Nghiên cứu chiết xuất, đánh giá tính an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính trên thực nghiệm của glycosid toàn phần lá xoài tròn Yên Châu, Sơn La

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày với phát triển khoa học kỹ thuật, thuốc phòng điều trị bệnh ngày phong phú, bao gồm thuốc có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp Trong nguồn nguyên liệu tự nhiên nguồn quan trọng để nghiên cứu phát triển thuốc sản xuất công nghiệp dược thuốc có nguồn gốc thảo dược Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều, địa hình đa dạng thuận lợi cho sinh trưởng phát triển nhiều loại thuốc quý Cùng với kinh nghiệm dân gian sử dụng thuốc để phòng chữa bệnh, nhiều thuốc quý sử dụng công nghiệp dược làm thuốc Một tỉnh miền núi phía Bắc nước ta có đa dạng sinh học cao tỉnh Sơn La Sơn La tỉnh miền núi cao nằm phía tây bắc Việt Nam, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, mùa đông lạnh khô, mùa hè nóng ẩm, mưa nhiều Do địa hình bị chia cắt sâu mạnh nên hình thành nhiều tiểu vùng khí hậu, cho phép phát triển sản xuất nông - lâm nghiệp phong phú Vùng cao nguyên Mộc Châu phù hợp với trồng vật nuôi vùng ôn đới Vùng dọc sông Đà phù hợp với rừng nhiệt đới xanh quanh năm Trong tổng số diện tích đất sản xuất nông nghiệp (247.684 ha), diện tích trồng ăn chiếm gần 10% (24.016 ha) Trong đó, xoài tròn (Mangifera indica L.) đặc sản tỉnh Sơn La, trồng tập trung chủ yếu huyện Yên châu với diện tích chừng 500 hecta, hàng năm nhân dân thu hoạch quả, cành chặt tỉa hàng năm bị đốt bỏ Nhiều nghiên cứu cho biết xoài có nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, đặc biệt mangiferin, glycosid có tác dụng diệt virut, kháng viêm v.v Để tận dụng nguồn xoài làm nguyên liệu sản xuất thuốc, đồng thời tạo thu nhập góp phần xóa đói, giảm nghèo tỉnh vùng sâu, vùng xa, thực đề tài “ Nghiên cứu chiết xuất, đánh giá tính an toàn tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính thực nghiệm glycosid toàn phần xoài tròn Yên Châu, Sơn La”.Với ba mục tiêu chính: là: nghiên cứu xây dựng qui trình chiết xuất xây dựng tiêu chuẩn sở glycosid toàn phần xoài tròn, hai là: nghiên cứu xác định tính an toàn glycosid toàn phần xoài tròn, ba là: xác định tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính thực nghiệm glycosid xoài tròn MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI: Xây dựng qui trình chiết xuất tiêu chuẩn sở glycosid toàn phần xoài tròn Nghiên cứu xác định tính an toàn glycosid toàn phần xoài tròn Nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính thực nghiệm glycosid xoài tròn Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY XOÀI (Mangifera indica L) 1.1.1 Đặc điểm thực vật xoài chi Mangifera L 1.1.1.1 Vị trí, phân loại xoài chi Mangifera L Cây xoài có tên khoa học Mangifera indica L., thuộc họ đào lộn hột (Anacardiaceae) Theo hệ thống phân loại Takhatajan (1987, 2009) [6], [46], họ Đào lộn hột chi Mangifera L có vị trí sau : Ngành Ngọc lan (Mangiphylata) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên Cam (Rutanae) Bộ Cam (Rutales) Họ Đào lộn hột (Anacardiaceae Lindl 1830) Phân họ Anacardioideae (Anacardioideae) Chi Mangifera (Mangifera Linnaeus, 1753) 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố chi Mangifera L Đặc điểm hình thái chung chi Mangifera L.: Cây gỗ thường xanh, có kích thước lớn Lá đơn mọc so le, có cuống, phiến nguyên, dai Cụm hoa hình chùy cành Hoa nhỏ, mẫu hay mẫu 5, tiền khai hoa lợp Cánh hoa hàn liền gốc Cánh hoa có 1-5 sống bật nhị hoa rời dính liền với đĩa mật, thường có nhị lớn Đĩa mật tạo thành từ tuyến riêng biệt nhị Bầu nhẵn ô, noãn, vòi nhụy đỉnh bầu Quả có hột cứng, vỏ có xơ, vỏ dày, cứng, Hạt có đa phôi [28] Theo Koster mans Bompard 1993, chi Mangifera L gồm 69 loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới châu Á như: Ấn Độ, Miến Điện, Sri Lanka, Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia, Nam Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Philippin, quần đảo Solomon, vài loài quần đảo Thái Bình Dương (Hawai)… [37] Theo Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam có 12 loài thuộc chi Mangifera L [8] Tuy nhiên hai loài M camptosperma Pierre, M reba Pierre Kosterman Bompard (1993) xếp vào loài chung M gedebe Miq [37] Theo Võ Văn Chi Nguyễn Tiến Bân Việt Nam có 11 loài (bảng 1.1) gồm loài Phạm Hoàng Hộ mô tả trừ loài M cassia [1], [6] Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Mangifera L phân bố Việt Nam STT Loài Tên thường gọi M indica L Xoài M odorata Griff M cochinchinensis Engel M camptosperma Pierre M dongnaiense Pierre Xoài thơm M duperreana Pierre M reba Pierre M foetida Lour M flava Evr 10 Ma longipes Griff 11 M minutifolia Evr Xoài nụt Xoài bùi Xoài Đồng Nai Quéo Quéo Xoài hôi, muỗm, xoài cà lăm Xoài vàng Xoài núi, Xoài cọng dài Xoài rừng, xoài nhỏ Phân bố Trung Nam Miền Nam Bình Dương, Đồng Nai Bình phước, Bình Dương, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh Lâm Đồng, Đà Lạt, Bình Dương, Đồng Nai Lâm Đồng, Ninh Thuận, Tây Ninh, Bình Dương, Tp Hồ Chí Minh, Kiên Giang Đồng Nai Quảng Trị nhiều nơi khác Quảng Nam, Lâm Đồng, Ninh Thuận Hà Nam, Ninh Bình, Kon Tum, Bình Dương Khánh Hòa Theo tác giả dẫn địa lý Sơn La có số loài khác : xoài tròn hay gọi muồng kẻo (tên địa phương Sơn La), xoài hôi hay gọi muồng khíu (tên địa phương Sơn La), mắc chai (tên địa phương Sơn La), người dân địa phương trồng chủ yếu xoài tròn, cho đặc biệt thơm ngon Như giống xoài tròn không nhắc đến bảng phân loại tác giả (Đỗ Tất Lợi?) Cây cao 40 m, thông thường khoảng 10-15m, có tán lớn sống đến 100 năm Lá nguyên, mọc so le, đơn, thuôn dài, nhẵn, bóng, dài 15-30 cm, rộng 5-7 cm Hoa nhỏ, màu vàng nhạt, thành chùy đầu cành Quả hạch to, hạch dẹt, hình thận, cứng, có thớ sợi nẩy mầm mở Hột xoài có vỏ cứng, bên chứa tử điệp phôi mầm Các giống xoài Việt Nam thường đa phôi, có từ 2-12 phôi vô tính có từ phôi hữu tính Do vậy, hột xoài gieo cho từ 1-5 vô tính giữ nguyên đặc điểm di truyền từ mẹ Nếu có hữu tính mọc yếu ớt, dễ bị lấn át Rễ mọc sâu đến 9m vùng đất cao hay đồi núi, nơi vùng đất thấp rễ mọc đến mực thuỷ cấp Xoài trồng từ hột, sau 6-8 năm cho trái Xoài chịu đựng khoảng nhiệt độ từ 4oC – 46oC, nhiệt độ thích hợp để sinh trưởng phát triển tốt vào khoảng 24oC – 27oC Yên Châu huyện miền núi biên giới tỉnh Sơn La; nằm dọc trục quốc lộ 6, trung tâm huyện lị cách thị xã Sơn La 64 km, cách thủ đô Hà Nội 240 km; có 47 km đường biên giới với nước Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào Có toạ độ địa lí: 104º 10’ - 104º 40’ kinh đông; 21º 07’ - 21º 14’ vĩ độ bắc Do có khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đặc trưng nên thích hợp cho sinh trưởng phát triển tốt xoài 1.1.2 Thành phần hóa học chi Mangifera L Cho đến có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học loài thuộc chi Mangifera L Trong loài M indica L loài phổ biến nghiên cứu nhiều Thành phần hóa học đáng ý gồm có: Các hợp chất phenol acid benzoic, coumarin, flavonoid, xanthonoid, tinh dầu (monoterpen, sesquiterpen), steroid, triterpen vitamin Đặc biệt mangiferin, xanthon glycoside nghiên cứu nhiều thành phần có nhiều hoạt tính sinh học 1.1.2.1 Nhóm hợp chất phenol acid benzoic Các hợp chất thuộc nhóm gồm có: acid gallic [40], [43], dẫn chất : methyl galate, n-propylga late [43] Chúng chủ yếu tìm thấy hoa, vỏ thân loài thuộc chi Mangifera L Hình 1.1 Acid gallic dẫn chất phân lập từ chi Mangifera L Ngoài có dẫn chất acid benzoic acid 3,4-dihydroxy benzoic, propyl benzoate [43], 5-[2(Z)-heptadecyl] resorcinol [24], 5-(12Cisheptadecencyl) resorcinol 5-pentadecyl resorcinol tìm thấy vỏ thân xoài [26] 1.1.2.2 Coumarin Hai hợp chất thuộc nhóm coumarin tìm thấy vỏ thân, vỏ rễ loài M indica: acid ellagic (I) [40], mangcoumarin (II) [39] (I) (II) Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid ellagic (I) mangcoumarin (II) 1.1.2.3 Flavonoid Flavonoid thành phần hóa học chi Mangifera L., chúng tìm thấy lá, hạt Các flavonoid tìm thấy loài chi Mangifera L chủ yếu thuộc nhóm: Anthocyanidin:]7-O-methylcyanidin 3-O-β -D-galactopyranoside, 7-O- methylcyanidin [25]; Flavan-3-ol : catechin, epicatechin [43]; Flavonol có quercetin, [16], [30], quercetin 3-O- diglycosid, quercetin 3-O- galactosid, quercetin 3-O- glucoside, quercetin 3-O- xyloside, quercetin 3-Oarabinopyranoside, quercetin 3-O- arabinofuranosid, quercetin 3-O- rhamnoside, kemferol-3- glucoside [16], myrcetin [30]; Biflavon có: I-4’, II4’, I-5, I-5, I-7, II-7-hexahydroxy-[I-3’,II-8]-biflavon [34] Flavan-3-ol Biflavon Flavonol Anthocyanidin (paeonidin-3-galactoside) Hình 1.3 Một số chất thuộc nhóm flavonoid phân lập từ Mangifera L 1.1.2.4 Xanthon Đây nhóm hoạt chất loài thuộc chi Mangifera L Cấu trúc hóa học chung nhóm khung xanthon có gắn nhiều nhóm OH, nhóm OH thay liên kết