2.2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hóa học của lá xoài tròn Yên Châu
Định tính các nhóm chất hữu cơ: Định tính bằng phản ứng hóa học
Các phản ứng hóa học được tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3].
Tiến hành: Cân 0,5g dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 15ml cồn 90o đun trực tiếp 10 phút. Lọc nóng qua bông, dịch lọc thu được dùng để làm các phản ứng: - Phản ứng với NH4OH, - Phản ứng với NaOH 10%, - Phản ứng Cyanidyn, - Phản ứng với FeCl3 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng - Chuẩn bị dịch chấm sắc kí
Dung dịch thử (T): cân 0,5g bột lá xoài cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 10ml methanol, đun sôi trực tiếp trong 10 phút. Lọc nóng vào bình định mức 10ml, bổ xung methanol cho đủ thể tích. Dung dịch thu được dùng để chấm sắc kí.
Dung dịch chuẩn (C): Cân 2,5mg mangiferin chuẩn vào bình định mức10ml, hòa tan bằng methanol nóng, bổ sung đủ thể tích. Dung dịch thu được dùng làm dịch chấm sắc kí.
- Điều kiện sắc kí:
Bản mỏng silicagel GF 254 hoạt hóa ở 110 oC trong 30 phút. Dịch chấm sắc kí được chiết bằng dung môi MeOH
Đưa lên bản mỏng 5µL dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Hệ dung môi khai triển: (1). CHCl3-EtOAc-HCOOH [4:8:1,5]. (2). EtOAc-HCOOH-H2O [10:1,5:1].
- Phương pháp phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng thường, UV 254, UV 365, hiện màu bằng hơi ammoniac dưới ánh sáng thường [48].
Định lượng mangiferin bằng phương pháp HPLC Chuẩn bị mẫu:
Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch M1, M2, M3 là các mẫu dịch chiết lá xoài già với dung môi ethanol ở 3 nồng độ 90o,70o, 50o theo qui trình chiết xuất mô tả sau đây. Các mẫu thu được tiến hành phân tích HPLC trong cùng điều kiện khi xây dựng đường chuẩn.
Tính diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính ta tính được nồng độ và hàm lượng mangiferin
Tiến hành chiết xuất
Cân chính xác khoảng 1,00g bột lá xoài đã xác định độ ẩm cho vào bình chiết hồi lưu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiến hành tương tự chiết lần thứ 3. Gộp dịch chiết 3 lần vào bình định mức 100ml bổ sung bằng dung môi chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 1). Sau đó lấy 1ml dịch chiết cho vào bình định mức dung tích 50ml bổ sung bằng dung mối chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 2). Lấy 1ml dung dịch 2
cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm pha động đến vạch (dung dịch 3). Dung dịch 3 được phân tích bằng HPLC.
Điều kiện sắc kí: Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động: Acetonitril - Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút; Bộ phân phát hiện: Detector UV- VIS. Bước sóng: 257nm. Thể tích tiêm mẫu 20µl.
Phương pháp xử lí số liệu: Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Microsoft Ofice Excel 2007:
Dựng đường chuẩn mangiferin:
Chuẩn bị dung môi pha mẫu (DMPM): EtOH 96%-dung dịch HCl 2% (7:1). Cách pha 1000ml dung dịch HCl 2%: lấy 48ml dung dịch HCl đặc(36- 38%) cho vào bình chứa 500ml nước, lắc đều, thêm nước vừa đủ 100ml. Lắc kĩ.
Dung dịch HCl 2M:
Cách pha 1000ml dung dịch HCl 2M: Lấy 170ml dung dịch HCl đặc (36-38%) cho vào bình chứa 500ml nước, lắc đều. Thêm nước vừa đủ 1000ml. Lắc kĩ.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn:
Cân 25,28mg mangiferin chuẩn hòa tan nóng trong 30ml DMPM, cho vào bình định mức 50ml có nút mài, bổ sung đủ thể tích thu được dung dịch 1 có nồng độ 0,5056mg/ml. Lấy 1ml dung dịch 1 cho vào bình định mức dung tích 50ml, bổ xung DMPM cho đủ thể tích thu được dung dịch 2. Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào bình định mức 50ml, thêm DMPM cho đủ thể tích thu được dung dịch 3. Lấy 1ml dung dịch 3 thêm pha động đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45µm, thu được dung dịch 4 có nồng độ 4,0448µg/ml. Lấy 25ml dung dịch 4 pha loãng 4 lần bằng pha động trong bình định mức 100ml, lọc qua màng 0,45µm thu được dung dịch 5 có nồng độ 1,0112µg/ml. Lấy 25ml
dung dịch 5 pha loãng bằng pha động trong bình định mức 50ml thu được dung dịch 6 có nồng độ 0,5056µg/ml.
