ethanol, để khảo sát các thông số, chúng tôi đề ra nhiệm vụ là giải quyết các vấn đề sau:

- Chọn phương pháp đun nóng cách thuỷ hay ngâm lạnh

- Chọn thời gian cần thiết để ngâm hay đun nóng cách thuỷ

- Xác định thời gian cần thiết để kết tinh, nhiệt độ kết tinh khi tủa Palmatin clorid và khi tinh chế

- Tỉ lệ than hoạt cần thiết dùng khi tinh chế

Để xác định các thông số trên chúng tôi làm nhiều mẻ với các thông số khác nhau trong cùng điều kiện:

a Đ ể xác định lựa chọn phương pháp chiết bằng đun nóng cách thuỷ hay ngâm lạnh và thời gian chiết.

Chúng tôi làm 4 mẫu sau:

Mẫu 1: Đun sôi cách thuỷ với sinh hàn ngược trong 0,5h

Mẫu 2: Đun sôi cách thuỷ với sinh hàn ngược trong lh

Mẫu 3: Ngâm nhiệt độ phòng trong 16h

Mẫu 4: Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h

Các mẫu trên có cùng:

- Lượng bột dược liệu Hoàng Đằng: 300g

- Lượng dung môi cồn ethanol 90° đem dùng là 1.200ml

- Cùng thời gian kết tinh Palmatin clorid: 24h

- Cùng nhiệt độ kết tinh (4°C)