O-glycosid C-glycosid với phân tử đường Các hợp chất thuộc nhóm gồm có: mangiferin [16], [30], [32], [33], homomangiferin [32]; euxanthon; 1,3,5,6,7-pentamethoxyxanthon; 1,3,6,7,8-penta hydroxyxanthon [30], mangiferin-6’-O-galate [16] Trong mangiferin hoạt chất có hàm lượng cao chất có nhiều tác dụng sinh học: kháng virut, đái tháo đường, chống viêm, điều hòa miễn dịch Công thức chung hợp chất xanthon Mangiferin Hình 1.4 Các hợp chất nhóm xanthon phân lập từ chi Mangifera L 1.1.2.5 Tinh dầu hợp chất thơm Các hợp chất monoterpen sesquitecpen thành phần tạo nên mùi thơm đặc trưng chi Mangifera L Các thành phần chủ yếu tìm thấy hoa, vỏ quả, số tìm thấy  Monoterpen Camphren ∆2-Caren ∆3-Caren β-Pinen β- Myrecen ρ-Cymene ρ-Geranial α-Pinen Carveol Linalol Hình 1.5 Một số hợp chất monoterpen có chi Mangifera L Các monoterpen tìm thấy loài chi chủ yếu thuộc nhóm dẫn chất không chứa oxy như: ∆2- ∆3-caren, camphren, limonen, β-myrecen, α- β-phellandren, α- β-pinen, β-ocimen, Cis-ocimen caryophylen, α-terpinolen, α- γ-terpinen, α-thujen,… Ngoài ra, có dẫn chất chứa oxy gồm có: p-cymen, carveol, ρ-linalol ,…[14], [38], [39], [44], [47] Theo nghiên cứu tinh dầu chiết xuất từ vỏ xoài M indica L Nigeria, cho thấy hàm lượng monoterpen cao (83,2%) thành phần chủ yếu là: ∆3-caren (58,2%), α-pinen (13,0%) [15]  Sesquiterpen Các hợp chất sesquiterpen tìm thấy chi Mangifera L hợp chất có cấu tạo hai vòng như: δ-cadinen, α-cubeben, β-caryophyllen, βbulnesen, β-elemene, γ-gurjunen, α-guainen, α-humulen, γ-murolene, β- selinen, valenecen,… ba vòng α-copaen [14], [38], [39], [47] δ-Cadinen α- Copaene β- Caryophyllen α- Guainen β-Bulnesen Cadalene Hình 1.6 Một số hợp chất sesquiterpen từ chi Mangifera L  Các hợp chất khác Trong thành phần tinh dầu xoài có hợp chất khác như: acetaldehyde, 2-hexenal, nonanal, 2-nonenal, ethyl butanolate, hexenol, methyl hexanooate, methyl beoate, [14, [39], [44], [47] 1.1.2.6 Triterpen Cho đến tìm thấy khoảng 60 hợp chất triterpen từ loài thuộc chi Mangifera L bao gồm triterpen pentacyclic triterpen tetracyclic Các hơp chất triterpen pentacyclic gồm có nhóm như: olean, ursan, [17], 10 [20], [22], [36], fridelan [17], [18], [22], [29], [30]; lupan [19], [35], [36]; hopan [31]; taraxastan [20], [21], [22], [23] cycloartan [17], [18], [19], [20], [21], [22], [27] Trong nhóm cycloartan chiếm số lượng lớn Công thức chung nhóm bao gồm khung cycloartan với nối đôi vị trí khác (vị trí C số 23, 24, 25) mạch nhánh, nhóm gồm có: nhóm OH O gắn vào vị trí C số 3, nhóm OH gắn vào vị trí 22, 24, 25; nguyên tử carbon số 26, 27 bị oxy hóa thành COOH CHO, CH2OH Các hợp chất chủ yếu tìm thấy vỏ Acid hydroxy mangiferolic 3β,24,25-Triol-cycloartane Hình 1.7 Cấu trúc số dẫn chất cycloartan phân lập từ chi Mangifera L Anjaneyulu cộng phân lập hai hợp chất teriterpen tetracyclic nhóm damaran 3β,20(S)-diol-dermar-24-en (III) [17] [19] 3oxo-dammar-24-en-20S,26a-diol (IV) [20] từ số thứ loài M indica L Ấn Độ R1 R2 (III) -OH CH3 (IV) =O CH2-OH Hình 1.8 Các hợp chất triterpenoid tetracyclic nhóm damaran phân lập từ M indica L 101 Bàn luận:  Mô hình gây viêm cấp: Trên mô hình gây phù chân chuột cống, kháng nguyên sử dụng carrageenin, có chất polysaccharid gần giống với cấu trúc vỏ vi khuẩn, đáp ứng miễn dịch thể chủ yếu đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu với tham gia chủ yếu đại thực bào, bạch cầu múi trung tính [1] Biểu trình viêm giãn mạch, bạch cầu xuyên mạch, tăng tiết chất trung gian hoá học prostaglandin, histamin, leucotrien [1], biểu quan sát thấy chủ yếu triệu chứng phù Trên mô hình gây tràn dịch màng bụng việc dùng kháng nguyên carrageenin dùng thêm formaldehyd nồng độ thấp Vì mô hình khởi động trình viêm cấp màng bụng, chất trình đáp ứng tế bào miễn dịch bạch cầu múi trung tính có mặt formaldehyd nên triệu chứng chủ yếu tăng tiết dịch vị trí gây viêm Aspirin thuốc chống viêm nhóm steroid, tác dụng chủ yếu chống viêm cấp nên chọn làm thuốc chứng dương mô hình viêm cấp [2] Cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 liều có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt, tác dụng tương đương có xu hướng tốt aspirin liều 200 mg/kg  Mô hình gây viêm mạn tính : Các kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức (như mô hình gây viêm mạn, kháng nguyên amiant) lympho bào B cần có hỗ trợ cytokin (IL - 4, 5, 6, 10) tế bào T h (T hỗ trợ) hoạt hoá tiết sản