Dung dịch 4, 5, 6 được phân tích bằng HPLC để xây dựng đường chuẩn.
Tính hàm lượng mangiferin:
Nồng độ mangiferin (C) trong dịch chiết được tính theo đường chuẩn mangifeirn
Lượng Mangiferin /1ml dung dịch 1: mmangiferin= C . h2.h3 = 500.C
Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2
h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3. Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức:
6 .100.10 .100 .(1 ) Mangiferin Dl m m HA − −
M Dl: khối lượng dược liệu (g). HA: hàm ẩm của dược liệu
Từ diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính ở trên ta tính được nồng độ và hàm lượng mangiferin trong các mẫu.
Khảo sát hàm lượng mangiferin trong các mẫu lá xoài
Chuẩn bị 2 dung dịch M4 và M5 theo thứ tự là các mẫu dịch chiết lá xoài bánh tẻ và lá xoài non với dung môi EtOH 70o theo qui trình chiết xuất như mục trên. Các mẫu thu được đem phân tích bằng HPLC ở cùng điều kiện khi xây dựng đường chuẩn. Từ diện tích pic, sử dụng phương trình tuyến tính để tính được nồng độ và hàm lượng mangiferin (phụ lục, CĐ 6-tr.17-19)
Chiết xuất, phân lập mangiferin trong lá xoài tròn Yên Châu
Chiết xuất: Cân 100g lá xoài già đã sấy khô, nghiền nhỏ (độ ẩm 9,87%) cho vào bình chiết hồi lưu với 500ml ethanol 70o, trong 2h. Lọc nóng
giữ lại bã thu được dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 300ml ethanol 70oC, chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiếp tục làm như vậy với lần thứ 3, thu dịch chiết lần 3. Gộp dịch chiết, cô đặc về 500ml, để ở nhiệt độ phòng qua đêm cho mangiferin tủa xuống. Lọc lấy tủa thô, thu được 2,4979g tủa thô.
Phân lập: Rửa tủa nhiều lần bằng n-hexan đến khi dịch n-hexan không màu. Cắn thu được để bay hơi hết n-hexan ở nhiệt độ thường sau đó phân tán vào 50ml ethanol 50o, lắc với 100ml chloroform x 4 lần, gan bỏ lớp chloroform. Pha ethanol-nước đem cô cách thủy ở 80oC đến cắn, thu được 1,6836g cắn. Hòa tan cắn vào một lượng tối thiểu ethanol 70o, lọc qua giấy lọc, để lạnh qua đêm ở 4-8oC để mangiferin kết tinh lại, lọc lấy tinh thể, rửa bằng cồn lạnh. Kết tinh lại 2 lần sẽ thu được 0,9327g chất tinh khiết gọi là M.
Kiểm tra độ tinh khiết và sơ bộ nhận dạng M bằng sắc kí lớp mỏng:
Chất M được hòa tan trong methanol tuyệt đối chấm SKLM so sánh với dung dịch mangiferin chuẩn 0,25mg/ml trong methanol.
Điều kiện sắc kí:
Bản mỏng GF 254 đã hoạt hóa ở 100oC trong 1h.
Hệ dung môi: (1). Et2O-HCOOH-H2O [2:0,1:0,05] (2). EtOAc-HCOOH-H2O [2:0,3:0,2] (3). BuOH- HCOOH- H2O [2:0,2:0,1] Thuốc thử hiện màu: hơi NH4OH.
Nhận dạng chất M:
Cảm quan:
Tính chất vật lí: Tan được trong hỗn hợp cồn- nước, methanol-nước, tan nhẹ trong methanol, ethanol.
Nhận dạng bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR
Xác định các đặc điểm tiêu chuẩn cơ sở khác Xác định hàm ẩm
- Tiến hành: Khởi động máy đo hàm ẩm. Cho chính xác khoảng 5g bột lá xoài vào đĩa cân của máy xác định độ ẩm, đặt nhiệt độ là 1000C. Đậy nắp lại và đợi sau khi máy báo kết thúc thì đọc kết quả.
Xác định độ tro toàn phần
Tro là chất còn lại sau khi đốt cháy hoàn toàn dược liệu.
