Trong y học cổ truyền, nọc bò cạp được sử dụng rộng rãi với nhiều tác dụng, trong đó có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Mặc dù đã được ứng dụng trong dân gian từ lâu và đã có nhiều nghiên cứu về thành phần, tác dụng dược lý, ... nhưng đến nay ở Việt Nam nọc bò cạp vẫn chưa được dùng làm nguyên liệu trong y dược vì chưa được tiêu chuẩn hóa. Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 GÓP PHẦN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT NGUYÊN LIỆU NỌC BỊ CẠP (Venenum Heterometrus laoticus) Trần Thanh Mai*, Hồng Ngọc Anh**, Lê Thị Thu Cúc***, Hoàng Thùy Linh****, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Trong y học cổ truyền, nọc bò cạp sử dụng rộng rãi với nhiều tác dụng, có tác dụng giảm đau, kháng viêm Mặc dù ứng dụng dân gian từ lâu có nhiều nghiên cứu thành phần, tác dụng dược lý, đến Việt Nam nọc bò cạp chưa dùng làm nguyên liệu y dược chưa tiêu chuẩn hóa Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu thực với mục tiêu góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn ngun liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Nọc bò cạp Heterometrus laoticus Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Phương pháp nghiên cứu: Việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus thực lô nguyên liệu, bao gồm tiêu: tính chất, độ tan, độ ẩm, pH, định tính protein tồn phần, định tính hetlaxin, xác định LD50 Kết quả: Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Trong đó, protein tồn phần định tính phản ứng Biuret, hetlaxin định tính phương pháp LC-ESI-MS LD50 nọc bò cạp Heterometrus laoticus sử dụng đường tiêm da tính theo phương pháp Miller – Tainter phương pháp Karber – Behrens 170 ± 9,95 mg/kg 167 mg/kg ± 9,62 mg/kg Kết kiểm nghiệm lô nguyên liệu theo dự thảo xây dựng đạt Kết luận: Dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus xây dựng thành công áp dụng để kiểm nghiệm lô nguyên liệu nọc bò cạp Dự thảo góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn ngun liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Việt Nam Từ khóa: Heterometrus laoticus, hetlaxin, LD50 nọc bò cạp, tiêu chuẩn kỹ thuật nọc bò cạp ABSTRACT CONTRIBUTION OF STANDARDIZATION OF SCORPION VENOM RAW MATERIAL (Venenum Heterometrus laoticus) Tran Thanh Mai, Hoang Ngoc Anh, Le Thi Thu Cuc, Hoang Thuy Linh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 346 - 352 Background - Objectives: Scorpion venom are widely used in traditional medicines Although there are a lot of studies on their composition and pharmacological properties including pain relief and anti-inflammation, scorpion venom has not been considered as raw material in Viet Nam because their specification has not been developed so far Therefore, this study was conducted with the aim of contribution of standardization of Heterometrus laoticus scorpion venom raw material Method: The subject of this study was scorpion venom Method: Three lots of scorpion venom raw materials *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh ***Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh ****Sở Y tế Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913799068 Email: diemnhim@yahoo.com 346 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học were standardized on appearance, solubility, loss on drying, pH, identification of total protein and hetlaxin, and LD50 determination Results: The draft specification of Heterometrus laoticus scorpion venom was established The total protein was identified by Biuret test, and hetlaxin by LC-ESI-MS Additionally, LD50 of the venom (SC) that was determined by Miller – Tainter and Karber – Behrens methods, was 170 ± 9.95 mg/kg and 167 mg/kg ± 9.62 mg/kg, respectively Results from quality control of three lots of the venom were conformed to the draft specification Conclusion: The draft specification of Heterometrus laoticus scorpion venom was successfully established