- Cùng lượng than hoạt đem dùng khi tinh chế: 600mg

Ngoài điều kiện chiết xuất ban đầu khác nhau, các bước tiến hành khác thì tương tự Mỗi mẫu làm nhiều lần lấy kết quả trung bình, kết quả như sau:

~~~ Mẫu

Số liệu

Lượng Palmatin clorid thô thu

mẫu thấy: lượng Palmatin clorid thu được ở mẫu 3 và 4 nhiều hơn mẫu 1 và 2,

hiệu xuất chiết và hiệu suất của quá trình tinh chế cũng cao hơn Điều đó chứng tỏ là khi ngâm lạnh thì cho hiệu suất cao hơn tinh chế dễ hơn so với khi đun nóng cách thuỷ Do đó chúng tôi chọn phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng trong 16h làm phương pháp chiết

b Đ ể xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình kết tinh Palmatin clorid.

Tôi làm 4 mẫu sau:

- Mẫu 1: Kết tinh ở 4°c trong 16h

- Mẫu 2: Kết tinh ở 4°c trong 24h

- Mẫu 3: Kết tinh ở 0°c trong 16h

- Mẫu 4: Kết tinh ở 0°c trong 24h Các mẫu trên được chiết xuất với cùng:

- Phương pháp chiết bằng ngâm lạnh trong 16h

- Lượng dược liệu đem dùng: 300g

- Lượng than hoạt đem dùng (600mg)

18

Kết quả như sau:

Số liệu

Lượng Palmatin clorid thô thu

c Xác định tỉ lệ than hoạt dùng khi tinh chế.

Than hoạt dùng khi tinh chế với mục đích loại các chất màu, nhựa theo

cơ chế hấp phụ Càng dùng nhiều than hoạt thì dung dịch sau khi lọc càng trong kết tinh càng dễ và đẹp nhưng dược chất lại bị hấp thụ gây hao hụt khi tinh chế Để lựa chọn tỉ lệ than hoạt phù hợp, tôi làm 3 mẫu tinh chế với: Cùng lượng Palmatin clorid thô dùng, cùng nguồn gốc từ 1 mẻ chiết, mỗi mẫu lOg cùng nhiệt độ kết tinh, thời gian kết tinh, cùng các thao tác khi kết tinh Các mẫu chỉ khác nhau ở tỉ lệ than hoạt dùng so với lượng Palmatinclorid thô:

- Mẫu 1: Dùng 0,2g than hoạt (2%)

- Mẫu 2: Dùng 0,3g than hoạt (3%)

- Mẫu 3: Dùng 0,5g than hoạt (5%)

Kết quả:

- Mẫu 1: Palmatin clorid thu được sau khi kết tinh 1 lần có khối lượng:

2 62g Bộtkết tinh thu được vụn, có màu vàng sậm Hiệu suất của quá trìnhtinh chế: 26,20%

- Mẫu 2: Lượng Palmatin clorid thu được: 2,618g, bột kết tinh dài, mượt, màu vàng sáng Hiệu suất của quá trình tinh chế: 26,18%

- Mẫu 3: Lượng Palmatin clorid thu được sau khi tinh chế là 2,380g Bột kết tinh dài mượt, vàng sáng Hiệu suất của quá trình tinh chể 23,80%

So sánh kết quả các mẫu trên thấy:

- Về hiệu suất: càng dùng nhiều than hoạt càng hao hụt nhiều dược chất, hiệu suất càng giảm Mẫu 1 và 2 tương đương nhau

- Về cảm quan của chế phẩm thu được sau tinh chế: Dùng càng nhiều than hoạt chế phẩm có màu càng vàng sáng, tinh thể dài, đẹp Mẫu 1: Chế phẩm màu xấu, hình dạng tinh thể không đều, đẹp Mẫu 2 và 3 đẹp gần như nhau

Từ các phân tích trên chúng tôi chọn tỉ lệ than hoạt dùng là 3% so với lượng Palmatin clorid thô

Như vậy qua khảo sát tôi xác định được các thông số thích hợp sau:

- Phương pháp chiết là ngâm lạnh trong cồn ethylic ở nhiệt độ phòng trong Ỉ6h

- Kết tinh Palmatin clorid ở 4°c trong 24h

- Tỷ lệ thân hoạt dùng là 3% so với lượng Palmatin clorid thô.

2.2.2 Nghiên cứu khảo sát các phép định tính.

Sau khi chiết xuất bằng phương pháp và qui trình đã được xác định, lượng Palmatin clorid thu được chúng tôi đem dùng làm chế phẩm để khảo sát các phép định tính

Trong đó đi sâu nghiên cứu về phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ hấp thụ tử ngoại, khả kiến.

2.2.2.I Khảo sát các phản ứng hoá học:

Các phản ứng hoá học chúng tôi khảo sát là các phản ứng đã có trong tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam I, bao gồm:

a Phản íttig tạo muối Palmatin nitrat kết tủa

- Cân lg chế phẩm, hoà tan vào 100ml nước lắc kỹ và đun nóng cách thuỷ cho tan Lấy 5ml chế phẩm cho vào ống nghiệm, thêm lml dung dịchacid nitric (TT)

Kết quả: Xuất hiên tủa tinh thể màu vàng (Palmatin nitrat)

b Phản íũig của nhóm methoxy: tạo phức với aceton:

Lấy 5ml dung dịch 1% chế phẩm trong nước Thêm lm l dung dịch Natri hydroxyd (TT), dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ (do tạo thành Palmatinal) Thêm 6 giọt aceton (TT), dung dịch trở nên đục, để yên có tủa vàng lắng xuống (Do tạo thành phức anhydro Palmatin aceton)

c Phẩn ứĩig của ion cỉorid.

