3.2.1. Đặc điểm hóa học của lá xoài tròn
3.2.1.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ
Định tính bằng phản ứng hóa học Flavonoid:
Cân 0,5g dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 15ml cồn 90o đun trực tiếp 10 phút. Lọc nóng qua bông dịch lọc thu được dùng để làm các phản ứng.
- Phản ứng với NH4OH
Nhỏ một 2 giọt dịch chiết cồn lên 2 tờ giấy lọc, sấy khô, đem một tờ giấy lọc hơ trên miệng lọ NH4OH đặc thấy màu vàng của vết dịch chiết đậm
và sáng hơn hẳn so với vết dịch chiết trên tờ giấy lọc còn lại. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với NaOH 10%:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm 3 giọt NaOH 10%, thấy xuất hiện nhiều tủa vàng. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng Cyanidyn
Cho vào ống nghiệm khoảng 1ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại, sau đó nhỏ vài giọt HCl đặc, thấy xuất hiện màu đỏ. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, nhỏ 2 giọt FeCl3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen. (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn có flavonoid.
Coumarin
Cân 10g dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml cồn 90, đun trực tiếp 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu được dùng để làm phản ứng.
- Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết. Thêm vào ống 1 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên. Sau khi thêm kiềm, ống 1 xuất hiện tủa vàng.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi. Để nguội. Ống 1 có tủa vàng. Ống 2 trong Thêm vào cả hai ống mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều. Ống 1 có tủa đục. Ống 2 trong suốt.
Acid hóa ống 1 bằng 5-6 giọt HCl đặc, ống 1 vẫn có tủa đục, ống 2 trong suốt. (Phản ứng âm tính).
Phản ứng Diazo hóa:
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều, đun nóng cách thủy, thấy xuất hiện màu đỏ. (Phản ứng dương tính).
Phản ứng huỳnh quang:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, sấy khô, nhỏ một giọt NaOH 10% chồng lên trên, sấy khô. Che một phần vết bằng một đồng xu kim loại, đặt dưới ánh sáng UV 366nm. Phần không bị che phát quang màu vàng xanh. Sau 1 phút, bỏ đồng xu kim loại ra thấy phần bị che và phần bị che phát quang giống nhau. (Phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa:
Cho một ít dược liệu vào nắp nhôm. Đặt lên bếp hồng ngoại, cho bay hơi hết hơi nước trong dược liệu. Đặt lên nắp nhôm một phiến kính, trên phiến kính để một ít bông tẩm nước lạnh, sau 5phút lấy phiến kính ra để nguội, nhỏ thêm một giọt thuốc thử KI 10% lên phiến kính. Soi dưới kính hiển vi không thấy có tinh thể. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có coumarin.
Saponin
Hiện tượng tạo bọt: Cân 10g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml nước, đun sôi trực tiếp 10 phút, lọc nóng qua bông. Cho 5ml dịch lọc vào một ống nghiệm lớn, thêm 5ml nước lắc mạnh trong 5phút, cột bọt tồn tại trong khoảng 6 phút. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có saponin.
Alcaloid
Cân 10g bột lá xoài cho vào bình nón 100ml, thêm 30ml H2SO4 1N, đun sôi 20 phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn dung tích 100ml, kiềm hóa bằng NH4OH6N đến pH kiềm, thử bằng giấy quì. Chiết bằng 5ml CHCl3 x 3
lần, gạn lấy lớp CHCl3. Sau đó chiết tiếp với dung dịch 5ml H2SO4 x 2 lần. Dich chiết thu được chia đều vào 3 ống nghiệm nhỏ. Nhỏ vào từng ống nghiệm lần lượt 3 giọt các thuốc thử sau:
Ống 1: TT Mayer. Qan sát không thấy tủa trắng. (Phản ứng âm tính). Ống 2: TT Bouchardart. Quan sát không thấy tủa nâu. (Phản ứng âm tính). Ống 3: TT Dragendoff. Quan sát không thấy tủa vàng. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn không có alcaloid. Anthranoid
Cân 5g dược liệu cho vào bình nón thêm 25ml H2SO4 1N, đun sôi trực tiếp 5 phút, lọc nóng qua bông vào bình gạn 50ml. Để nguội, thêm 5ml ethyl ether, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước, giữ lại lớp ether, cô về 1ml, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước không thấy xuất hiện màu đỏ sim. (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có athranoid. Tannin
Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột lá xoài, thêm 10ml nước cất, đun sôi trực tiếp trong 10phút. Lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được đem làm các phản ứng:
- Phản ứng với genlatin 1%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt gelatin 1%. Thấy xuất hiện tủa bông trắng. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với chì acetat 10%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt chì acetat thấy xuất hiện kết tủa bông vàng tươi. (Phản ứng dương tính).