xuất kháng thể Mặt khác kháng nguyên amiant khởi động trình đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào phương thức miễn dịch thứ hai bên cạnh đáp ứng miễn dịch dịch thể nhằm loại trừ kháng nguyên lạ, lympho bào T phụ trách [2] Prednisolon thuốc chống viêm steroid 102 kinh điển, tác dụng chủ yếu chống viêm mạn tính ức chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào lympho bào T đảm nhận nên dùng làm thuốc chứng dương mô hình gây viêm mạn tính [2] Cao lỏng xoài tròn Yên châu 4:1 thể tác dụng chống viêm mạn tính rõ rệt Quá trình viêm mạn tính chủ yếu thông qua đáp ứng lympho bào T Đây tác dụng dược lý có ý nghĩa dùng thuốc bệnh lý viêm mạn tính Các kết nghiên cứu giới cho thấy dịch chiết xoài tròn có tác dụng chống viêm rõ rệt [ 3] Kết luận: Tác dụng chống viêm cấp: Cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 liều 8g, 16g 32g dược liệu/kg/ngày uống ngày liên tục thể tác dụng chống viêm cấp mô hình viêm cấp thực nghiệm, tác dụng tương đương aspirin liều 200 mg/kg Tác dụng chống viêm mạn tính: Cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 liều 6g, 12g 24g dược liệu/kg/ngày uống 10 ngày liên tục thể tác dụng chống viêm mạn tính mô hình viêm mạn tính gây u hạt thực nghiệm chuột nhắt trắng Tác dụng chống viêm mạn tính tương đương methylprednisolon liều 8mg/kg 103 CHƯƠNG BÀN LUẬN 104 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ I KẾT LUẬN - Kết giám định mẫu xoài tròn Yên Châu, Sơn La (HNIP/1782/13) loài: Mangifera indica L, họ Anacardiaceae Ngoài 11 loài Phạm Văn Hộ, kết làm phong phú sở liệu loài xoài Việt Nam Mặc dù hình dạng xoài tròn Yên Châu tròn ngắn so với mô tả tài liệu Cây cỏ Việt Nam nhiên việc xác định tên khoa học chủ yếu dựa cấu tạo hoa xoài - Về trữ lượng nguyên liệu: tổng số đất trồng xoài huyện Yên Châu 500 ha, người dân trồng chủ yếu giống xoài tròn (muồng kẻo), chiếm 60-65% diện tích vườn xoài, chiếm ≥ 60% vườn xoài trồng từ năm trở lên Ước tính toàn huyện Yên Châu cung cấp 119,8 ngàn xoài tròn tươi/năm Như đáp ứng ổn định đầu vào cho sản xuất thuốc thành phẩm tươg lai - Định tính nhóm chất hữu phản ứng hóa học cho thấy xoài tròn có nhóm hợp chất sau: flavonoid, tanin, đường khử, steroidtriterpenoid, carotenoid Kết tương đương với số nghiên cứu nước khác vỏ thân, rễ xoài - Định tính mangiferin sắc kí lớp mỏng cho thấy xoài tròn có mangiferin, thể sắc kí đồ dịch chiết xoài tròn khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1] có vết có vết có R f màu sắc tương đương với vết mangiferin chuẩn - Sau có kết định tính mangiferin, tiến hành định lượng đồng thời khảo sát nồng độ mangiferin dung môi ethanol nồng độ khác mẫu xoài non, bành tẻ, già để xác định hàm lượng mangiferin, nhằm xây dựng tiêu chuẩn sở xoài tròn làm nguyên liệu Sau chuẩn bị mẫu dung dịch M 1, M2, M3 mẫu dịch chiết xoài già với dung môi ethanol nồng độ 90 o,70o, 50o , mẫu thu 105 tiến hành định lượng phương pháp HPLC điều kiện xây dựng đường chuẩn Kết mẫu M1 (chiết với dung môi ethanol 90o ) thu 5,32% mangiferin; mẫu M2 (chiết với dung môi ethanol 70 o ) thu 6,47% mangiferin; mẫu M3 (chiết với dung môi ethanol 50 o ) thu 6,33% mangiferin Như vậy, dung môi ethanol 70 o dung môi chiết tốt nồng độ ethanol khảo sát Tiếp theo với dung dịch M M5 theo thứ tự mẫu dịch chiết xoài bánh tẻ xoài non với dung môi EtOH 70o theo qui trình chiết xuất chiết xuất mẫu M1, M2, M3 Các mẫu thu đem phân tích HPLC điều kiện xây dựng đường chuẩn, kết hàm lượng mangiferin mẫu M4 7,39% mẫu M5 6,78% Như vậy, tất mẫu xoài có hàm lượng mangiferin cao (6-7%) Trong hàm lượnng mangiferin bánh tẻ cao (7,39%), tiếp đến non (6,78%), già có hàm lượng mangiferin thấp (6,47%) - Từ kết nghiên cứu định tính, định lượng xoài trên, đề xuất tiêu chuẩn sở xoài tròn nguyên liệu sau: - Đề xuất qui trình chiết xuất cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 (glycosid toàn phần dạng cao lỏng) Dựa kết khảo sát hàm lượng mangiferin mẫu xoài, kết xác định dung môi chiết xuất cho hàm lượng hoạt chất cao ethanol 70o qui trình chiết xuất qui định Dược điển Việt Nam III, đề xuất qui trình chiết xuất cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 (glycosid toàn phần dạng cao lỏng) sau: Bước 1: Cân 1.000 g xoài già sấy khô, nghiền nhỏ (độ ẩm 9,87%) cho vào bình chiết ngấm kiệt với L ethanol 70o, 24h Bước 2: Rút dịch chiết lần 1, tiếp tục cho dung môi EtOH 70oC, ngấm kiệt 24 h, rút dịch