- Chuẩn bị: 5 chén sứ rửa sạch, sấy khô, cân bì; bột lá xoài tròn, cân 5 mẫu làm thực nghiệm.
- Tiến hành: Cân chính xác 2g bột lá xoài tròn cho vào chén ở trên. Đặt chén sứ vào thiết bị nung ở nhiệt độ 4500C trong 2 giờ. Để thiết bị hạ nhiệt độ rồi lấy ra cân. Nếu tro chưa loại được hết carbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hóa, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro. Rửa đũa thủy tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc. Cho giấy lọc và cắn vào chén nung rồi nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng. Cho dịch lọc vào cắn trong chén nung, đem bốc hơi đến khô rồi nung ở nhiệt độ 4500C đến khi khối lượng không đổi
Tính tỷ lệ % của tro toàn phần theo dược liệu đã làm khô trong không khí.
Xác định phần trăm tạp chất trong dược liệu (hỏi lại TS Quyên, có cần ko? Vì đây là bột?)
- Tiến hành: Cân bột lá xoài tròn, dàn mỏng lên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường, loại những phần không phải là dược liệu, cân phần tạp và tính phần trăm theo công thức:
X (%) =
m a
x 100
Trong đó:
X: Phần trăm tạp chất có trong dược liệu (%) a : Khối lượng tạp chất (g)
Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu của lá xoài tròn
Dựa trên các kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật, hóa học, khảo sát hàm lượng, chiết xuất, phân lập mangiferin trên, đưa ra đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của lá xoài tròn làm nguyên liệu, sao cho lượng glycosid hay mangiferin thu được cao nhất.
Nghiên cứu qui trình chiết xuất glycosid toàn phần dạng cao lỏng
Dựa trên kết quả khảo sát khả năng chiết xuất mangiferin của EtOH bằng sắc kí lớp mỏng và khảo sát hàm lượng mangiferin trong các mẫu lá xoài, từ đó xây dựng qui trình chiết xuất glycosid, sao cho lượng glycosid thu được cao nhất trong cùng một điều kiện (phụ lục, CĐ 9-Tr.16)
Nghiên cứu đặc điểm hóa học của glycosid toàn phần dạng cao lỏng
Định tính các chất hữu cơ trong cao lỏng 4:1 bằng sắc kí lớp mỏng
Các phản ứng hóa học được tiến hành theo nguyên tắc chiết xuất và định tính các hợp chất hữu cơ có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học (phụ lục, CĐ 8-tr. 23-27). Các mẫu thuốc thử theo định hướng định tính glycosid.
Định lượng mangifrin trong cao lỏng 4:1 bằng phương pháp HPLC Qui trình:
Cân chính xác 0,1 g cao lỏng lá xoài đã xác định độ ẩm cho vào bình chiết hồi lưu 2h với 20ml ethanol 90o, lọc nóng thu dịch chiết lần 1. Thêm tiếp 20ml EtOH 90o, tiếp tục chiết hồi lưu trong 2h, lọc nóng, thu dịch chiết lần 2. Tiến hành tương tự chiết lần thứ 3.
Gộp dịch chiết 3 lần vào bình định mức 100ml bổ sung bằng dung môi chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 1). Sau đó lấy 1ml dịch chiết cho vào bình định mức dung tích 50ml bổ sung bằng dung mối chiết xuất cho đủ thể tích (dung dịch 2).
Lấy 1ml dung dịch 2 cho vào bình định mức dung tích 10ml, thêm pha động đến vạch (dung dịch 3). Dung dịch 3 được phân tích bằng HPLC.
Điều kiện sắc kí:
Cột BDS Hypersil C18 (250x4,6mm; 5µm); Pha động: Acetonitril - Dung dịch CH3COOH 3% (14:86); Lưu lượng dòng 1,0ml/phút; Bộ phân phát hiện: Detector UV- VIS. Bước sóng: 257nm. Thể tích tiêm mẫu 20µl.
Phương pháp xử lí số liệu:
Số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm Microsoft Ofice Excel 2007: + Dựng đường chuẩn mangiferin.
+ Tính hàm lượng mangiferin:
Nồng độ mangiferin (C) trong dịch chiết được tính theo đường chuẩn mangiferin.
Lượng Mangiferin/1ml dung dịch 1: mmangiferin= C. h2.h3 = 500.C
Với: h2: độ pha loãng từ dung dịch 1 thành dung dịch 2
h3: độ pha loãng từ dung dịch 2 thành dung dịch 3. Hàm lượng Mangiferin được tính theo công thức:
6 .100.10 .100 .(1 ) Mangiferin Dl m m HA −
− M Dl: khối lượng dược liệu (g).