and applied for quality control of three lots of the venom This specification has contributed to standardization of Vietnamese Heterometrus laoticus scorpion venom as local raw material Key words: Heterometrus laoticus, hetlaxin, LD50 of Heterometrus laoticus scorpion venom, specification of Heterometrus laoticus scorpion venom ĐẶT VẤN ĐỀ Trong y học cổ truyền, nọc bò cạp sử dụng rộng rãi với nhiều tác dụng, có tác dụng giảm đau, kháng viêm Mặc dù ứng dụng dân gian từ lâu có nhiều nghiên cứu thành phần(3), tác dụng dược lý(4), đến Việt Nam nọc bò cạp chưa dùng làm nguyên liệu y dược chưa tiêu chuẩn hóa Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu thực với mục tiêu góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Nọc bò cạp Heterometrus laoticus Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Nguyên vật liệu Nguyên liệu Ba lô nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, bảo quản -20oC Chất chuẩn Hetlaxin Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, bảo quản -20oC Albumin Sigma cung cấp, số lô 51K0126, hàm lượng > 98%, độ ẩm 0,2%, điều kiện bảo quản – 8oC Chuyên Đề Dược Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng 20 ± g, giống DDY Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Chuột ổn định ngày phòng thí nghiệm trước tiến hành nghiên cứu Hóa chất, dung mơi, thuốc thử Acid formic, acid hydrocloric, acid triflouroacetic, cloroform, ethyl acetat, natri hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích Thuốc thử Biuret Acetonitril methanol đạt tiêu chuẩn dùng sắc ký lỏng Trang thiết bị Hệ thống khối phổ MS/MS micrOTOF-QII (Bruker Daltonic), hệ thống UHPLC (Agilent), cân phân tích UXW 220 (Sartorius), máy ly tâm (Hermle), máy quang phổ UV – Vis (Hitachi), máy đo pH (Inolab), máy lắc rung (Labnet), máy phân tích nhiệt trọng lượng TGA/DSC (Mettler Toledo) Phương pháp nghiên cứu Việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus thực lô nguyên liệu Dựa vào giá trị thực nghiệm, xử lý thống kê, từ đề nghị mức chất lượng tiêu kiểm nghiệm Các tiêu tính chất, độ tan, pH tiến hành theo Dược điển Việt nam IV (DĐVN IV)(2), độ ẩm xác định phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) Do thành phần chủ yếu nọc bò cạp protein nên định tính 347 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 protein toàn phần phản ứng màu Lowry, Red Pyrogallol – Molybdat (RPM) Biuret Hetlaxin polypeptid mới, xác định cấu trúc nọc bò cạp Heterometrus laoticus Việt Nam phương pháp MALDIMS khảo sát tác dụng giảm đau(1) chất lựa chọn chất đánh dấu định tính phương pháp LC-ESI-MS Chỉ tiêu định lượng xây dựng dựa việc xác định LD50 nguyên liệu nọc bò cạp(5) Tiêu chuẩn kỹ thuật: Tính chất Dựa vào cảm quan, quan sát màu sắc mắt thường ánh sáng tự nhiên với lượng bột vừa đủ phân tán tờ giấy trắng mịn Mô tả trạng thái tạo thành sau lắc nọc bò cạp với nước Độ tan Tiến hành theo qui định chung DĐVN IV Độ ẩm Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng Cân mẫu nhiệt độ 50oC, gia nhiệt mẫu với tốc độ 10oC/phút 260oC để làm nước bay phân hủy mẫu Lưu lượng dòng khí nitơ suốt q trình thực 50,0 ml/phút Cân lượng bột nọc bò cạp khoảng - mg, cho vào dụng cụ chứa mẫu Tiến hành đo độ ẩm máy TGA pH Lấy 10 mg nguyên liệu, thêm 10 ml nước, siêu âm phút Tiến hành đo pH theo DĐVN IV (phụ lục 6.2) Định tính protein tồn phần phản ứng màu Tiến hành định tính protein nguyên liệu nọc bò cạp phản ứng màu Lowry, RMP Biuret Lập bảng so sánh để chọn phương pháp áp dụng theo tiêu chí tính đặc hiệu, độ nhạy 348 Định tính hetlaxin phương pháp LC-ESIMS Mẫu đối chiếu 3,0 mg hetlaxin/ml acid formic 5% Mẫu thử: 15 mg nguyên liệu/ml acid formic 5%, ly tâm 5.000 vòng/phút 10 phút Lấy dịch ly tâm, tiến hành sắc ký Điều kiện sắc ký - Pha tĩnh: cột Kromasil C18 (150 x 2,1 mm; 3,5 μm) - Nhiệt độ cột: 30oC - Pha động A: dung dịch acid trifluoroacetic (TFA) 0,01% B: Acetonitril (ACN) chứa TFA 0,01% Chương trình rửa giải