chiết lần làm tương tự lần 106 Bước 3: Gộp dịch chiết lần, cất thu hồi dung môi áp suất giảm, ½ thể tích Để nhiệt độ phòng qua đêm cho clorophyl tạp tủa xuống Bước 4: Lọc bỏ tạp Cất thu hồi dung môi hết EtOH thu cao lỏng tỷ lệ 4:1 - Về kết định lượng mangifrin có cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 với phương pháp phân tích HPLC, lượng mangiferin cao lỏng 4:1 xác định không thấp 10%.Cho thấy lượng mangiferin xoài tròn Yên Châu cao, tương đương với kết nghiên cứu …Tuy nhiên để có kết xác cần phải nghiên cứu nhiều mẫu cao lỏng 4:1 khác - Đề xuất tiêu chuẩn sở cao lỏng LXT Yên Châu 4:1, theo qui trình chiết xuất TS Quyên, cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 glycosid toàn phần xoài tròn Yên Châu, chiết xuất theo qui trình trình bày Khi xây dựng đề cương dự định để glycosid toàn phần dạng tinh chất khô, nhiên nghiên cứu nhận thấy để dạng khô nguyên vật liệu tốn kém, qui trình chiết xuất bảo quản, sử dụng …đều phức tạp tốn hơn, Khi để dạng cao lỏng nhiều ưu điểm như: qui trình dễ làm, đỡ tốn kém, dễ bảo quản, dễ sử dụng Qua nghiên , tiêu chuẩn sở cao lỏng xoài tròn 4:1 đề xuất sau: - Về kết nghiên cứu tính an toàn cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1: Cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 dùng đường uống chưa thể độc tính cấp chuột nhắt trắng theo đường uống liều tương ứng 490,10g dược liệu/kg gấp 81 lần liều dự kiến người (tính hệ số ngoại suy chuột nhắt 10) 107 Chương III NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Để thực mục tiêu trên, tiến hành nghiên cứu nội dung sau: Nghiên cứu thực vật 1.1 Khảo sát trữ lượng nguyên liệu 1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học xoài tròn Yên Châu, Sơn La 1.3 Nghiên cứu vi phẫu o Đặc điểm vi phẫu xoài tròn Yên Châu o Đặc điểm vi phẫu bột xoài tròn Nghiên cứu hóa học: 2.1 Nghiên cứu đặc điểm hóa học xoài tròn o Định tính nhóm chất hữu phản ứng hóa học o Định tính mangiferin sắc kí lớp mỏng o Định lượng mangiferin phương pháp HPLC o Khảo sát hàm lượng mangiferin xoài phương pháp HPLC o Chiết xuất, phân lập mangiferin LXT Yên Châu o Xác định đặc điểm tiêu chuẩn sở khác o Nghiên cứu, đề xuất qui trình chiết xuất glycosid toàn phần LXT Yên Châu (cao lỏng 4:1LXT Yên Châu ) 2.2 Nghiên cứu đặc điểm hóa học cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 o Định lượng mangifrin có cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 phương pháp HPLC o Đề xuất tiêu chuẩn sở cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 Nghiên cứu tác dụng sinh học cao lỏng xoài tròn Yên Châu 3.1 Nghiên cứu tính an toàn cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 o Độc tính cấp cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 o Độc tính bán trường diễn cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 3.2 Nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm phế quản mãn tính cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 o Tác dụng kháng khuẩn cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 o Tác dụng chống viêm cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 108 o o o o Tác dụng giãn phế quản cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 Tác dụng giảm ho cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 Tác dụng long đờm cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 Tác dụng lên hệ miễn dịch cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY XOÀI (Mangifera indica L) 1.1.1 Đặc điểm thực vật xoài chi Mangifera L .3 1.1.2 Thành phần hóa học chi Mangifera L 1.1.3 Tình hình nghiên cứu nước xoài 11 1.1.4.Tổng quan bệnh viêm phế quản mãn tính 16 1.1.5 Tính cấp thiết thực tiễn đề tài .22 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị: 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 27 2.2.2 Các nghiên cứu hóa học 28 Đề xuất tiêu chuẩn sở nguyên liệu xoài tròn .34 Nghiên cứu qui trình chiết xuất glycosid toàn phần dạng cao lỏng 34 Nghiên cứu đặc điểm hóa học glycosid toàn phần dạng cao lỏng .34 Đề xuất tiêu chuẩn sở glycosid toàn phần dạng cao lỏng (cao lỏng LXT Yên Châu 4:1) 35 Nghiên cứu tính an toàn cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 .35 KẾT QUẢ VÀ NGHIÊN CỨU 41 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THỰC VẬT 41 3.1.1 Trữ lượng xoài tròn làm nguyên liệu 41 3.1.2 Đặc điểm hình thái, tên khoa học xoài tròn Yên Châu .43 3.1.3 Đặc điểm vi phẫu xoài tròn Yên Châu, Sơn La 45 3.1.4 Đặc điểm vi phẫu bột xoài tròn 47 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HÓA HỌC 48 3.2.1 Đặc điểm hóa học xoài tròn 48 3.2.2 Đặc điểm hóa học cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 (glycosid toàn phần dạng cao lỏng) 63 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO LỎNG LÁ XOÀI TRÒN YÊN CHÂU 4:1 (GLYCOSID TOÀN PHẦN LÁ XOÀI TRÒN YÊN CHÂU) 66 3.3.1 Nghiên cứu độc tính cấp 66 3.3.