- Phản ứng với FeCl3
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm 3 giọt FeCl3 thấy xuất hiện tủa đen. (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn có tannin.
Chất béo, carotenoid, sterol
Cân 10g bột lá xoài cho vào bình nón có nút mài dung tích 100ml, thêm 40ml ether dầu hỏa, đậy kín, ngâm trong 24h, lọc qua giấy lọc, dịch chiết thu được dùng làm phản ứng.
- Chất béo:
Nhỏ dịch chiết lên một mảnh giấy lọc, hơ đến khô, không thấy có vết mờ trên giấy. (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn không có chất béo. - Steroid-tritepenoid:
Cho vào một ống nghiệm nhỏ 5ml dịch chiết, cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml anhydride acetic, nghiêng ống nghiệm 45o nhỏ từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc, thấy xuất hiện vòng nâu tím. (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn có sterol-triterpenoid. - Carotenoid:
Cho vào một ống nghiệm nhỏ 3 giọt dịch chiết, cô cách thủy đến cắn, thêm khoảng 3 giọt H2SO4 đặc, lắc nhẹ, thấy xuất hiện màu xanh ve (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn có carotenoid.
Đường khử, acid amin, polysacharid
Cân 5g bột lá xoài cho vào bình nón, thêm 20ml nước. Đun sôi trực tiếp 10 phút, lọc nóng qua bông. Dịch lọc thu được đem tiến hành phản ứng xác định sự có mặt của đường khử, acid amin, polysacharid:
- Acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào ống nghiệm một ít tinh thể Na2CO3. Không thấy xuất hiện bọt khí (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có acid hữu cơ. - Đường khử
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vào ống nghiệm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy 10 phút thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn có đường khử.
- Polysacharid
Ống 1: cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol. Ống 2: 2ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol.
Ống 3: 2ml dịch chiết.
Màu của ống 1 đậm hơn màu của ống 2 nhưng không đậm hơn màu của ống 3 (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận trong lá xoài tròn không có polysacharid.
- Acid amin
Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm khoảng 5 giọt thuốc thử Nynhidrin 3%. Đun cách thủy 10 phút, không thấy xuất hiện màu xanh tím. (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận lá xoài tròn không có acid amin. Nhận xét :
Các kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy trong lá xoài tròn có các nhóm hợp chất: flavonoid, tanin, đường khử, steroid-triterpenoid, carotenoid.
Định tính bằng sắc kí lớp mỏng Chuẩn bị dịch chấm sắc kí
- Dung dịch thử (T): cân 0,5g bột lá xoài cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 10ml methanol, đun sôi trực tiếp trong 10 phút. Lọc nóng vào bình định
mức 10ml, bổ xung methanol cho đủ thể tích. Dung dịch thu được dùng để chấm sắc kí.
- Dung dịch chuẩn (C): Cân 2,5mg mangiferin chuẩn vào bình định mức10ml, hòa tan bằng methanol nóng, bổ sung đủ thể tích. Dung dịch thu được dùng làm dịch chấm sắc kí.
Điều kiện sắc kí:
- Bản mỏng silicagel GF 254 hoạt hóa ở 110 oC trong 30 phút. - Đưa lên bản mỏng 5µL dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
- Hệ dung môi khai triển: (1). CHCl3-EtOAc-HCOOH [4:8:1,5]. (2). EtOAc-HCOOH-H [10:1,5:1]. Bảng 3.2 và hình 3.9 trình bày kết quả SKLM khi triển khai bản SKLM với hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1].
Bảng 3.3. Các vết (Rf, màu sắc) trên sắc kí đồ của dịch chiết lá xoài tròn khai triển với hệ dung môi EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1].
STT Rf Quan sát bản sắc kí lớp mỏng Ánh sáng thường UV 254 UV 365 TT NH4OH 1 0,34 (-) (+) Nâu Nâu 2 0,41 Vàng nâu nhạt (+) Vàng Nâu đậm 3 0,58 (-) (+) Vàng nâu Nâu tím 4 0,63 (-) (+) Vàng tươi Nâu tím 5 0,77 (-) (+) Tím Vàng nâu 6 0,82 (-) (+) Tím Tím 7 0,89 Xanh (+) Đỏ Xanh 8 0,97 Xanh (+) Đỏ Xanh
Hình 3.6. Sắc kí đồ dịch chiết lá xoài khai triển hệ dung môi EtOAc- HCOOH-H2O [10:1,5:1].
Chú thích: (a): Ánh sáng thường, (b): UV 254, (c): UV 365, (d): Hơi NH4OH.
