2.2.2.I Khảo sát các phản ứng hoá học:
2.2.3. Nghiên cứu khảo sát các phép thử tinh khiết.
Dược điển Việt Nam I qui định thử tinh khiết với 2 chỉ tiêu: giảm khối lượng do sấy khô và giới hạn tro Sulfat.
Ngày nay đòi hỏi về độ tinh khiết của chế phẩm ngày càng cao do đó tôi đề xuất cần thiềt phải khảo sát và bổ sung các chỉ tiêu sau:
- Độ trong, giới hạn acid, giới hạn Sulfat, giới hạn kim loại nặng, các tạp alcaloid liên quan.
Do giới hạn về thời gian và điều kiện tiến hành nên chúng tôi chưa có điều kiên để khảo sát các chỉ tiêu: Độ trong, giới hạn acid, giới hạn Sulfat, giới hạn kim loại nặng. Chúng tôi tập trung đi sâu vào khảo sát giới hạn các alcaloid khác. Việc khảo sát giới hạn các alcaloid liên quan của chế phẩm
được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi đã tìm được ở phần khảo sát các phép định tính.
Với chế phẩm Palmatin clorid chiết xuất từ dược liệu Hoàng Đằng các tạp chất alcaloid đáng lưu ý là Jatrorhizin clorid (khoảng 5%). Columbamin clorid (khoảng 0,5%) và Berberin clorid (khoảng 0,5-1%)
Theo kết quả của phần khảo sát phép định tính bằng sắc ký lớp mỏng có thể có phương pháp xác định giới hạn các tạp alcaloid liên quan như sau:
- Xác định giới hạn Berberin bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi: n-Butanol: Acid acetic bằng nước [ 7 : 1 : 2 ] .
- Xác định giới hạn Jatrorhizin và Columbamin bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1:2]. Với hệ dung môi này Columbamin và Jatrorhizin có Rf sấp xỉ nhau, hàm lượng Columbamin rất nhỏ so với Jatrorhizin, cấu trúc của chúng rất giống nhau do đó khảo sát giới hạn của Jatrorhizin có thể biểu thị cho cả hai alcaloid này.
a. Xác định hàm lượng giới hạn của các alcaloid. Jatrorhizin và Berberin.
* Xác định hàm lượng giới hạn của Jatrorhizin.
- Pha nồng độ dung dịch chế phẩm Palmatin clorid nồng độ 0,2% trong ethanol.
- Pha dung dịch Jatrorhizin clorid nồng độ lần lượt: 0,02%, 0,015%, 0,01%, 0,75% và 0,005%, trong ethanol.
- Chuẩn bị 5 bản sắc ký với bản mỏng Silicagel G254 tráng sẵn của hãng Merck, kích thước 5 X 12cm. Mỗi bản chất 2 vết:
+ Vết chấm 1: 3|il dung dịch chế phẩm
+ Vết chấm 2: 3ụl dung dịch Jatrorhizin clorid. Mỗi bản một nồng độ dung dịch.
- Chạy sắc ký với hệ dung môi: Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1:2] đến khi dung môi chạy độ 10cm.
Lấy các bản sắc ký ra quan sát và so sánh đậm độ của vết Jatrorhizin tách ra từ vết chấm 1 so với vết Jatrorhizin chuẩn. Sau đó hong khô. bản sắc kỷ, phun thuốc thử Dragendorff và so sánh đậm độ của các vết Jatrorhizin một lần nữa.
Kết quả:
Bản sắc ký Bản 1 Bản 2 Bản 3 Bản 4 Bản 5 Nồng độ dung dịch
Jatrorhizin clorid chuẩn (%)
0,02 0,015 0,01 0,0075 0,005 Nồng độ chế phẩm (%) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Tỉ lệ nồng độ các dung dịch Jatrorhizin chuẩn Chế phẩm 1/10 1/13,3 1/20 1/26,7 1/40 Kết quả: < < < > > Ghi chú:
<: Vết Jatrorhizin tách ra từ vết 1 không đậm màu hơn vết Jatrorhizin chuẩn. >: Vết Jatrorhizin tách ra từ vết 1 đậm màu hơn vết Jatrorhizin chuẩn. Từ kết quả trên chọn hàm lượng giới hạn của Jatrorhizin trong chế phẩm là 1/20 (5%).