gradient Thời gian (phút) 100 105 A (%) B (%) 95 95 50 5 50 95 Thời gian (phút) 110 111 150 A (%) B (%) 95 95 95 5 - Tốc độ dòng: 0,2 ml/ phút - Thể tích tiêm: 10 μl - Đầu dò MS: Kiểu tạo ion ESI, chế độ ion hóa dương; Áp suất phun sương 2,0 bar; Thế mao quản 4.500 V; Nhiệt khí làm khơ 200oC; Tốc độ khí làm khơ lít/phút; Quét phổ 50 – 3.000 m/z Yêu cầu Mẫu thử phải xuất pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu hetlaxin mẫu đối chiếu pic có giá trị m/z phù hợp với pic hetlaxin mẫu đối chiếu Xác định LD50 Chuột đạt tiêu chuẩn nghiên cứu chia thành lô, lơ con, tiêm da liều khoảng liều tối đa không gây chết (LD0) liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100) chia theo cấp số Quan sát chuột sau 24 Ghi nhận số lượng chuột sống, chết lô LD50 tính theo phương pháp Miller – Tainter Karber – Behrens Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Phương pháp Miller – Tainter Vẽ đường biễu diễn tỉ lệ % chuột chết theo liều giấy logarit Đọc kết LD50 theo giá trị m trục hồnh Tính sai số chuẩn: E 2S LD50 m.E 2N ' Trong 2S: liều gia tăng cần thiết để kết tăng probit N’: tổng số chuột dùng liều tương ứng với phân suất tử vong khoảng tăng probit LD50 D a.b n a: số trung bình chuột chết liều b: hiệu số liều n: số chuột dùng liều số chuột trung bình dùng liều KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tính chất Nguyên liệu có dạng bột vảy màu trắng Khi lắc với nước, phần tan nước tạo dung dịch keo, lắc tạo bọt Độ tan Nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus thực tế khơng tan HCl 0,5 M, acid formic 5%, methanol, ethyl acetat, cloroform; khó tan NaOH 1,5 M Độ ẩm Tiến hành lô, lô mẫu Kết trình bày bảng Bảng 1: Kết xác định độ ẩm ngun liệu nọc bò cạp Lơ 7,19% 4,01% Lô 7,61% 4,46% Lô 6,38% 3,95% TB SD Giới hạn tin cậy e (p < 0,05) Chuyên Đề Dược pH Tiến hành lô, lô mẫu, mẫu đo lần Kết trình bày bảng Bảng 2: Kết xác định pH nguyên liệu nọc bò cạp Mẫu TB SD RSD e (p < 0,05) Trong D: LD100 Mẫu Dựa vào kết khảo sát, mức chất lượng đề nghị cho tiêu độ ẩm từ 3,8 – 7,7% Phương pháp Karber – Behrens Trung bình 5,60% 1,65 1,74% Nghiên cứu Y học Lô 6,485 6,501 6,490 6,502 6,492 6,522 6,499 0,013 0,20% 0,014 Lô 6,518 6,538 6,540 6,570 6,544 6,537 6,541 0,017 0,26% 0,018 Lô 6,548 6,549 6,572 6,585 6,540 6,576 6,562 0,018 0,28% 0,019 Trung bình 6,534 0,031 0,47% 0,015 Dựa vào kết xác định pH lơ ngun liệu nọc bò cạp, mức chất lượng đề nghị cho tiêu pH nguyên liệu từ̀ 6,0 – 7,0 Định tính protein tồn phần phản ứng màu Tiến hành định tính ngun liệu nọc bò cạp lơ với thuốc thử Lowry, RPM, Biuret Quan sát màu quét phổ UV-Vis Bảng minh họa kết so sánh phương pháp Bảng 3: So sánh phản ứng tạo màu định tính protein Phản ứng Độ nhạy Cơ chế Biuret RPM Lowry mg/ml 50 µg/ml µg/ml 2+ Liên kết Nhuộm Cu + protein, acid peptid protein amin phân cực → Cu+ Tính chọn lọc Có Không Không Cách làm Đơn Đơn giản Phức tạp giản (hai giai đoạn) Phản ứng Lowry RPM có độ nhạy cao không chọn lọc phản ứng Biuret Phản ứng Biuret tạo phức màu tím với protein, phức có độ hấp thu cực đại λ = 545 nm Phản ứng thực đơn giản, có tính chọn lọc nên chọn để định tính protein tồn phần 349 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Định tính protein tồn phần lơ ngun liệu nọc bò cạp với thuốc thử Biuret Tiến hành thực phản ứng gồm ống: chuẩn (C), thử (T) trắng (Tr) Quan sát màu phản ứng (hình 1) Dùng mẫu trắng chỉnh độ hấp thu không, quét phổ từ 400 - 800 nm mẫu chuẩn mẫu thử C T Tr Hình 1: Phản ứng Biuret định tính protein Nhận xét: Mẫu chuẩn mẫu thử có màu giống Mẫu thử có hình dạng phổ bước sóng hấp thu cực đại 543 nm giống mẫu chuẩn Định tính hetlaxin phương pháp LCESI-MS Thời gian lưu hetlaxin mẫu đối chiếu lặp lại qua bốn lần sắc ký với giá trị RSD < 2% RSD thời gian lưu hetlaxin lơ ngun liệu 2,15% Sử dụng phân tích ANOVA để so sánh thời gian lưu hetlaxin mẫu đối chiếu mẫu thử Kết cho thấy thời gian lưu hetlaxin mẫu đối chiếu (17,8 