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn .67 3.3.3 Kết nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 88 BÀN LUẬN .103 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 104 Chương III 107 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Mangifera L phân bố Việt Nam Bảng 3.1 Kết khảo sát số xoài tròn huyện Yên Châu, 2012 41 Bảng 3.2 Kết khảo sát trữ lượng xoài tròn huyện Yên Châu, 2012 41 Bảng 3.3 Các vết (Rf, màu sắc) sắc kí đồ dịch chiết xoài tròn khai triển với hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1] 54 Bảng 3.4 Diện tích pic (S) dãy dung dịch chuẩn nồng độ khác 56 Bảng 3.5 Kết định lượng mangiferin xoài tròn chiết dung môi EtOH nồng độ 90o, 70o 50o .57 Bảng 3.6 Kết định lượng mangiferin mẫu M4, M5 57 Bảng 3.7 Giá trị Rf màu sắc vết sắc kí đồ chất M mangiferin chuẩn điều kiện khác .60 Bảng 3.8 Phổ 1H, 13C-NMR M mangiferin 61 Bảng 3.9 Kết hàm ẩm xoài tròn .62 Bảng 3.10 Tỷ lệ tro toàn phần xoài tròn 62 Bảng 3.11 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến thể trọng thỏ .68 Bảng 3.12 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến số lượng hồng cầu máu thỏ 70 Bảng 3.13 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến hàm lượng huyết sắc tố máu thỏ .70 Bảng 3.14 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến hematocrit máu thỏ 70 Bảng 3.15 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến thể tích trung bình hồng cầu máu thỏ .71 Bảng 3.16 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến số lượng bạch cầu máu thỏ 71 Bảng 3.17 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến công thức bạch cầu máu thỏ 72 Bảng 3.18 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 đến số lượng tiểu cầu máu thỏ 72 Bảng 3.19 Ảnh hưởng cao lỏnglá xoài Yên Châu 4:1 đến hoạt độ AST (GOT) máu thỏ 74 Bảng 3.20 Ảnh hưởng cao lỏnglá xoài Yên Châu 4:1 đến hoạt độ ALT (GPT) máu thỏ 74 Bảng 3.21 Ảnh hưởng cao lỏnglá xoài Yên Châu 4:1 đến nồng độ bilirubin toàn phần máu thỏ 74 Bảng 3.22 Ảnh hưởng cao lỏnglá xoài Yên Châu 4:1 đến nồng độ protein máu thỏ 75 Bảng 3.23 Ảnh hưởng cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 đến nồng độ cholesterol máu thỏ 75 Bảng 3.24 Ảnh hưởng cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 đến nồng độ creatinin máu thỏ .77 Bảng 3.25 Xác định tỷ lệ pha loãng cao lỏng xoài Yên châu 4:1 có khả ức chế phát triển vi khuẩn 89 Bảng 3.26 Xác định tỷ lệ pha loãng cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 có khả ức chế phát triển nấm 93 Bảng 3.27 Tác dụng chống viêm cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 mô hình gây phù chân chuột cống trắng 97 Bảng 3.28 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên châu 4:1 lên thể tích dịch rỉ viêm 97 Bảng 3.29 Ảnh hưởng cao lỏng xoài tròn Yên châu 4:1 lên số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm 98 Bảng 3.31 Tác dụng cao lỏng xoài tròn Yên Châu 4:1 lên trọng lượng u hạt 100 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Acid gallic dẫn chất phân lập từ chi Mangifera L Hình 1.2 Công thức cấu tạo acid ellagic (I) mangcoumarin (II) Hình 1.3 Một số chất thuộc nhóm flavonoid phân lập từ Mangifera L .7 Hình 1.4 Các hợp chất nhóm xanthon phân lập từ chi Mangifera L Hình 1.5 Một số hợp chất monoterpen có chi Mangifera L .8 Hình 1.6 Một số hợp chất sesquiterpen từ chi Mangifera L Hình 1.7 Cấu trúc số dẫn chất cycloartan phân lập từ chi Mangifera L 10 Hình 1.8 Các hợp chất triterpenoid tetracyclic nhóm damaran phân lập từ M indica L 10 Hình 1.9 Khung pregnan, pregnenolon, progesteron 11 Hình 1.10 Khung stigmastan số dẫn chất stigmastan xoài 11 Hình 3.1 Hình ảnh hoa xoài tròn Yên Châu, Sơn La .44 Hình 3.2 Vi phẫu gân phiến xoài tròn .46 gân xoài tròn 46 Hình 3.4 Vi phẫu phiến xoài tròn 46 Hình 3.5 Các đặc điểm bột xoài tròn 47 Hình 3.6 Sắc kí đồ dịch chiết xoài khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1] 55 Hình 3.7 Đồ thị đường