Nhận xét:
Trên sắc kí đồ dịch chiết lá xoài tròn khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH- H2O [10:1,5:1] nhận thấy có 8 vết trong đó có 1 vết có Rf và màu sắc tương đương với vết mangiferin chuẩn. Chứng tỏ trong lá xoài tròn có mangiferin.
3.2.1.2. Định lượng mangiferin bằng phương pháp HPLC
Như đã trình bày trong chương III, mục , sau khi tiến hành xây dựng đường chuẩn mangiferin, với dung môi pha mẫu là EtOH 96%-dung dịch HCl 2% (7:1), chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn và tiến hành định lượng với điều kiện sắc kí là cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động: Acetonitril- Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút; Bộ phận phát hiện: Detector UV- VIS. Bước sóng: 257nm. Thể tích tiêm mẫu 20µl.
Bảng 3.4. Diện tích pic (S) của dãy dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau
STT Dung dịch Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU)
1 1 4,0448 286,5
2 2 1,0112 66,6
3 3 0,5056 34,2
Phương trình tuyến tính: y = 0,0139 x+0,0538. Hệ số tương quan r2=
0,9998.
Trong đó: x: diện tích pic thu được (mAU), y: nồng độ dung dịch (C).
Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn mangiferin.
Sau khi chuẩn bị 3 mẫu dung dịch M1, M2, M3 là các mẫu dịch chiết lá xoài già với dung môi ethanol ở 3 nồng độ 90o,70o, 50o theo qui trình chiết xuất đã được mô tả trong phần phương pháp mục 2.4.2. Các mẫu thu được tiến hành phân tích HPLC trong cùng điều kiện khi xây dựng đường chuẩn.
Từ diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính ở trên ta tính được nồng độ và hàm lượng mangiferin :
Bảng 3.5. Kết quả định lượng mangiferin trong lá xoài tròn khi chiết bằng dung môi EtOH ở các nồng độ 90o, 70o và 50o.
STT Mẫu lá Khối lượng Dược liệu m (g) S1 (mAU1) S2 (mAU 2) Nồng độ TB C (µg/ml) Hàm lượng mangiferin 1 M1 1,0120 62,8 61,7 0,9216 5,32% 2 M2 1,0117 80,6 81,6 1,1845 6,47% 3 M3 1,0116 78,4 80,2 1,1594 6,33% Nhận xét:
Từ bảng số liệu nhận thấy mẫu M2 có nồng độ mangiferin cao nhất, mẫu M1 có nồng độ mangifrein thấp nhất, chứng tỏ dung môi ethanol 70o là dung môi chiết tốt nhất trong các nồng độ ethanol đã khảo sát.
Tiếp theo, để khảo sát tiếp hàm lượng mangiferin trong các mẫu lá xoài, tiến hành tiếp bước sau:
Chuẩn bị 2 dung dịch M4 và M5 theo thứ tự là các mẫu dịch chiết lá xoài bánh tẻ và lá xoài non với dung môi EtOH 70o theo qui trình chiết xuất đã được mô tả trong phần phương pháp mục 2.4.2. Các mẫu thu được đem phân tích bằng HPLC ở cùng điều kiện. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.6. Kết quả định lượng mangiferin trong các mẫu M4, M5.
ST T Mẫu lá Độ ẩm (%) Khối lượng dược liệu m (g) S1 (mAU1) S2 (mAU2) Nồng độ mangiferin C (µg/ml) Hàm lượng mangife rin (%) 2 M4 8,95 1,0125 94,5 94,1 1,3686 7,39% 3 M5 10,51 1,0127 93,2 93,2 1,3532 6,78% Nhận xét:
Tất cả các mẫu lá xoài đều có hàm lượng mangiferin khá cao (6-7%). Trong đó hàm lượnng mangiferin trong lá bánh tẻ cao nhất (7,39%), tiếp đến là non (6,78%), lá già có hàm lượng mangiferin thấp nhất (6,47%).
Hình 3.8. Hình ảnh sắc kí đồ của dịch chiết dược liệu bằng dung môi EtOH ở ba nồng độ 50o,70o, 90o, khai triển hệ dung môi EtOAc-HCOOH-
H2O [10:1,5:1].
Chú thích: (a): Ánh sáng thường, (b): UV 254, (c): UV 365, (d): Hơi NH4OH.
Kết quả cho thấy khi quan sát sắc kí đồ ở các điều kiện khác nhau, vết chất mangiferin từ dung môi EtOH 70o to nhất, đậm nhất, so với 2 dịch chiết EtOH 50 o và 90 o. Như vậy, chiết xuất mangiferin với ethanol nồng độ 70o
cho hàm lượng cao nhất.