phút) thời gian lưu trung bình hetlaxin lơ ngun liệu (17,4 phút) khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) So sánh thời gian lưu giá trị m/z có điện tích +4 +3 mẫu thử (hình 2, hình 3) mẫu đối chiếu (hình 4, hình 5), lơ ngun liệu nọc bò cạp có hetlaxin hetlaxin Hình 2: Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu nọc bò cạp Hình 3: Phổ MS hetlaxin (thời gian lưu 17,5 phút) mẫu nguyên liệu nọc bò cạp 350 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học Hình 4: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu hetlaxin (pic 1) Hình 5: Phổ MS mẫu đối chiếu hetlaxin (thời gian lưu 17,8 phút) mẫu đối chiếu Sắc ký đồ mẫu thử xuất Khảo sát tính đặc hiệu pic có thời gian lưu giá trị m/z tương Qui trình đạt tính đặc hiệu sắc ký đồ đương với pic hetlaxin mẫu đối chiếu (từ dung dịch pha mẫu (hình 6) pha động hình đến hình 5) (hình 7) khơng xuất pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu hetlaxin Hình 6: Sắc ký đồ dung môi pha mẫu Chuyên Đề Dược 351 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Hình 7: Sắc ký đồ pha động da tính theo phương pháp Miller – Tainter Xác định LD50 phương pháp Kerber – Behrens 170 ± Kết xác định LD50 lô nguyên liệu 9,95 mg/kg 167 ± 9,62 mg/kg(5) nọc bò cạp Heterometrus laoticus đường tiêm Bảng 4: Tóm tắt tiêu đề nghị dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Chỉ tiêu Tính chất Độ tan Mức chất lượng đề nghị Bột vảy màu trắng Khi lắc với nước, phần tan nước tạo dung dịch keo, lắc tạo bọt Thực tế không tan HCl 0,5 M, acid formic 5%, methanol, ethyl acetat cloroform; khó tan NaOH 1,5 M Độ ẩm 3,8% - 7,7% pH 6,0 – 7,0 Định tính protein tồn phần Phản ứng Biuret: dung dịch mẫu thử phải có màu tím, có bước sóng hấp thụ cực đại 545 ± nm Định tính hetlaxin Phương pháp LC-ESI-MS: Mẫu thử phải xuất pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu hetlaxin mẫu đối chiếu Phổ khối thời gian lưu pic có điện tích +3, +4 với m/z tương ứng 1225, 919 LD50 150 -190 mg/kg (SC) KẾT LUẬN Dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus xây dựng thành công áp dụng để kiểm nghiệm lơ ngun liệu nọc bò cạp Dự thảo góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO 352 Hoang AN, Vo HDM, Vo NP, Kseniya SK, Oksana VN, Alexey VF, Mikhail PK, Tatyana VA, Marina VS, Victor IT, Yuri NU (2014), “Vietnamese Heterometrus laoicus scorpion venom: Evidence for analgesic and anti-inflammatory activity and isolation of new polypeptide toxin acting on Kv1.3 Potassium chanel”, Toxicon, 77, 40-48 Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y Học, Hà Nội, tr PL-19, PL-138, PL-344-PL347 Hoàng Ngọc Anh, Phạm Nguyên Đông Yên, Nguyễn Thị Mai Hương, Trần Thanh Đức, Võ Phùng Nguyên (2010), “Khảo sát thành phần nọc bò cạp Heterometrus laoticus phân bố Tây Ninh so sánh với nọc bò cạp phân bố An Giang”, Tạp chí Hóa học, 48(4B), 285-289 Hồng Ngọc Anh, Phạm Ngun Đơng n, Nguyễn Thị Mai Hương, Võ Phùng Nguyên (2009), “Khảo sát chất có hoạt tính sinh học nọc bò cạp Heterometrus laoticus”, Tạp chí Hóa học, 47(2), 133-137 Nguyễn Phương Kh, Võ Phùng Ngun, Hồng Ngọc Anh (2008), “Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng giảm đau, kháng viêm nọc bò cạp đen Tây Ninh”, Tạp chí Dược Học, 389, 3134 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 30/10/2015 20/11/2015 20/02/2016 Chuyên Đề Dược ... thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus xây dựng thành công áp dụng để kiểm nghiệm lô nguyên liệu nọc bò cạp Dự thảo góp phần tiêu chuẩn hóa nguồn ngun liệu nọc bò cạp. .. định LD50 lô nguyên liệu 9,95 mg/kg 167 ± 9,62 mg/kg(5) nọc bò cạp Heterometrus laoticus đường tiêm Bảng 4: Tóm tắt tiêu đề nghị dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus. .. Việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu nọc bò cạp Heterometrus laoticus thực lô nguyên liệu Dựa vào giá trị thực nghiệm, xử lý thống kê, từ đề nghị mức chất lượng tiêu kiểm nghiệm Các tiêu