chuẩn mangiferin 56 Hình 3.8 Hình ảnh sắc kí đồ dịch chiết dược liệu dung môi EtOH ba nồng độ 50o,70o, 90o, khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH- H2O [10:1,5:1] 58 Hình 3.9 Hình ảnh sắc kí đồ chất M so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ dung môi Et2 O- HCOOH-H2O [2:0,3:0,2] .60 Hình 3.10 Tinh thể chất M 60 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường 81 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường .81 DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1: Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng (thỏ số 141) (HE x 400) 78 Ảnh 3.2: Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng (thỏ số 142) (HE x 400) 79 Tế bào gan bình thường 79 Ảnh 3.3: Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng (thỏ số 143) (HE x 400) 79 Tế bào gan bình thường 79 Ảnh 3.4: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 121) .80 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) 80 Tế bào gan bình thường 80 Ảnh 3.5: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 122) 80 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) 80 Tế bào gan bình thường 80 Ảnh 3.6: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 123) 81 Ảnh 3.7: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 131) .81 Ảnh 3.8: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 133) .82 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường 82 Ảnh 3.9: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị (thỏ số 134) 82 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Tế bào gan bình thường 82 Ảnh 3.10: Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng (thỏ số 141) (HE x 400) .83 Thận bình thường .83 Ảnh 3.11: Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng (thỏ số 142) (HE x 400) .83 Thận bình thường .83 Ảnh 3.12: Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng (thỏ số 143) (HE x 400) .84 Thận bình thường .84 Ảnh 3.13: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 121) 84 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 84 Ảnh 3.14: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 122) .85 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 85 Ảnh 3.15: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 123) .85 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 85 Ảnh 3.16: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 131) 86 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 86 Ảnh 3.17 : Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 133) 86 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 86 Ảnh 3.18: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị (thỏ số 134) .87 sau tuần uống thuốc thử (HE x 400) Thận bình thường 87 Ảnh 3.19 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/16 lên phát triển vi khuẩn E coli: đạt MIC 90 Ảnh 3.20 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/16 lên phát triển vi khuẩn E faecalis: đạt MIC 90 Ảnh 3.21 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/16 lên phát triển vi khuẩn P aeruginosa đạt MIC 91 Ảnh 3.22 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/16 lên phát triển vi khuẩn S aureus đạt MIC 91 Ảnh 3.23 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/16 lên phát triển vi khuẩn S pneumoniae đạt MIC .92 Ảnh 3.25 Hình ảnh phát triển bình thường nấm men C.albican môi trường nước muối sinh lý 93 Ảnh 3.26 Hình ảnh phát triển bình thường nấm men C.albican môi trường nước muối sinh lý 94 Ảnh 3.27 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/1 lên phát triển nấm men C.albican: đạt MIC .94 Ảnh 3.28 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha 1/1 loãng lên phát triển nấm men C.albican: đạt MIC .95 Ảnh 3.29 Hình ảnh cao lỏng xoài Yên Châu 4:1 tỷ lệ pha loãng 1/2 lên phát triển nấm men C.albican: không xác định MIC .95 [...]