HA: hàm ẩm của dược liệu.
Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của glycosid toàn phần dạng cao lỏng (cao lỏng LXT Yên Châu 4:1).
Đề xuất TCCS của cao lỏng LXT Yên Châu 4:1 dựa trên kết quả nghiên cứu đặc điểm hóa học, hàm lượng mangiferin của cao lỏng lá xoài.
2.2.2.2. Nghiên cứu tác dụng sinh học của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1
Nghiên cứu tính an toàn của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1
Nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và theo hướng dẫn của WHO [5].
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn Thiết kế:
Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con nhốt riêng một chuồng. Lô chứng: uống nước cất 3ml/kg/ngày
Lô trị 1: uống cao lỏng 4:1 liều 1,8g dược liệu/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương trên người, tính theo hệ số 3)
Lô trị 2: uống cao lỏng 4:1 liều 9g dược liệu/kg/ngày (gấp 5 lần lô trị 1) Thỏ được uống nước hoặc thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng.
Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:
Tình trạng chung, thể trọng của thỏ.
Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu.
Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, protein và cholesterol.
Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh. Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 2 tuần uống thuốc, sau 4 tuần uống thuốc.
Mô bệnh học:
Sau 4 tuần uống thuốc, thỏ được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan.
Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số thỏ ở mỗi lô. Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm Giải phẫu bệnh (do PGS.TS. Lê Đình Roanh đọc kết quả vi thể).
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student.
Số liệu được biểu diễn dưới dạng : X ± SD
Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
2.2.2.3. Tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng lá xoài tròn Yên Châu 4:1 Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm trong phòng thí nghiệm.
Kỹ thuật tiến hành:
Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thử:
- Dùng que cấy lấy 1 lượng dung dịch cần thử cấy lên môi trường thạch máu, uri select. Ủ ở 370 C/18-24h.
- Định danh vi khuẩn, nấm nếu mọc. Chỉ thực hiện các bước tiếp theo nếu không mọc trong số những chủng thử nghiệm.
Xác định hoạt tính kháng khuẩn:
- Dùng pipet hút 1 ml dung dịch thử nghiệm vào ống tube vô trùng. - Pha loãng bậc 2 các dung dịch thử nghiệm vào các ống tube (1, 2, 4, 8, 16…) bằng nước muối sinh lý vô trùng, đánh dấu từng ống tube với mỗi độ pha loãng.
- 1 ống chứng là ống chỉ có nước muối sinh lý. - Chuẩn bị huyền dịch:
Đối với vi khuẩn:
Chủng vi khuẩn cần thử được nuôi cấy thuần, qua đêm.
Dùng que cấy lấy 3-5 khuẩn lạc hòa tan vào ống tube đựng nước muối sinh lý vô trùng 9 %, điều chỉnh để đạt huyền dịch có nồng độ 0,5 Mac Farland (tương đương 108 CFU/1ml).
Trong vòng 15 phút sau, tiếp tục pha loãng huyền dịch trên bằng canh thang Muller-Hinton vô trùng (MHB) (đối với vi khuẩn dễ mọc) hoặc canh thang Muller-Hinton có 2,5 -5 % máu cừu (đối với S. pneumoniae và S.
agalactiae), để đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml (pha loãng 1:100 để đạt nồng độ 106 CFU/1ml, sau đó tiếp tục pha loãng 1:2 để đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml)
Đối với nấm men:
Chủng nấm cần thử được nuôi cấy thuần, 24h.
Dùng que cấy lấy 5 khuẩn lạc đường kính khoảng 1mm hòa tan vào ống tube đựng nước muối dinh lý vô trùng 9 %, điều chỉnh để đạt huyền dịch có nồng độ 0,5 Mac Farland (tương đương 1-5 x 106 tế bào/1ml).
Huyền dịch được pha loãng tiếp 1:100 sau đó 1:2 bằng canh thang RPMI 1640 để đạt nồng độ 5 x 103 - 2,5 x 104 tế bào/ 1ml.
Dùng pipet hút 1ml huyền dịch sau khi pha loãng ở bước cuối cùng cho vào ống chứng, tiếp đến là từng ống tube chứa dung dịch thử nghiệm đã pha loãng từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. Như vậy, mỗi ống sẽ chứa 2 ml, nồng