* Xác định hàm lượng giới hạn của Berberin.
- Pha dung dịch chế phẩm Palmatin clorid nồng độ 0,2% trong ethanol. - Pha dung dịch Berberin clorid chuẩn các nồng độ: 0,004%, 0,002%, 0,0015%, 0,00 í % trong ethanol.
- Chuẩn bị 4 bản sắc ký với bản mỏng Silicagel-G254 tráng sẩn của hãng Merck, kích thước 5 X 12cm. Mỗi bản chấm 2 vết:
+ Vết chấm 1: 3 Jil dung dịch chế phẩm
+ Vết chấm 2: 3 |il dung dịch Berberin clorid chuẩn mỗi bản một nồng độ dung dịch.
- Chạy sắc ký với hệ dung môi: n-Butanol: Acid acetic băng: nước [7:1:2] đến khi dung môi chạy độ 10cm.
- Lấy bản sắc ký ra so sánh đậm độ màu các vết Berberin tách ra từ vết 1 và vết Berberin chuẩn. Sau đó hong khô bản sắc ký, phun thuốc thử Dragendorff và so sánh lại. Kết quả: Bản sắc ký Bản 1 Bản 2 Bản 3 Bản 4 Nồng độ dung dịch Berberin clorid chuẩn (%) 0,004 0,002 0,0015 0,001 Nồng độ chế phẩm (%) 0,2 0,2 0,2 0,2 Tỉ lệ nồng độ các dung dịch Berberin clorid chuẩn
Chế phẩm
1/50 1/100 1/133,3 1/200
Kết quả: < < < >
Ghi chứ:
<: Vết Berberin tách ra từ vết 1 không đậm màu hơn vết Berberin chuẩn. >: Vết Berberin tách ra từ vết 1 đậm màu hơn vết Berberin chuẩn.
Từ kết quả trên chọn hàm lượng giới hạn của Berberin clorid trong chế phẩm là 1/100(1%).
b. Xây dipĩg phương pháp:
Để thử giới hạn alcaloid khác trong chế phẩm Palmatin clorid bằng sắc ký lớp mỏng, cổ thể tiến hành theo các bước sau:
- Chuẩn bị bản sắc ký: Bản sắc ký Silicagel-G254 chế sẩn, kích thước 5xl2cm , sấy ở 110°c trong 1 giờ để hoạt hoá.
- Chuẩn bị các dung dịch:
+ Dung dịch thử: pha dung dịch 0,2% trong ethanol: cân chính xác 2mg chế phẩm Palmatin clorid hoà tan trong lm l ethanol.
+ Dung dịch đối chiếu: Pha dung dịch có nồng độ Jatrorhizin clorid là 0,01% và Berberin clorid là 0,002%: Cân chính xác lm g Jatrorhizin clorid chuẩn và 0,2mg Berberin clorid chuẩn hoà tan trong 10 ml ethanol.
- Phát hiện Jatrorhizin: chấm sắc ký lên bản mỏng 2 vết riêng biệt 3 Ịil mỗi dung dịch. Triển khai sắc ký với hệ dung môi Amoniac 10%: Ethanol tuyệt đối [1 : 2], đến độ cao lOcm thì lấy ra, để khô ngoài không khí, phun thuốc thử Dragendorff. Vết Jatrorhizin của dung dịch thử không được đậm màu hơn vết Jatrorhizin chuẩn (không quá 5%).
- Phát hiện Berberin: chấm sắc ký lên bản mỏng 2 vết riêng biệt 3 |il mỗi dung dịch. Triển khai sắc ký với hệ dung môi: n-Butanol : Acid acetic băng: nước [7:1:2] đến độ cao lOcm. Lấy bản sắc ký ra hong khô ngoài không khí, phun thuốc thử Dragendorff. Vết Berberin của dung dịch thử không được đậm màu hơn vết Berberin của dung dịch chuẩn (không quá 1%).