... của dược liệu Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của glycosid toàn phần dạng cao lỏng (cao lỏng LXT Yên Châu 4:1) Đề xuất TCCS của cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 dựa trên kết quả nghiên cứu đặc điểm hóa học, hàm lượng mangiferin của cao lỏng lá xoài 2.2.2.2 Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1  Nghiên cứu tính an toàn của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1 Nghiên cứu độc tính cấp Nghiên. .. cho thấy dịch chiết của cây xoài có thể có tác dụng tốt đối với các bệnh 16 về hô hấp mãn tính như viêm phế quản, hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính [6], [11], [13], [14] trên cơ sở đó chúng tôi hướng tới lựa chọn nghiên cứu tác dụng của glycosid lá xoài tròn đối với điều trị các triệu chứng của bệnh viêm phế quản mãn tính (VPQMT), một căn bệnh gây tử vong cao và đang ngày càng gia tăng, hy... tôi lựa chọn nghiên cứu chất glycosid từ lá xoài tròn, là một nguyên liệu sẵn có tại huyện Yên Châu, tỉnh Sơn la, từ lâu vẫn bỏ đi, để tiến hành nghiên cứu trên thực nghiệm các tác dụng dược lý cũng như tính an toàn của nó trong hỗ trợ điều trị bệnh COPD, một căn bệnh chiếm tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong khá cao trong dân số, đặc biệt ở người già COPD là căn bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong đang ngày càng... DNA Nghiên cứu này là cơ sở để giải thích một số hoạt tính sinh học của dung dịch nước chiết xuất từ cây M indica (Vimang) Rivera D G và cs [30] nghiên cứu tác dụng của Vimang và mangiferin, C-glucosylxanthone được phân lập từ dịch chiết của cây xoài tròn đến các thông số khác nhau của phản ứng dị ứng thấy Vimang và mangiferin có tác dụng ức chế sự sản xuất IgE và phản ứng phản vệ ở chuột, làm giảm tính. .. phân tích đặc điểm thực vật kết hợp với các tài liệu để xác định tên khoa học của cây xoài tròn Yên Châu, Sơn La 2.2.1.3 Nghiên cứu vi phẫu:  Lá xoài tròn 28 Tiêu bản vi phẫu lá và cuống lá được làm theo phương pháp cắt tẩy và nhuộm kép Tiêu bản được chụp trên kính hiển vi Các đặc điểm giải phẫu lá và cuống lá được phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [5]  Bột lá xoài tròn Dược liệu... có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, giảm đau và điều hòa miễn dịch [14], [22], [23], [24], [25], [32], [33], [34] Makare N và cs [27] đã chiết suất bằng cồn từ vỏ gốc của cây xoài tròn (Mangifera indica Linn) được dịch chiết chứa 2,6% mangiferin và đánh giá tác dụng lên hệ thống miễn dịch trung gian tế bào và miễn dịch dịch thể của chuột Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết có tác dụng. .. tế các nước và người bệnh phải chịu gánh nặng chi phí điều trị rất lớn Việc nghiên cứu ứng dụng hoạt chất Glycosid lá xoài vào hỗ trợ điều trị bệnh COPD tại thời điểm hiện nay có ý nghĩa thực tiễn cao, vì sẽ có thêm một thuốc YHCT mới, có thể ít tác dụng phụ và có nhiều tác dụng như: chống viêm, chống virus, giảm ho, điều hòa miễn dịch, giảm co thắt phế quản , mặt khác, do là thuốc có nguyên liệu dồi... nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao lỏng lá xoài tròn: Sử dụng một số chủng vi sinh vật như: các chủng vi khuẩn: S aureus, Enterococci, E coli, P aeruginosa, Streptococcus pneumonia, Streptococcus tan máu β; chủng nấm: C albicans,  Với nghiên cứu tác dụng giảm ho  Với nghiên cứu tác dụng giãn phế quản  Với nghiên cứu tác dụng lên chức năng miễn dịch 2.1.2.2 Hóa chất, thiết bị khác:  Nghiên. .. khô để nghiên cứu đặc điểm hình thái  Nghiên cứu hóa học: Các mẫu lá cây xoài tròn huyện Yên Châu, tỉnh Sơn La sau khi thu hái được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 oC, nghiền thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, ở nơi khô ráo  Nghiên cứu tác dụng sinh học: Glycosid toàn phần lá xoài tròn Yên Châu ở dạng cao lỏng tỷ lệ 4:1 (4 25 gam dược liệu trong 1 ml) (còn gọi là cao lỏng LXT Yên Châu... 4:1) Qui trình chiết xuất được thực hiện tại Bộ môn Dược liệu, trường đại học Dược Hà Nội Thuốc thử đạt tiêu chuẩn cơ sở (có qui trình riêng do TS.Đỗ Quyên xây dựng)  Động vật thí nghiệm:  Với nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của cao lỏng lá xoài tròn và đánh giá tác dụng chống viêm của cao lỏng lá xoài tròn: Sử dụng: chuột cống trắng cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 120 ± 20g của Học viện ... galactosid, quercetin 3-O- glucoside, quercetin 3-O- xyloside, quercetin 3-Oarabinopyranoside, quercetin 3-O- arabinofuranosid, quercetin 3-O- rhamnoside, kemferol -3- glucoside [16], myrcetin [30];... Anthocyanidin:]7-O-methylcyanidin 3-O- -D-galactopyranoside, 7-O- methylcyanidin [25]; Flavan-3-ol : catechin, epicatechin [43]; Flavonol cú quercetin, [16], [30], quercetin 3-O- diglycosid, quercetin 3-O- galactosid,... chng vi khun cn th Kim tra cỏc a thch mỏu xem s mc ca vi khun/nm: t a chng, vi khun/nm mc tt v tt c cỏc a vi khun/nm mc thun nht, ú mi tỡm nng c ch ti thiu: l nng m tng ng ti ú vi khun khụng