Lấy 2ml dung dịch 1% chế phẩm trong nước, thêm acidnitric (TT) tới khi không còn tạo thêm kết tủa nữa Lọc bỏ tủa lấy dịch, thêm 1 giọt dung dịch bạc nitrat (TT), xuất hiện tủa trắng lổn nhổn (Bạc clorid) Lấy một ít tủa cho vào ống nghiêm, thêm lm l dung dịch amoniac (TT) tủa sẽ tan ra

222 2 Nghiên cứu phương pháp sắc ký lớp mỏng.

Các phản ững hoá học trên đây đều có thể dương tính với Berberin do sự tương đồng về cấu trúc hoá học giữa Palmatin và Berberin, do đó sắc ký lớp mỏng có thể giúp phân biệt hai chất

Khi tiến hành sắc kỷ lớp mỏng, tôi đề ra các mục tiêu sau:

- Tun hê sắc ký để tách được Palmatin và Berberin Với hệ sắc kỷ này, xác định sơ bộ sự có mặt hay không của Berberin trong chế phẩm

- Tim hệ sắc ký để tách được các tạp chính đi kèm palmatin

Trong các alcaloid của dược liệu Hoàng Đằng, ngoài Palmatin là alcaloid

chính còn có sự có măt của các alcaloid khác bao gồm: Jatrorhizin (khoảng

0,1%), Columbamin (khoảng 0,01%) và vết Berberin [8]

Để tiến hành sắc ký cần có các chất chuẩn:

- Palmatin clorid chuẩn

- Berberin clorid chuẩn

Do không có Jatrorhizin và Columbamin chuẩn, nên chúng phải dùng sắc

ký điều chế với hệ dung môi là hệ tách các tạp từ Alcaloid toàn phần Hoàng Ịj_ ý -

Đằng lấy Jatrorhizin và Columbamin

a Tìm hệ dung môi đ ể tách Palmatin và Berberin:

Căn cứ vào các hệ dung môi dùng để sắc ký đối với các alcaloid có nhân

isoquinolein kiểu protoberberic chúng tôi tiến hành khảo sát với các hệ dung

môi sau:

Hệ 1: Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1 :2 ]

Hệ 2: Cloroform: methanol: amoniac đậm đặc [14: 7: 1]

Hệ 3: n - Butanol: acid acetic băng: nước [7: 1: 2]

Hệ 4: Methanol: amoniac đậm đặc: nước [ 8 : 1 : 1 ]

Với mỗi hê dung môi khi sắc ký với mỗi bản sắc ký, chúng tôi chấm 3 vết

riêng biệt:

- Vết 1: Palmatin clorid chuẩn

- Vết 2: Berberin clorid chuẩn

- Vết 3: Chấm Palmatin clorid chuẩn và Berberin clorid chuẩn

Các chất chuẩn được pha trong ethanol với nồng độ 0,1%, lượng dung

dịch chấm là 3ụ.l

Bản mỏng sắc ký là bản mỏng tráng sẵn Silicagen GF 254 của hãng

Merck (kích thước 5 X 12cm)

22

Khi dung môi chạy được khoảng 9 - 10cm lấy bản mỏng ra hong khô, phun thuốc thử Dragendorff Sẽ có vết Palmatin màu vàng cam, vết Berberin màu đen.

Mỗi hệ dung môi tiến hành sắc ký 5 lần để lấy kết quả trung bình

Kết quả như sau:

- Hệ 1: Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1:2]

Palmatin và Berberin có Rf ngang nhau sắc đồ 3 không tách thành 2 vếtriêng biệt [Bảng 1.1-Phụ lục]

R f trung bình của Palmatin là 0,550; của Berberin là 0,551

Vậy với hệ dung môi này không thể tách được Palmatin và Berberin

- Hệ 2: Cloroform: Methanol: Amoniac đậm đặc [14 : 7 : 1]

Vết Palmatin và Berberin chạy ngang nhau, sắc đồ 3 không tách ra 2 vết

rõ rànơ [Bảng 1.2-Phụ lục] Rf trung bình của Palmatin là 0,338, của Berberin

là 0,344

Hệ này cũng không tách được Palmatin và Berberin

- Hệ 3: n-Butanol: Acid acetic băng: nước [7:1:2]

Quan sát khi các vết đang chạy thấy vết Berberin chạy vượt lên trước, sắc

đồ 3 tách ra làm 2 vết riêng biệt [Huih 5 ]

- Hệ 4: Methanol: amoniac đậm đặc: nước [8:1:1]

Vết Palmatin và Berberin chạy ngang nhau, vết chấm chung không tách thành 2 vết, [Bảng 1.3-Phụ lục] nên loại bỏ hệ dung môi này

1: Palmatin clorid chuẩn2: Berberin clorid chuẩn

3: Palmatin clorid + Berberin clorid

ỊKĨnK.5 : Sắc ký đồ tách Berberin ra khỏi Palmatin trong dung môi 3

Vậy có thể lựa chọn hệ dung môi 3: n-Butanol: Acida cetic băng: nước [7:1:2] làm hệ dung môi để tách Palmatin và Berberin.

* Ấp dung hê dune mối 3 để sắc ký với chế phẩm: Trên bản sắc ký chấm riêng biệt 3 vết, mỗi vết 3

^ 365 nm mới thấy

Vậy có thể thấy rằng Berberin có ở trong chế phẩm với lượng rất nhỏ

b Tìm hệ dung môi đ ể sắc ký tách các tạp khác trong chế phẩm.

Tôi tiến hành khảo sát với các hệ dung môi đã khảo sát như phần khảo sát hệ tách Palmatin và Berberin

Với mỗi hệ dung môi ở từng bản mỏng sắc ký chấm 2 vết mỗi vết s jưl

- Vết chấm 1: Dung dịch chế phẩm

- Vết chấm 2: Palmatin clorid chuẩn

Bản sắc ký Silicagel - GF254 tráng sẵn của hãng Merck kích thước 5x 12cm

Sau khi dung môi chạy được khoảng 9 - 10cm thì lấy ra, đánh dấu các vết Sau đó để khô và phun thuốc thử Dragendorff và đo, tính Rf

Kết quả như sau:

- Hệ 1: Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1:2]