3.2.1.3. Chiết xuất, tinh chế mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu
Chiết xuất, tinh chế:
Kết quả định lượng mangiferin trong lá xoài tròn cho thấy hàm lượng mangiferin ở lá bánh tẻ là cao nhất so với là già và lá non. Để tránh ảnh hưởng đến quá trình phát triển cũng như năng suất cho quả của cây xoài, đồng thời tận dụng nguồn nguyên liệu phế thải từ nông nghiệp, chúng tôi sử dụng lá xoài già để nghiên cứu chiết xuất và phân lập mangiferin.
Qui trình chiết xuất: Cân 100g lá xoài già đã sấy khô, nghiền nhỏ (độ ẩm 9,87%) cho vào bình chiết hồi lưu với 500ml ethanol 70o, trong 2h. Lọc nóng giữ lại bã thu được dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 300ml ethanol 70oC, chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiếp tục làm như vậy với lần thứ 3, thu dịch chiết lần 3. Gộp dịch chiết, cô đặc về 500ml, để ở nhiệt độ phòng qua đêm cho mangiferin tủa xuống. Lọc lấy tủa thô, thu được 2,4979g tủa thô.
Tinh chế: Rửa tủa nhiều lần bằng n-hexan đến khi dịch n-hexan không màu. Cắn thu được để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ thường sau đó phân tán vào 50ml ethanol 50o, lắc với 100ml chloroform x 4 lần, gan bỏ lớp chloroform. Pha ethanol-nước đem cô cách thủy ở 80oC đến cắn, thu được 1,6836g cắn. Hòa tan cắn vào một lượng tối thiểu ethanol 70o, lọc qua giấy lọc, để lạnh qua đêm ở 4-8oC để mangiferin kết tinh lại, lọc lấy tinh thể, rửa bằng cồn lạnh. Kết tinh lại 2 lần sẽ thu được 0,9327g chất tinh khiết gọi là M.
Hiệu suất của toàn bộ quá trình đạt 15,99%.
Kiểm tra độ tinh khiết và sơ bộ nhận dạng M bằng sắc kí lớp mỏng
Chất M được hòa tan trong methanol tuyệt đối, chúng tôi tiến hành chấm SKLM so sánh với dung dịch mangiferin chuẩn 0,25mg/ml trong methanol.
Với điều kiện sắc kí:
Bản mỏng GF 254 đã hoạt hóa ở 100oC trong 1h. Hệ dung môi: (1). Et2O-HCOOH-H2O [2:0,1:0,05] (2). EtOAc-HCOOH-H2O [2:0,3:0,2] (3). BuOH- HCOOH- H2O [2:0,2:0,1]
Thuốc thử hiện màu: hơi NH4OH.
Khi quan sát dưới ánh sáng UV 254, UV 365 và sau khi hiện màu bằng hơi NH4OH đều thấy trên sắc kí đồ của chất M chỉ có 1 vết với vị trí và màu sắc tương đương với vị trí và màu sắc vết của mangiferin chuẩn. Có thể sơ bộ kết luận chất M tinh khiết.
Bảng 3.7. Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc kí đồ của chất M và
mangiferin chuẩn ở các điều kiện khác nhau
Hệ DM Rf Ánh sáng thường UV 254 UV 365 Hơi NH4OH
(1) 0,13 Không nhìn thấy vết (+) Vàng sáng Vàng nâu
(2) 0,48
(3) 0,59
(a) (b) (c) (d)
Hình 3.9. Hình ảnh sắc kí đồ chất M so sánh với mangiferin chuẩn, khai triển hệ dung môi Et2 O- HCOOH-H2O [2:0,3:0,2].
Chú thích: (a): Ánh sáng thường, (b): UV 254, (c): UV 365, (d): Hơi NH4OH.
Nhận dạng chất M
Chất M có các đặc điểm sau: về cảm quan, có tinh thể hình kim, màu vàng nhạt.
Hình 3.10. Tinh thể chất M.
Về tính chất vật lí: tinh thể M tan được trong hỗn hợp cồn- nước, methanol-nước, tan nhẹ trong methanol, ethanol.
Tiến hành nhận dạng chất M bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Bảng sau cho biết phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất M và mangiferin:
Bảng 3.8. Phổ 1H, 13C-NMR của M và mangiferin. Vị trí carbon Phổ NMR của M (DMSO-d6) Phổ NMR của mangiferin (MeOD) δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) 1 161.7 13.74 (1-OH) 161.7 13.80 (1-OH) 2 107.6 -- 107.5 -- 3 163.8 -- 163.8 -- 4 93.3 6.37, s 93.3 6.40, s 4a 156.2 -- 156.2 -- 4b 101.3 -- 101.2 -- 5 102.6 6.86, s 102.4 6.88, s 6 150.8 -- 150.9 -- 7 143.7 -- 143.9 -- 8 108.0 7.38, s 107.8 7.41, s
